印楝素A诱导Sf9细胞凋亡的显微和超微形态变化

利用倒置显微镜和透射电子显微镜技术观察印楝素A诱导草地贪夜蛾Spodoptera frugperda蛹卵巢Sf9细胞凋亡的显微和超微形态变化.结果表明:1.5μg.mL-1印楝素A对Sf9细胞具有显著的凋亡诱导作用,从凋亡小体和贴壁细胞数量变化判断,印楝素A处理12 h,细胞开始出现少量凋亡小体,12~24 h凋亡小体逐渐增多,但贴壁细胞未见明显减少,因此24 h之前(0~24 h)属于凋亡早期阶段;24~36 h凋亡小体大量出现,贴壁细胞逐渐减少,属于凋亡中期;处理36 h以上,凋亡小体和贴壁细胞急剧减少,细胞凋亡进入晚期.观察诱导24 h的细胞超微结构发现,胞内的主要细胞器在数量或形态上发生了显著变化,包括溶酶体数量显著增加,线粒体内部嵴变模糊,内质网从囊泡状变成线管状,细胞核出现分页、皱缩以及区域性膨大等.     

斑蝥素诱导草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）卵巢细胞系Sf9凋亡的临界条件

为进一步利用昆虫细胞研究斑蝥素对鳞翅目昆虫的毒杀机理,采用细胞形态学观察法和DNA凝胶电泳法研究斑蝥素诱导草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）卵巢细胞系Sf9细胞凋亡的临界条件。结果表明：供试细胞凋亡率与斑蝥素处理剂量、时间呈现密切相关性;在较低剂量处理下,可观察到细胞凋亡。当斑蝥素质量浓度达到6.25μg/mL,处理细胞3 h或3.125μg/mL处理细胞12 h时,斑蝥素处理Sf9导致细胞出现明显畸形、形成凋亡小体等凋亡症状。DNA Ladder条件要求严格,在冰浴条件下,当斑蝥素处理质量浓度达到6.25μg/mL处理细胞24 h时,或者12.5μg/mL处理细胞12 h时,可观察到明显的DNA梯度条带。     

FOXO基因对印楝素诱导sf9细胞凋亡的影响

【目的】探讨印楝素（azadirachtin, AZA）通过转录因子FOXO诱导草地贪夜蛾卵巢细胞sf9凋亡的分子机制。【方法】将体外培养的草地贪夜蛾卵巢细胞分为AZA处理组和未处理组,采用CCK-8法检测AZA 对sf9 细胞增殖的影响;透射电镜观察sf9细胞的超微结构变化;流式细胞术分选Annexin V-FITC/PI染色的凋亡细胞;Western blot 检测p-FOXO及凋亡相关蛋白的表达情况; RNAi FOXO后,检测FOXO基因表达量与Caspase-3的酶活性变化。【结果】CCK-8检测发现AZA可显著抑制sf9细胞增殖,并呈时间和浓度依赖性;通过透射电镜检测到5 mmol/L AZA可破坏sf9细胞的微观结构,导致细胞核收缩,染色质聚集,细胞质空泡状;流式细胞术分选Annexin V-FITC/PI染色的凋亡细胞,发现AZA诱导sf9细胞凋亡与时间呈正相关;进一步通过Western blot检测凋亡相关蛋白,发现AZA可诱导凋亡相关蛋白 Bim和 Cleaved Caspase-3的表达水平显著增加,而P-FOXO蛋白表达量降低,FOXO总蛋白表达无明显差异;利用qRT-PCR进一步检测发现,FOXO基因表达量与AZA处理时间呈正相关,在此基础上通过RNAi技术沉默FOXO后,经AZA处理发现Caspase-3的酶活性显著降低。【结论】AZA可通过上调FOXO基因抑制草地贪夜蛾卵巢细胞sf9的增殖并诱导其凋亡。     

斑蝥素对昆虫细胞Spex-Ⅶ和Sf9的作用效果

以昆虫细胞Spex-Ⅶ和Sf9为试材研究斑蝥素对昆虫的杀虫机理。采用MTT法,结果表明,斑蝥素对这两种细胞凋亡的增殖有剂量和时间依赖性抑制作用,且对Sf9作用更为敏感:处理2,3,4 d后,斑蝥素对Spex-Ⅶ细胞的抑制中浓度(IC50)分别为17.623 8,13.225 1,10.707 8μg/mL;对Sf9细胞的IC50为5.433 8,1.228 9,1.222 6μg/mL;采用瑞氏-吉姆萨细胞染色和Hoechst33258荧光细胞染色法,结果表明12.5μg/mL斑蝥素处理Sf9细胞,25μg/mL和50μg/mL斑蝥素处理Spex-Ⅶ细胞,2 d后,斑蝥素对两种细胞有诱导凋亡的作用。可以观察到凋亡形态特征:胞膜完整,染色质固缩,核碎裂,凋亡小体形成。     

