壳聚糖酶高产菌的筛选、鉴定与发酵产酶初探

壳聚糖酶(EC3.2.1.132)能催化壳聚糖分子中β1,4糖苷键的水解,以获得具有特殊生理活性的壳聚寡糖(聚氨基葡萄糖,聚合度2-10)。该酶在细菌、真菌等多种微生物中存在。采用透明圈法,以壳聚糖为唯一碳源,从11份虾蟹壳堆积的土壤中分离出51株能降解壳聚糖的菌株。经平板初筛、摇瓶发酵复筛以及产酶动力学研究,确定H₂为产壳聚酶活力高、发酵时间短的优良菌株。根据其形态及培养特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析,鉴定该菌株为浅玫瑰色链霉菌,并命名为(Streptomyces roseolus DH)。进一步的基本发酵条件研究显示：该菌株发酵最适温度为30 ℃,发酵液初始pH为7.2,最适碳源为1%胶体壳聚糖,最适氮源为0.5%蛋白胨。此条件下经60 h发酵,发酵液中壳聚糖酶活力可达(6.10±0.12) U/mL。此菌株产酶量高,发酵周期短,具有良好的应用潜力。     

壳聚糖酶高产菌的筛选、鉴定与发酵产酶初探

壳聚糖酶(EC3.2.1.132)能催化壳聚糖分子中β-1,4-糖苷键的水解,以获得具有特殊生理活性的壳聚寡糖(聚氨基葡萄糖,聚合度2-10)。该酶在细菌、真菌等多种微生物中存在。采用透明圈法,以壳聚糖为唯一碳源,从11份虾蟹壳堆积的土壤中分离出51株能降解壳聚糖的菌株。经平板初筛、摇瓶发酵复筛以及产酶动力学研究,确定H2为产壳聚酶活力高、发酵时间短的优良菌株。根据其形态及培养特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析,鉴定该菌株为浅玫瑰色链霉菌,并命名为(Streptomyces roseolus DH)。进一步的基本发酵条件研究显示:该菌株发酵最适温度为30℃,发酵液初始pH为7.2,最适碳源为1%胶体壳聚糖,最适氮源为0.5%蛋白胨。此条件下经60 h发酵,发酵液中壳聚糖酶活力可达(6.10±0.12)U/mL。此菌株产酶量高,发酵周期短,具有良好的应用潜力。     

壳聚糖酶产生菌Mitsuaria sp.141-2的产酶发酵工艺

对产壳聚糖酶突变株Mitsuaria sp.141-2进行了研究,结果表明,该菌株所产的壳聚糖酶为诱导酶.最适作用pH值4.0,最适作用温度37～42℃.通过单因素试验和正交试验,得到优化的产酶条件:壳聚糖0.50%、装液量100 mL·500 mL-1三角瓶、起始pH值7.0、接种量2%、温度30℃、培养时间48 h.在此条件下,酶活力可达3.631 U·mL-1.     

链霉菌JD211发酵条件优化

以戊二酰亚胺类抗生素菌株链霉菌(Streptomyces)JD211为研究对象,研究其发酵培养基和发酵条件,得出最佳培养基组成是甘油30 g/L、酵母膏10 g/L、硫酸铵5 g/L、Na Cl 5 g/L、Ca CO33.5 g/L。优化后的发酵条件为装液量50 m L/250 m L,初始p H 7.0,接种量7.5%,培养温度30℃,培养时间为144 h。培养基优化后菌丝体干重较优化前提高了166.61%,抑菌圈提高了30.77%。     

烟色曲霉发酵产壳聚糖酶条件的研究

以壳聚糖为惟一碳源从采集的土样中分离得到一株产壳聚糖酶的菌株,经初步鉴定为烟色曲霉。对测定壳聚糖酶活力的DNS法以及该菌株发酵产酶条件进行了初步研究。结果表明,DNS法的最大吸收波长在490 nm左右,试验菌株的最适产酶发酵条件为分别以1.00%壳聚糖和1.00%牛肉膏为碳源和氮源,250 mL三角瓶装液量为75 mL,起始pH值是5.8,接种量1.5%(V/V),38℃,210 r/min培养77 h。在最适产酶条件下,该菌株发酵液中壳聚糖酶活力可达到7.25 U/mL。     

