小麦穗发芽抗性分子标记的有效性检测与验证

小麦收获前穗发芽严重影响加工品质,来年种用价值以及产量.本研究利用万县白麦子/京411穗发芽重组自交系群体对已报道的第3染色体上有关穗发芽抗性分子标记XBarc321、XBarc310和XBarc57以及第4染色体上Xbarc170、Xgwm397和Xgwm269进行有效性检测,并在穗发芽抗性不同的40份地方品种以及推广品种中进一步验证,结果表明,小麦第3染色体上的分子标记XBarc321、XBarc310和XBarc57在穗发芽群体以及穗发芽抗性不同的品种中选择效应较大,尤其是XBarc321和XBarc310,证实该标记与穗发芽抗性紧密相关,而第4染色体上的分子标记在该群体中并没有显示与穗发芽相关.本研究结果为定位控制该群体中穗发芽抗性的QTL位点提供了重要信息.     

小麦穗发芽抗性相关Vp1基因启动子的分离及功能验证

成熟期穗发芽严重影响小麦产量和品质。Vp1是调节胚发育, 促进胚成熟和休眠的重要转录因子, 对小麦种子休眠和穗发芽抗性具有重要作用。本研究分离了普通小麦B基因组Vp1基因的启动子, 生物信息学预测结果表明, 其含有9个脱落酸响应元件ABRE、2个DREB和6个MYB干旱响应元件、3个赤霉素响应元件GARE、1个水杨酸响应元件TCA-E、2个茉莉酸甲酯响应元件TGACG-motif、4个SKn-1和1个RYREPE胚乳特异表达元件。采用5′端缺失的方法, 构建了系列含Vp1启动子不同区段融合GUS报告基因的瞬时表达载体和植物表达载体。通过基因枪转化小麦愈伤组织, 瞬时表达结果显示, Vp1启动子在无诱导的情况下不能启动GUS基因表达, 在低温、ABA、GA、PEG和NaCl诱导后可以启动GUS基因表达, 表现诱导表达特性, 且其诱导表达强度随启动子缺失片段长度变短而减弱。利用Gateway方法成功构建了6个启动子各缺失片段类型的植物表达载体, 并通过农杆菌介导转化四倍体小麦Stewart, 获得转基因植株。该启动子可有效启动GUS基因在转基因植株的花药、糊粉层、穗轴及根中表达, 其他组织中没有表达。当启动子片段大于660 bp时, 外源ABA可诱导启动子启动GUS基因在转基因植株茎节中的表达。     

小麦多酚氧化酶基因Ppo-A1和Ppo-D1位点等位变异与穗发芽抗性的关系

Ppo-A1和Ppo-D1是控制小麦多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)活性的关键基因。有报道PPO活性与穗发芽抗性有关,但Ppo-A1和Ppo-D1位点不同等位变异对穗发芽抗性的影响尚不明确。本研究利用248份我国主栽小麦品种3年发芽指数,结合Ppo-A1和Ppo-D1位点等位变异分型结果,研究两个位点不同等位变异及其等位变异组合与穗发芽抗性的关系。结果表明,发芽指数主要受年份、Ppo-A1位点和Ppo-A1×Ppo-D1互作共同影响。在Ppo-A1位点,携带低PPO活性等位变异Ppo-A1b的小麦品种发芽指数显著低于携带高PPO活性等位变异Ppo-A1a的品种,平均发芽指数相差5.22%;相反,在Ppo-D1位点携带低PPO活性等位变异Ppo-D1a品种的发芽指数高于携带高PPO活性等位变异Ppo-D1b的品种,但差异不显著。在4种等位变异组合中, Ppo-A1bPpo-D1b组合类型品种的发芽指数最低。上述Ppo-A1位点等位变异与穗发芽抗性的关系在轮选13×济麦20 F2及F2:3分离群体中得到验证。PPO活性和Ppo-A1相对表达量均与发芽指数呈显著正...     