印楝素对小菜蛾胚胎细胞增殖和凋亡的影响

【目的】探讨印楝素对小菜蛾Plutella xyllostella胚胎细胞增殖和凋亡的影响及可能的机制。【方法】将体外培养的小菜蛾胚胎细胞分为印楝素处理组和未处理组,采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖的抑制率,激光共聚焦镜检PI染色后的细胞死亡和DAPI染色后的凋亡小体,通过Western-blotting检测各组细胞Caspase-3的表达情况以及通路蛋白Akt的磷酸化水平。【结果】印楝素对小菜蛾胚胎细胞有明显的增殖抑制作用,且呈现浓度依赖性,24 h的IC_(50)为4.4μg·mL~(-1)。印楝素处理后的细胞经PI染色后能明显观察到死亡细胞,DAPI染色后可见凋亡小体;Caspase-3蛋白发生剪切,并且抑制Akt的磷酸化水平。【结论】印楝素对小菜蛾胚胎细胞的增殖有明显的抑制作用,并通过抑制Akt信号通路的活化,诱导细胞产生依赖于Caspase-3的Ⅰ型凋亡。     

印楝素对草地贪夜蛾的毒力测定及田间防效

【目的】评价印楝素对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的毒力与防效,为草地贪夜蛾的防治提供技术参考。【方法】采用浸叶法与喷雾法测定了印楝素对草地贪夜蛾的室内毒力和田间防治效果。【结果】在室内条件下,0.3%(φ)印楝素乳油处理草地贪夜蛾7 d后,2龄和3龄幼虫的LC50值分别为0.59和0.46 mg/L;40%(w)印楝素干粉处理草地贪夜蛾7 d后,2龄和3龄幼虫的LC_(50)值分别为0.93和0.79 mg/L。0.3%印楝素乳油处理草地贪夜蛾3 d后,2龄和3龄幼虫的AFC50值分别为0.30和0.12 mg/L;40%印楝素干粉处理草地贪夜蛾3 d后,2龄和3龄幼虫的AFC50值分别为0.53和0.30 mg/L。0.3%印楝素乳油稀释500倍喷雾处理后1、3和7 d对草地贪夜蛾的防效分别达到了24.83%、50.34%和75.50%。【结论】印楝素对草地贪夜蛾具有较好的毒杀活性与拒食活性,7 d后的防治效果较好;印楝素对草地贪夜蛾的防治具有广阔的应用前景。     

印楝素和球孢白僵菌对玉米田草地贪夜蛾的防效研究

为合理防控草地贪夜蛾,开展了印楝素和球孢白僵菌对玉米田草地贪夜蛾的防效研究。结果表明,药后7 d和药后14 d不同处理对玉米田草地贪夜蛾的防治效果均存在极显著差异(P<0.01)。其中,0.5%印楝素乳油1 350 g/hm²对玉米田草地贪夜蛾的防治效果最好,药后7 d和药后14 d防效均最高,分别为83.83%和73.64%;处理100亿个孢子/g球孢白僵菌可分散油悬浮剂2 100 g/hm²对玉米田草地贪夜蛾的防治效果最差,药后7 d和药后14 d防效分别为41.66%和62.22%。     

印楝素可能通过干扰细胞凋亡抑制果蝇生长发育

为了探讨印楝素调节昆虫生长发育的细胞毒理机制,寻找杀虫作用新靶标,以含印楝素0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mg/kg的培养基饲养黑腹果蝇幼虫,观察幼虫生长发育情况,通过荧光显微技术研究胚胎发育过程中的细胞凋亡. 结果表明,印楝素处理可显著抑制黑腹果蝇幼虫的生长发育,处理后5 d平均虫重由对照的1.41 mg降低至1.13~0.38 mg,发育历期由对照的4.50 d延长至5.17~12.33 d,发育抑制率为19.86%~73.05%,或形成永久性幼虫不能化蛹,最终死亡;部分幼虫虽然能化蛹,但化蛹率下降至1.67%~63.33%,均显著低于对照组的95.00%,羽化率由对照的95.00%下降至63.33%~1.67%,平均产卵数由对照的57.33下降至29.67~4.33,出现畸形成虫,个体明显变小. 运用荧光显微镜观察发现,印楝素0.5 mg/kg和2.0 mg/kg处理能明显推迟果蝇胚胎细胞凋亡高峰期,缩短凋亡峰期的持续时期.     