链霉菌XW5的发酵条件研究

对链霉菌XW5的液体发酵条件进行了单因素研究,通过正交试验设计对该菌株的培养基进行了筛选,同时对发酵代谢进行调节控制。结果表明,该菌株产素的最适发酵条件为:2%淀粉,1.5%黄豆饼粉,0.05%K2HPO40.05%MgSO40.4%CaCO3。NH42SO4对发酵液的效价有较明显的促进作用。     

链霉菌9911发酵条件的研究

对链霉菌9911的发酵条件进行了研究。通过发酵条件的优化,最后确定较适培养条件为:2%接种量,20%装液量,培养144h;培养基较优组合为:A1B2C3D1,即葡萄糖为1.5%,豆饼粉为3.0%,碳酸钙为0.6%,pH值为6.0。在该条件下,链霉菌对病原菌抑菌圈直径可达32 mm,较优化前提高了23%。     

链霉菌F01菌株对TMV的抗性及其发酵条件优化

【目的】从源自秦岭的土壤微生物中筛选具有抗病毒活性的生防菌并进行分类鉴定,对其抗烟草花叶病毒(TMV)的作用方式进行研究并对发酵条件进行优化,为防治烟草花叶病毒病提供新资源。【方法】采用土壤分离法分离生防菌,采用形态学和分子生物学方法对其进行分类鉴定。采用无菌过滤法制备F01菌株发酵液,以心叶烟为材料,采用半叶枯斑法测定生防菌F01菌株抗TMV的作用方式,并采用单因素法优化F01菌株的发酵体系。【结果】从秦岭土壤中分离到1株生防放线菌株F01,经形态学和分子生物学鉴定为链霉菌。F01菌株发酵液对烟草花叶病毒具有良好的防治效果,其抗病作用方式包括体外病毒钝化和体内诱导抗病性,对TMV的抑制率为74.2%。优化后的发酵体系为：以高氏1号为培养基,以小米粉和酪蛋白胨为碳、氮源,在28℃、pH 8.0条件下培养5 d,发酵液对TMV有显著的抑制效果,抑制率为81.7%。【结论】分离得到的链霉菌F01菌株具有良好的抗TMV活性,优化后的发酵条件简单,发酵产物对TMV有显著抑制效果,具有进一步开发为抗TMV工程菌株的潜力。     

产壳聚糖酶土壤微生物的筛选鉴定及发酵条件优化

对浙江舟山虾蟹养殖场附近的土壤进行针对性地采样,通过壳聚糖平板初筛、摇瓶复筛获得一株具有产壳聚糖酶活性的菌株,编号为ZJOU-AC1。通过形态观察、ITS全序列分析及系统发育进化树的构建,确定ZJOU-AC1为鹿皮色曲霉(Aspergillus cervinus)。对其产酶条件进行初步优化,经优化后的培养基成分为胶体壳聚糖1.5%,(NH_4)_2SO_4 0.4%,KH_2PO_4 0.2%,MgSO_4·7H_2O 0.05%。最适发酵周期为96 h。ZJOU-AC1产酶活力由2.05 U/m L提高到4.85 U/m L,与优化前相比提高了2.36倍。     

拮抗淡紫灰链霉菌xjy的发酵条件优化

采用单因素和正交试验相结合,对笔者分离保存的生防放线菌淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendu-lae)xjy菌株的液体发酵培养基和培养条件进行了优化。单因子试验结果表明,碳源葡萄糖、麸皮和空白处理三者之间无显著差异;氮源为豆粕、鱼粉和黄豆粉时发酵效价明显高于空白处理和其他氮源;添加0.04%的磷酸氢二钾和0.01%的硫酸亚铁可促进发酵液活性物质的产生。正交试验得出较适合于工业生产的摇瓶培养基配方为:麸皮2%、豆粕1%、氯化钠1.5%、碳酸钙0.6%、硫酸铵1%、磷酸氢二钾0.04%、硫酸亚铁0.001%。优化后的发酵液效价提高了36%。较为适宜的发酵非营养条件为:最适温度为20~35℃、摇床转速为150 r/min、初始pH值为5.5~8.0、装料量为50 mL/250 mL。这些结果为该菌株今后的应用、抗生素的分离提纯和产业化提供了依据。     