CIMMYT普通小麦籽粒硬度等位变异的检测

籽粒硬度主要由5D染色体短臂的一对主效基因Ha控制,研究籽粒硬度等位变异有助于提高小麦的磨粉和食品加工品质。本试验对国际玉米小麦改良中心（CIMMYT）的138份历史品种和代表性高代品系的硬度基因型进行了研究。在用SDS-PAGE鉴定Pina-D1b/Pinb-D1a时,用10%甘油代替水配制分离胶,用PDA代替甲叉配制分离胶和浓缩胶,增强了PINA和PINB两种蛋白带型的分辨率。结果表明,与其他国家硬质麦中Pina-D1a/Pinb-D1b类型偏多的特点明显不同,CIMMYT硬质小麦中puroindoline a（PINA）蛋白缺失类型（或称Pina-D1b/Pinb-D1a）较多,为118个,占85.5%;Pina-D1a/Pinb-D1a（野生型）为11个,占8.0%;Pina-D1a/Pinb-D1b类型有9个,占6.5%。其中,PINA缺失对小麦籽粒硬度的影响最大,与其他2种基因型硬度值之间差异达5%显著水平。先前研究结果表明,PINA蛋白缺失类型的磨粉品质和面包烘烤品质均劣于Pina-D1a/Pinb-D1b类型,因此,建议CIMMYT多引进一些其他硬度变异类型的小麦种质,如Pina-D1a/Pinb-D1b类型等,以改善其硬度基因型过度单一的局面,从而减少PINA蛋白缺失带来的不利影响。同时,也提醒我国以其他用途如抗病、抗旱等为目的,引种CIMMYT小麦时,还应充分考虑PINA蛋白缺失对磨粉和加工品质的不利影响,以更合理引进和有效利用CIMMYT种质资源。     

一个新的玉米Vp15基因等位突变体的遗传分析与分子鉴定

在玉米繁种过程中发现一个玉米穗发芽突变体(viviparous), 命名为vp-like4。经过连续多代自交发现该突变体性状能稳定遗传, 并且表现为隐性单基因控制。以vp-like4与自交系Mo17杂交构建F₂遗传定位群体, 利用BSR-Seq方法, 将目的基因定位于玉米第5染色体173.8~175.6 Mb之间。通过基因组序列信息分析发现, 在此定位区间内存在一个已报道的Vp15基因。Vp15基因编码钼喋呤合酶小亚基, 参与类胡萝卜素裂解为ABA的过程。利用2个独立的vp15突变体vp15-umu1和vp15-DR1126的杂合体, 分别与vp-like4突变体杂合体做杂交进行等位测验, 发现杂交后代中正常籽粒与穗发芽籽粒比例符合3∶1分离比。基因组序列分析发现vp-like4突变体中Vp15基因在第2外显子末端及3°非翻译区有60个碱基的缺失, 与所报道的vp15突变体vp15-umu1、vp15-DR1126均在第2个外显子有Mutator转座子插入的突变方式不同。进一步通过RT-PCR检测发现, vp-like4突变体中Vp15基因的表达量显著降低。以上实验证据表明, vp-like4是一个新的Vp15基因等位突变体。     

小麦PEBP-like基因等位变异与籽粒大小、粒重关系研究

小麦PEBP-like基因与籽粒大小、粒重相关.本文根据水稻GS3基因序列搜索小麦及其近源种属EST序列,电子克隆小麦PEBP-like基因,并设计特异引物在万县百麦子/京411构建的重组自交系群体(recombinantinbredlines.RILs)鉴定该基因变异与籽粒大小及粒重的关系.结果表明,本文小麦籽粒大小与粒重相关性较好,其中粒宽和粒重的相关性最好(0.668**),其次是粒厚(0.629**),粒长也与粒重呈极显著正相关(0.485**).WKS3-8引物在亲本和群体中多态性较好,具有A型等位基因的家系,籽粒较小、粒重低,其大部分家系千粒重低于平均值(38.3 g);而具有B型等位基因的家系,籽粒较大,粒重高,其大部分家系粒重高于平均值.上述说明PEBP-like基因等位变异与小麦粒长、粒宽、粒厚及粒重关系密切.     

参与ABA调控小麦种子胚休眠的dehydrin基因的分离与表达分析

dehydrin蛋白是一个通过双向电泳分离出的参与ABA调控种子休眠过程的ABA反应蛋白。本研究利用二级质谱技术（Q-TOF2）获得了dehydrin蛋白的部分肽段序列,以此设计特异引物在万县白麦子中分离了其全长cDNA序列。与来自于durum小麦中的同源蛋白在DNA水平以及氨基酸水平进行序列比对,发现在3’与5’端以及编码区域都存在碱基变异。进一步从mRNA水平分析了dehydrin基因的表达变化与种子休眠性状的表达之间的关系,结果表明,该基因在转录水平上的表达特性与翻译水平一致,说明该基因早在转录水平就受ABA调控从而参与休眠性状的表达。     

植物源小麦籽粒发芽抑制物质筛选

以5种植物为材料提取穗发芽抑制物质对小麦籽粒发芽抑制效应进行了筛选.结果表明,提取物中均含有发芽抑制物质,其中M 3是对小麦籽粒发芽抑制效果显著、作用迅速而持久的天然抑制物质,对种子发芽抑制率达到85%以上,且抑制效果不存在与小麦品种间的互作.     