紫茉莉种子中对草地贪夜蛾的杀虫活性成分及杀虫机制

为了研究紫茉莉种子中对草地贪夜蛾的杀虫活性成分,对紫茉莉种子石油醚萃取物进行硅胶柱层析分离和气相色谱-质谱法(GC-MS)分析,采用浸虫法测定各馏分及化学成分对草地贪夜蛾的杀虫活性。结果表明,采用硅胶柱层析法分离紫茉莉种子石油醚萃取物,共得到20个馏分,其中馏分2对草地贪夜蛾3龄幼虫的校正死亡率最高,第7 d时为82.00%。经GC-MS分析,馏分2的主要化学成分为十三烷(9.59%)、亚油酸乙酯(51.14%)和油酸乙酯(34.26%)。这3种化学成分对草地贪夜蛾3龄幼虫处理后第7 d,LC₅₀分别为15.06 mg/ml、5.70 mg/ml和18.42 mg/ml,亚油酸乙酯的杀虫活性最好。随亚油酸乙酯质量浓度的增加,乙酰胆碱酯酶(AChE)活性呈现先抑制后激活再抑制的趋势,羧酸酯酶(CarE)活性呈现先抑制后激活的趋势,Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶活性呈现先激活后抑制的趋势。综上,紫茉莉种子石油醚萃取物中杀虫活性最好的化合物为亚油酸乙酯,可为新型植物源杀虫剂的开发利用提供理论依据。     

Sf9细胞存在Dm0-like核纤层蛋白的证据

为了确定Sf9细胞是否存在核纤层(lamina)及其性状,该文首先用已知的昆虫的核纤层蛋白(Lamin)的基因序列在Spodobase数据库搜索Sf9细胞的同源序列,并将推导的氨基酸序列与其他物种的同源蛋白进行比对。再利用抗果蝇Lamin Dm0抗体ADL67通过免疫印迹法(Western blotting)对Sf9细胞的蛋白裂解物进行检测,并通过免疫荧光技术(immunofluore-scence)对Sf9细胞进行染色。在Spodobase数据库搜索到1条Sf9细胞的Dm0-like lamin EST序列,同源比对显示它与其他物种的Lamin存在一定的同源性,尤其与家蚕、果蝇的同源性相对较高。免疫印迹结果表明Sf9细胞裂解物中存在大小约为70ku的蛋白,免疫荧光检测表明Sf9细胞核周呈现阳性反应,这些特征与已知的其他物种的核纤层的性状相似。结果表明,Sf9细胞可能存在Dm0-like核纤层蛋白,可作为探讨杆状病毒核衣壳穿过核纤层的机制之依据.     

不同药剂对玉米草地贪夜蛾的田间防治效果

为科学有效防治草地贪夜蛾,筛选出对草地贪夜蛾具有防治效果好而又生态安全的防治药剂,挑选5种杀虫剂对草地贪夜蛾进行防治效果试验,结果表明,200 g/L氯虫苯甲酰胺SC、20亿PIB/mL甘蓝夜蛾核型多角体病毒SC、60 g/L乙基多杀菌素SC以及5%甲氨基阿维菌素WG的速效性较好;200 g/L氯虫苯甲酰胺SC、20亿PIB/mL甘蓝夜蛾核型多角体病毒SC以及60 g/L乙基多杀菌素SC持效期较长,施药后14 d,该3种药剂对草地贪夜蛾的防控效果仍保持在80%以上。以上4种药剂可以作为草地贪夜蛾防治的推荐药剂,建议交替使用,20亿PIB/mL甘蓝夜蛾核型多角体病毒SC作为一种防控草地贪夜蛾生物农药的首选,建议稀释倍数400～600倍液使用效果最佳。     