溜曲霉M3b产壳聚糖酶的固体发酵工艺优化及酶学性质

为挖掘专一性壳聚糖酶,从多地土壤中筛选出1株高壳聚糖酶活力的真菌M3b,对其进行了形态学观察和18S rDNA序列鉴定,采用单因素试验和正交试验优化固体发酵工艺,研究纯酶的酶学性质。结果显示,菌株M3b为溜曲霉,其最佳产酶发酵条件为：以水为100%计,1%胶体壳聚糖+1%葡萄糖、0.5%硫酸铵、麸皮∶豆粕=6∶10、接种量为10 %、发酵6 d、初始发酵pH 7.0、发酵温度32 ℃。在此条件下酶活力达到20.56 U/mL,是初始发酵条件的221.3%。SDS-PAGE和酶谱分析发现该菌株只产1种壳聚糖酶,分子质量为40 ku。该酶的酶促反应最适pH值为5.5,最适温度为60 ℃,水解产物聚合度≥2。结果表明,采用溜曲霉进行固体发酵可以显著提高壳聚糖酶的酶活力,降低生产成本,纯化后的壳聚糖酶AtChito40酶学性质稳定,耐酸碱,且能有效地降解壳聚糖。     

壳聚糖诱导下浅玫瑰色链霉菌菌体蛋白差异表达分析

建立了有效分析浅玫瑰色链霉菌菌体全蛋白质的方法,使用分离范围为p H 4~7的IPG胶条、2D clean-up试剂盒法纯化方法、80μg蛋白质上样量和银染的双向电泳技术,获得了低背景、高分辨率和重复率、无明显条纹的浅玫瑰色链霉菌全蛋白质双向电泳图谱。通过Image Master2D Platinum7.0软件对壳聚糖诱导条件下浅玫瑰色链霉菌菌体总蛋白质的电泳图谱进行匹配分析,在诱导菌株图谱上有723±14个清晰可见的蛋白质点可供差异分析。与未诱导菌株的双向电泳图谱对比结果显示:18个蛋白质点在诱导菌株中差异表达,其中14个蛋白质点的表达量上调,4个蛋白质点的表达量下调,选取10个差异表达量在5倍以上的蛋白质点进行质谱鉴定,结果显示,延长因子Tu、RNA聚合酶、分子伴侣等蛋白在壳聚糖诱导下表达量增加,表明它们在浅玫瑰色链霉菌代谢壳聚糖的过程中起重要作用。     

表面活性剂对加利利链霉菌AF1发酵的影响

【目的】研究表面活性剂对加利利链霉菌Streptomyces galilaeus AF1菌株发酵的影响。【方法】利用单因素试验优化表面活性剂的添加种类、初步浓度及最佳添加时间,采用Box-Behnken试验和响应面分析对表面活性剂添加质量浓度进行组合优化。流式细胞仪测定细胞荧光强度,确定表面活性剂对AF1菌株细胞膜的影响。【结果】表面活性剂的最优添加质量浓度:吐温–80为8.95 g·L~(–1)、曲拉通X–100为2.09 g·L~(–1)、山梨醇为3.89 g·L~(–1),最优添加时间为接种后5 d;细胞膜透性测定结果表明,试验组的AF1菌株细胞荧光强度极显著高于对照组。【结论】试验得到的响应面模型对因变量的解释程度达94.89%,具有实际意义;添加最优表面活性剂组合后,加利利链霉菌AF1的细胞膜通透性极显著增大,间接导致胞内活性物质的外排量增加,提高了抗菌活性物质的生物合成量。     

鲍鱼希瓦氏菌发酵条件的优化

鲍鱼希瓦氏菌有望用于对虾养殖和海水石油污染的治理。为探索鲍鱼希瓦氏菌的最优培养基和培养条件,运用单因素实验和正交实验对发酵条件进行优化,并在70 L发酵罐上进行扩大培养。最优培养基为蔗糖6%,蛋白胨2.5%,碳酸钙0.7%,初始p H 6.8。最优摇瓶培养条件为温度30℃,转速130 r/min,装液量100 m L/500 m L,接种量6%,收获时间24 h。70 L发酵罐生物量达到1.14×1011cfu/m L。鲍鱼希瓦氏菌发酵条件的优化为其工业生产提供了实验数据支持。     