以关联分析发掘小麦整穗发芽抗性基因分子标记

利用分布于小麦全基因组的181对分子标记,分析264份自然群体的基因型,采用TASSLE软件的GLM和MLM模型检测与整穗发芽抗性紧密关联的标记位点,发掘相关位点内的优异等位变异。在2012年和2013年室内整穗发芽率、2013年田间自然降雨整穗发芽率3个环境中,共关联到20个显著位点(P<0.05),分布于小麦染色体1AS、2DS、3AS、3BL、4AL、5AS、5BL、6BS、6DS、7AL和7BL上。分别位于2DS和7BL上的分子标记gwm102和barc340同时在3个环境下关联到,属于稳定的抗性位点; 另有6个标记位点同时在2个环境下关联到; 其余12个标记位点仅在1个环境下关联到。位于7BL上的barc340标记位点为一新报道位点。从重复关联的8个标记位点内共检测出10种优异等位变异。barc28-229bp和barc28-217bp对提高整穗发芽抗性效应最显著,主要分布在地方品种中(如遂宁坨坨麦等),而gwm102-142bp和barc186-199bp效应虽然相对较小,但多分布在推广品种中(如扬麦158等),有利于穗发芽抗性分子育种的直接应用。     

穗发芽抗性STS标记Vp1B3在中国小麦微核心种质中的检测

小麦在临近收获前发生穗发芽,不仅劣化小麦加工品质,而且降低小麦产量。提高小麦穗发芽抗性水平是小麦育种工作的重要目标之一。本实验以258份中国小麦微核心种质为试材,利用已报道的小麦穗发芽抗性标记Vp1B3对其进行多态性检测,以了解该抗性标记在中国小麦微核心种质中的分布规律,寻找新的等位变异类型,并结合部分品种的发芽指数,分析不同等位变异类型与穗发芽抗性之间的关系。结果表明：检测的258份供试材料中,a带型（13．9％）、c带型（41．1％）和e带型（34．5％）等3种带型为主要扩增带型,占总变异类型的89．5％;b、d、f带型为本研究所发现的新的等位变异类型,占总变异类型的2．4％。此外,杂合带型以及无扩增产物的分别占总变异类型的3．5％和4．6％。对选取的部分穗发芽抗性不同的材料进行统计分析,结果显示,c带型品种的发芽指数（GI,47．9％）明显高于a带型（GI,22．6％）和e带型（GI,24.3％）的品种,但c带型的品种中也存在GI值较低的高抗穗发芽品种,而a带型和e带型的品种中同时也出现了GI值较高的感穗发芽品种,说明小麦穗发芽的遗传机制比较复杂,其抗性不仅仅受Vp1B3基因控制,而是多种因素共同作用的结果。     

郑麦9023春化基因VRN-1的组成及表达

以郑麦9023叶片为材料,利用序列特异性PCR扩增技术克隆了春化基因VRN-1,并通过0~2℃冰箱模拟春化处理0、10、20和30 d,对该基因在一叶期至九叶期叶片中的表达进行了分析。PCR分析表明,VRN-1基因在郑麦9023的A和D基因组中均为隐性,在B基因组中为显性,基因等位类型为vrnA1VrnB1vrnD1。在克隆VRN-A1、VRN-B1和VRN-D1基因序列的基础上,设计了3个等位基因的特异引物,并利用该特异引物进行半定量RT-PCR分析。结果显示,在未经春化处理的条件下,一叶期VRN-A1和VRN-D1均未检测到表达,而VRN-B1已有较低水平的表达;从三叶期开始,3个等位基因都有较高水平的表达,并一直持续至开花期。在春化处理10、20和30 d条件下,VRN-1的3个等位基因在一叶期就出现较高水平的表达,并保持至开花期。     

粒重基因TaCwi-A1等位变异在黄淮麦区小麦品种(系)中的分布及功能分析

为探讨小麦粒重基因TaCwi-A1等位变异TaCwi-A1a和TaCwi-A1b在育种实践中的应用价值,首先利用TaCwi-A1功能标记对539份黄淮麦区小麦品种(系)进行分子检测,确定各供试材料的等位变异类型,从而获得TaCwi-A1a和TaCwi-A1b 2种等位变异的分布频率。对审定品种、参加区试品系以及自育品系进行了千粒质量(3个不同生长环境)及粒长、粒宽和籽粒面积(1个生长环境)测试分析,比较TaCwi-A1a和TaCwi-A1b等位变异籽粒表型性状的差异性。结果表明,在539份黄淮麦区小麦资源中TaCwi-A1a的分布频率为65.03%,TaCwi-A1b的分布频率为34.97%,TaCwi-A1a的分布频率明显高于TaCwi-A1b。籽粒表型性状分析表明,无论是审定品种,还是参加区试品系和自育品系,在3个生长环境下,TaCwi-A1a基因型材料的千粒质量均值都显著高于TaCwi-A1b;TaCwi-A1a基因型材料的粒长和粒宽均显著高于TaCwi-A1b。进一步验证了TaCwi-A1a等位变异的籽粒表型性状增效功能,说明其对粒重及其构成要素是优异的等位变异。此外,本研究鉴定了黄淮麦区中TaCwi-A1等位变异的分布情况,为亲本选配提供了参考。     