6种生物碱对斜纹夜蛾离体培养细胞的作用方式

通过倒置显微镜观察斜纹夜蛾细胞凋亡小体,采用MTT法测定细胞增殖抑制作用,并使用流式细胞仪检测细胞周期时相,研究了骆驼蓬碱、喜树碱、蓖麻碱、苦参碱、博落回碱和烟碱对斜纹夜蛾离体培养细胞系SL-1的作用方式和细胞毒理。结果表明:骆驼蓬碱5.0μg/mL、20.0μg/mL和喜树碱0.5μmol/L、1.0μmol/L处理后48～60 h,斜纹夜蛾离体培养细胞系SL-1表现出明显的细胞凋亡诱导作用,处理后12～48 h,明显抑制SL-1细胞增殖,流式细胞仪检测显示细胞阻滞于G2/M期;博落回碱和蓖麻碱5.0μg/mL、20.0μg/mL对SL-1具有细胞增殖抑制作用,以20.0μg/mL处理具有细胞周期时相阻滞作用,同样使细胞阻滞于G2/M期,但无明显的细胞凋亡诱导作用;烟碱和苦参碱在5.0μg/mL、20.0μg/mL对SL-1具有细胞增殖抑制作用。     

不同药剂对草地贪夜蛾的防治效果

选用6种不同药剂,采用茎叶喷雾法防治玉米田草地贪夜蛾幼虫。结果表明,用900 mL/hm~2 10%甲维·虫螨腈SC+900 mL/hm~2 5%虱螨脲EW对玉米田草地贪夜蛾防治效果最好,药后1 d杀虫效果达74.38%,药后3、7、15 d杀虫效果均为100%;药后1、3、7、15 d保苗防效分别为51.22%、68.42%、90.48%、95.65%。生产上,推荐使用600 mL/hm~210%甲维·虫螨腈SC+600 mL/hm~2 5%虱螨脲EW、300 mL/hm~2 30%氟铃·茚虫威SC+450 mL/hm~2天然植物增效剂、1 500 mL/hm~220亿P2B/mL甘蓝夜蛾核型多角体病毒SC防治玉米田草地贪夜蛾。     

植物精油对鱼藤酮和辣椒碱在斜纹夜蛾离体培养细胞系SL-1中活性的影响

应用流式细胞术研究了24种常用植物精油对斜纹夜蛾Spodoptera litura离体培养细胞系(SL-1)细胞膜通透性的影响,采用MTT法研究精油对2种植物源农药鱼藤酮和辣椒碱的细胞活性的影响.试验结果表明:与对照相比,50μg·mL-1芸香油处理SL-1细胞24 h后,细胞内荧光染料碘化丙啶(PI)的荧光强度增加了53.04%,其次是松节油和当归油,细胞内PI荧光强度分别增加了34.23%和33.67%;100μg·mL-1广藿香油、松节油、芸香油、当归油、香茅油、生姜油处理SL-1细胞后,细胞内PI荧光强度增加率超过40%.鱼藤酮和辣椒碱对SL-1细胞的抑制中浓度(IC50)分别为34.97和35.92μg·mL-1,而与100μg·mL-1芸香油联用时IC50分别为12.69和13.26μg·mL-1,与100μg·mL-1松节油联用的IC50分别为14.56和11.392μg·mL-1,均小于鱼藤酮和辣椒碱单剂用量,芸香油、松节油能够显著提高鱼藤酮和辣椒碱对SL-1细胞的细胞活性.     

草地贪夜蛾在中国西北地区的迁飞路径

【背景】草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）是联合国粮食及农业组织（FAO）全球预警的重大迁飞性农业害虫,2018年底入侵中国后对玉米等农作物生产构成了严重威胁。远距离迁飞习性是草地贪夜蛾区域性转移危害的生物学基础,其在东亚季风和印度季风流行的气候环境下,可形成纵贯中国东部地区和西部地区的迁飞路线。据连续两年全国普查,草地贪夜蛾沿西线迁飞路线逐代北侵的终点位于我国西北地区的宁夏全境和内蒙古阿拉善左旗。但目前,入侵中国西北地区的草地贪夜蛾的虫源地尚未明确,该害虫在整个中国西部地区的迁飞路径研究也鲜有报道。【目的】阐释驱动草地贪夜蛾迁入中国西北地区的关键气象动力因子,明确该地区首次入侵种群的虫源地所在,精准解析亚洲季风气候背景下草地贪夜蛾的迁飞路径,为建设监测预警体系和指导区域性治理提供依据。【方法】利用2019—2020年草地贪夜蛾在西北地区宁夏的成虫种群动态监测数据和气象资料,采用中尺度气象数值模拟、昆虫迁飞轨迹模型、地理信息系统等技术手段,分析草地贪夜蛾远距离迁飞的大气动力背景场,模拟计算草地贪夜蛾在中国西北地区连续1—3个夜晚的迁飞路径和回推轨迹落点。【结果】7—9月份出现的偏南夏季风是影响宁夏等西北地区草地贪夜蛾不断迁入的关键气象因子,其虫源主要来自于甘肃东南部、四川东部,其次为陕西西部,此外,重庆西南部、云南东北部和山西西部局部也可为西北地区提供一定的虫源。【结论】在偏南夏季风的主导作用下,草地贪夜蛾经由多个夜晚的连续迁飞可构成其在中国西部地区的主要迁飞路径。该路径源自缅甸,自南向北依次经由中国“云南-四川和重庆-陕西和甘肃-宁夏”,最北可达内蒙古。在7—9月份偏南风盛行期提前和风速偏强的气候条件下要加强西北部玉米种植区草地贪夜蛾的监测预警与防治工作。     