Bacillus velezensis 157混合固态发酵生产多种木质纤维素酶的发酵条件优化

为论证单一固态Bacillus velezensis 157发酵豆粕中混合碱处理玉米秸秆能否有利于提高内切葡聚糖酶、淀粉酶、木聚糖酶和果胶酶的产酶量,利用DNS法对碱处理玉米秸秆与豆粕混合添加质量比进行优化后,采用单因素法分别对单一发酵豆粕、碱处理玉米秸秆以及混合发酵碱处理玉米秸秆-豆粕中底物与水分质量比、发酵温度以及发酵时间进行优化,并对发酵过程中B.velezensis 157的生长曲线进行测定。结果表明:经发酵条件优化后,以碱处理玉米秸秆和豆粕的质量比为1.0∶1.0,底物与水分质量比为1.0∶0.5;B.velezensis 157于37℃培养温度下发酵24 h后,混合发酵组的内切葡聚糖酶、淀粉酶、木聚糖酶、果胶酶以及菌落数,均高于单一发酵碱处理玉米秸秆组和豆粕组,酶活力分别可达56.83±1.47、1 949.28±14.41、16.52±0.79和14.53±0.56 U/g,相应酶活力与碱处理玉米秸秆组相比,分别提高了7.81、6.41、1.23和2.53倍;与豆粕组相比,分别提高了1.17、1.35、1.07和1.21倍;同时,混合发酵组中B.velezensis 157菌落数高于豆粕组和碱处理秸秆组。因此,B.velezensis 157混合固态发酵有利于提高B.velezensis 157内切葡聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶和果胶酶的酶产量,节约了时间和成本,为动物饲料酶制剂和生物饲料的开发提供依据。     

抗菌素430产生菌发酵条件研究

从云南元阳土壤中分离得到链霉菌菌株TJ430,其代谢产生的蒽环类抗生素具有广谱抗真菌、细菌活性。通过研究该菌株摇瓶发酵条件,明确其摇瓶发酵培养基配方为：葡萄糖1.8%、蛋白胨0.5%、豆粕0.3%、酵母膏0.1%、碳酸钙0.025%;最优发酵条件为：250 mL摇瓶装液量25 mL,接种量9.0%,培养温度28°C,初始pH 8.5,转速200 rpm,培养时间96 h。     

密旋链霉菌Act12遗传转化系统的建立与优化

密旋链霉菌(Streptomyces pactum)Act12是分离自黄土高原的1株多效放线菌,具有良好的生防应用价值,为了深入研究与利用,需建立该菌株的高效遗传转化系统。本试验以整合型质粒pSET152为出发质粒,大肠杆菌S17-1为供体,Act12的孢子为受体时,在改良2CMY培养基上进行接合转移,孢子预萌发条件为50℃热激10min,阿普霉素质量浓度为10.0mg/L,覆盖时间为18h,转化效率达到2.079×10~(-5)。以抗阿普霉素基因为目的基因,通过PCR验证,成功地将质粒pSET152转入到Act12中。同时,利用该转化系统,成功敲出Act12基因组中一可能的负调控转录因子spa0520,并获得了次级代谢图谱明显变化的缺失突变株Δspa0520。所构建的Act12遗传转化系统,为后续对其生防活性机理的研究以及深入开发利用奠定了基础。另外,通过培养基的改良发现,Act12在氮源含有NO-3时产孢丰富,为后续研究提供了思路。     

微生物发酵法生产纳豆工艺条件的优化研究

采用微生物发酵法生产纳豆,并对纳豆的生产工艺条件进行优化研究.将从纳豆中提取出的纳豆芽孢杆菌接到蒸煮大豆中,对影响纳豆品质的发酵温度、发酵时间和后熟时间等因素进行考察,通过单因素与正交试验,确定了最优工艺条件:发酵温度35℃、发酵时间24h、后熟时间为24h.此时,水分、蛋白质及粘多糖含量分别为61.8%,19.34%...