53个小麦品种中1BL/1RS易位系的分子检测

为合理利用小麦种质资源,快速准确检测小麦品种中的1BL/1RS易位系,采用ω-secalin和Glu-B3两个特异性分子标记检测了1BL/1RS在53个小麦品种中的分布情况。正相关引物ω-secalin在TcLr26和大粒王等8个品种中检测到1076bp的特异性条带,在Thatcher及其它品种中未检测到特异性条带。负相关引物Glu-B3在TcLr26和大粒王等8个品种中未扩增到636bp条带,Thatcher和其它品种中能扩增出636bp条带。通过两个正负相关标记相互验证,获得一致的结果,表明大粒王、鲁夫16系、太空8号、太育28、温麦8号、冀麦30、北京837、牛朱特是1BL/1RS易位系。     

小麦新品系抗穗发芽特性研究

为了筛选抗穗发芽品系,利用Vp-1基因的STS标记Vp1B3检测了来自河南省新乡市的新麦系列小麦新品系112个,并于收获期进行了室内整穗发芽试验,结果表明,112个小麦品系中Vp-1Ba(感穗发芽)、Vp-1Bb(抗穗发芽)和Vp-1Bc(抗穗发芽)基因型的频率分别为60.71%,0.89%和38.39%,以Vp-1Ba基因型为主。Vp-1Ba基因型品系穗发芽率(24.42%)极显著高于Vp-1Bc基因型品系(16.55%)。同一亲本组合选育出的品系的穗发芽率有很大差异,但Vp-1基因类型基本一致。同一Vp-1类型品系间的穗发芽率有很大差异,故在使用Vp1B3标记时需要与整穗发芽法结合使用。     

郑麦9023春化基因VRN-1的组成及表达

以郑麦9023叶片为材料,利用序列特异性PCR扩增技术克隆了春化基因VRN-1,并通过0~2℃冰箱模拟春化处理0、10、20和30 d,对该基因在一叶期至九叶期叶片中的表达进行了分析。PCR分析表明,VRN-1基因在郑麦9023的A和D基因组中均为隐性,在B基因组中为显性,基因等位类型为vrnA1VrnB1vrnD1。在克隆VRN-A1、VRN-B1和VRN-D1基因序列的基础上,设计了3个等位基因的特异引物,并利用该特异引物进行半定量RT-PCR分析。结果显示,在未经春化处理的条件下,一叶期VRN-A1和VRN-D1均未检测到表达,而VRN-B1已有较低水平的表达;从三叶期开始,3个等位基因都有较高水平的表达,并一直持续至开花期。在春化处理10、20和30 d条件下,VRN-1的3个等位基因在一叶期就出现较高水平的表达,并保持至开花期。     

四个小麦抗穗发芽分子抗性标记有效性的验证与评价

成熟期穗发芽是一种世界性灾害, 严重影响小麦品质和产量。本试验利用已报道的4个与穗发芽抗性相关的标记, 即STS标记MST101、STMS标记wmc104、QTL位点Xgwm155与Vp1B3, 结合穗发芽率分析,对95份中国小麦地方品种和历史品种的穗发芽抗性进行筛选, 旨在从中筛选出抗穗发芽品种, 并对这4个分子标记的有效性进行比较, 筛选出可用于种质资源筛选和分子标记辅助育种的高效分子标记。结果表明, Vp1B3和Xgwm155与穗发芽抗性相关, 而MST101和wmc104与穗发芽抗性无关。比较而言, Vp1B3更能有效地用于筛选穗发芽抗性品种, 但将Vp1B3和Xgwm155结合起来筛选抗穗发芽小麦品种, 会提高选择效率。     

用STS标记检测春化基因Vrn-A1在中国小麦中的分布

在证实Vrn-A1春化基因的STS标记与CAPS标记结果一致的基础上,用STS标记检测了全国主要麦区历史上大面积推广和当前主栽的250份品种的春化基因Vrn-A1。结果表明,中国品种Vrn-A1基因平均分布频率为36.8%,不同麦区的分布频率不同,依次为东北春麦区=北部春麦区=西北春麦区（100%）＞新疆冬春麦区（42.9%）＞西南冬麦区（35.3%）＞黄淮冬麦区（19.8%）＞长江中下游冬麦区（17.4%）＞北部冬麦区（3.0%）,这与冬春特性有关。在长江中下游冬麦区和西南冬麦区品种中,Vrn-A1基因分布频率随着时间推移呈降低趋势;在黄淮冬麦区品种中,20世纪50到70年代呈上升趋势,随后呈下降趋势。在年最大推广面积大于66.7万hm²的58份品种中,Vrn-A1基因的频率为27.6%。这些信息有助于改良小麦品种的适应性和提高产量潜力。