4种双酰胺类杀虫剂对不同虫态草地贪夜蛾的毒力比较

为明确4种双酰胺类杀虫剂对不同虫态草地贪夜蛾的敏感性,采用浸卵法、浸叶法、饲喂毒营养液法测定了氯虫苯甲酰胺、氟苯虫酰胺、四氯虫酰胺、溴氰虫酰胺对草地贪夜蛾的卵、幼虫、成虫毒力。结果表明,4种双酰胺类杀虫剂均不影响卵的发育,但可以明显降低初孵幼虫存活率;四氯虫酰胺对草地贪夜蛾3龄幼虫毒力最高,LC₅₀值为0.12 mg/L,其次是氯虫苯甲酰胺、氟苯虫酰胺,分别为溴氰虫酰胺毒力的33.83、5.21、2.24倍;对成虫敏感性最高的是氯虫苯甲酰胺,为6.20 mg/L,其次是四氯虫酰胺、溴氰虫酰胺,氟苯虫酰胺敏感性最低,为25.96 mg/L。采用3种生测方法测定了不同虫态草地贪夜蛾对4种双酰胺类杀虫剂敏感性,可以为草地贪夜蛾的化学防治和抗性治理提供依据。     

南靖县草地贪夜蛾发生动态调查初报

为了明确南靖县草地贪夜蛾种群发生情况和和规律,2019年10月至12月,对南靖县进行草地贪夜蛾发生情况监测,其中对靖城镇、金山镇、和溪镇、船场镇、梅林镇的草地贪夜蛾发生情况进行了调查,结果表明：草地贪夜蛾下半年总共发生两个高峰,最高诱蛾量在11月11日,以玉米、茄子和辣椒上成虫发生数量较多,玉米最多;草地贪夜蛾幼虫只危害玉米,在10月21日左右出现高峰,其它作物没有发现草地贪危害,危害玉米偏向于苗期、小喇叭口期和大喇叭口期,苗期最严重,抽雄后危害显著减少。     

呼肠孤病毒3型S1基因在Sf9昆虫细胞中的表达

利用杆状病毒表达系统对呼肠孤病毒3型S1在Sf9昆虫细胞中进行表达,为研究Reo-3σ1蛋白功能及建立呼肠孤病毒3型血清学诊断方法奠定基础。采用PCR方法扩增全长为1 416bp的Reo-3S1基因,将其插入杆状病毒转座载体pFastBacHTA,构建的重组质粒pFastBacHTA-S1再转化到DH10Bac感受态细胞中,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-S1,用脂质体介导法转染昆虫细胞获得重组病毒rBS。免疫荧光法（IFA）和western-blotting检测结果表明,S1基因在Sf9昆虫细胞中表达出约为50 kD的重组蛋白,且具有免疫原性。这是国内首次通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达出了具有免疫原性的Reo-3σ1蛋白,为进一步研究单克隆抗体的制备和血清学抗体水平检测研究奠定了基础。     

卵期短时间高温和低温处理对草地贪夜蛾生长的影响S

为明确草地贪夜蛾卵对高温和低温的适应性,研究了草地贪夜蛾卵在不同温度(10℃、13℃、16℃、19℃、22℃、35℃、38℃和41℃)条件下处理不同时间(12h和24h)后转移至适温(28℃)培养,对其孵化、发育历期及性比的影响。结果显示,短期高温和低温处理对草地贪夜蛾卵的孵化率、孵化时间、发育历期及性比具有一定影响。10℃、13℃、38℃和41℃下,卵的孵化率显著低于对照组;孵化时间随着温度增加而缩短; 10℃、13℃、16℃温度处理会显著增加草地贪夜蛾幼虫发育历期, 38℃、41℃温度处理会显著缩短草地贪夜蛾幼虫发育历期。41℃高温处理12h后,草地贪夜蛾雌虫比例为56.33%,显著高于对照组及其他处理。