羊口疮病毒与宿主的博弈：免疫应答与病毒免疫逃逸机制

羊口疮(orf)是由羊口疮病毒(orf virus, ORFV)感染引起的一种高度接触性、嗜上皮性人兽共患传染病,不但阻碍畜牧业发展,而且危害人类健康。ORFV感染诱导宿主强烈的免疫反应和炎症反应,但宿主仍可被ORFV反复感染,主要是因为ORFV在与宿主的长期相互作用过程中,发展和进化出多种免疫逃逸机制。ORFV主要通过抑制干扰素反应、抑制NF-κB信号通路、抑制炎症反应、调控细胞凋亡、细胞周期、自噬和血管增生等方式实现免疫逃逸。ORFV免疫逃逸主要是通过其编码的多个免疫调控蛋白来实现。本文主要对ORFV感染引起的宿主免疫应答、ORFV免疫逃逸机制的最新研究进展进行综述,旨在为orf疫苗研制及综合防控提供重要参考。     

羊口疮的免疫防治研究进展

羊口疮是由羊口疮病毒感染所引起的一种人兽共患病,在世界范围内广泛流行,不仅给全球畜牧业造成巨大经济损失,而且危害相关从业人员的健康。目前免疫防治羊口疮的方法主要是疫苗接种。从传统疫苗与新型疫苗的角度对羊口疮疫苗研制现状进行综述,以期为该病毒疫苗的研制提供参考。     

羊口疮病毒内蒙古株的分离与初步鉴定

[目的] 确定内蒙古地区规模化养殖场发生的疑似羊口疮的病原。[方法] 无菌采集疑似羊口疮病料7份,经剪碎、研磨、离心等处理后接种山羊皮肤成纤维细胞（goat skin fibroblasts,GSFs）培养;对分离到的病毒毒株进行电镜观察;利用B2L基因引物进行特异性PCR鉴定,对获得的B2L基因序列测序,构建系统发育树,并进行同源性分析。[结果] 3份病料经GSFs培养48 h后出现明显病变,分离的病毒经负染后在电镜下观察呈卵圆形,病毒粒子长220~250 nm,宽125~200 nm,符合羊口疮病毒（orf virus,ORFV）粒子的形态特征,并将其命名为NM-ORFV-1株、NM-ORFV-2株、NM-ORFV-3株。分离株经B2L基因PCR鉴定获得1 137 bp的扩增产物,与预期一致;系统发育树及同源性分析显示,NM-ORFV-2株与NM-ORFV-3株遗传关系密切,处于同一分支,且与ORFV KP336704（中国）分离株的亲缘关系最近,同源性达到99.4%;NM-ORFV-1株与NM-ORFV-2株及NM-ORFV-3株处于不同分支,NM-ORFV-1株与NM-ORFV-2株的同源性为99.1%,与NM-ORFV-3株的同源性为99.0%,且与ORFV JQ904789（中国）疫苗株亲缘关系最近,同源性为99.6%。[结论] 内蒙古地区规模化养殖场疑似羊口疮病例的病原是ORFV。     

羊口疮病毒的研究进展

羊口疮(orf)病毒又称传染性脓疮(ecthyma contagiosum)病毒,属于痘病毒科副痘病毒属,能引起反刍动物和人发病,在我国西部地区流行比较广泛,是家畜疫病防控中重要的一种病原。     

羊源与骆驼源羊口疮病毒免疫相关基因的比较分析

试验旨在探究羊口疮病毒（Orf virus,ORFV）在感染不同物种后其免疫相关基因所表现出的差异变化。对采集到的羊和骆驼ORFV病料进行病毒基因组提取,分别命名为ORFV-Y和ORFV-LT。根据GenBank中ORFV全基因组序列（登录号：KF234407.1）设计并合成3对特异性引物,分别扩增ORFV-Y和ORFV-LT的B2L、F1L和VIR基因片段,并将扩增得到的基因片段分别克隆到pMD19-T载体上,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,对重组质粒进行鉴定,选取阳性克隆质粒进行测序,用DNAStar软件对所获序列进行拼接后,与NCBI上已公布的13组ORFV全基因组相应基因序列进行同源性比对、氨基酸序列分析和系统进化树构建。结果显示,两组基因组与参考序列的B2L、F1L和VIR基因核苷酸同源性分别为92.8%~99.2%、95.7%~99.5%和77.6%~100%。将两组基因组与参考序列进行氨基酸序列比对分析后发现,两组基因组之间的免疫相关基因均表现出较为明显的差异,且F1L基因有一定的规律可循。对B2L、F1L和VIR基因进行系统进化树构建分析后发现,ORFV-Y与中国福建山羊株亲缘关系较近,而ORFV-LT与参考毒株进化关系均较远,且单独成为一个分支。综上,ORFV在感染羊和骆驼时其免疫相关基因出现了较为明显的差异,为深入探究ORFV感染不同物种其基因序列发生的变化及未来针对不同物种的疫苗研制提供参考。     

羊口疮病毒威海株的分离鉴定

利用犊牛睾丸原代细胞对山东省威海市某奶山羊养殖场疑似羊口疮（Orf）山羊病料进行病毒分离,通过细胞病变观察、病毒滴度和聚合酶链反应（PCR）等方法对分离毒株进行鉴定。结果表明,研磨处理的病毒液接种于犊牛睾丸原代细胞后盲传至第5代出现病变,测得第6代分离株病毒滴度为106．5 TCID50／mL。扩增羊口疮病毒特异性 B2L 基因,发现该毒株与34个羊口疮毒株核苷酸序列同源性高达99％,包括福建株（KC588399．1、KC568398．1）。本研究成功分离鉴定了羊口疮病毒山东威海株。     

羊口疮病毒VIR蛋白对宿主细胞IFN-α表达的显著抑制

羊口疮病毒(ORFV)属于痘病毒科副痘病毒属,可引起严重的人兽共患传染病。VIR是ORFV编码的非结构蛋白之一,参与ORFV的免疫逃避。仙台病毒(SeV)可以诱导干扰素的产生。为研究VIR蛋白对IFN-α表达的影响,本研究以山羊成纤维上皮细胞(GSFs)为对象,使用SeV单独刺激、SeV与VIR共同刺激GSFs,定量ELISA方法检测GSFs上清中IFN-α的质量浓度。结果显示,VIR蛋白对SeV刺激的IFN-α表达和分泌有明显的抑制作用。本研究为深入研究ORFV突破宿主细胞天然免疫屏障奠定了基础。     

应用对流免疫电泳检测细胞培养物中羊口疮病毒抗原

对羊口疮抗原的检测,国内曾报道应用对流免疫电泳的方法。而对细胞培养的羊口疮病毒的检测则多采用电镜观察。本试验采用对流免疫电泳的方法检测鸭胚成纤维细胞培养物中的羊口疮病毒抗原,并用电镜观察和免疫电泳作对照试验。现报告如下:     

羊口疮病毒129蛋白互作宿主蛋白的筛选与C1QBP基因的克隆分析

【目的】以羊口疮病毒129（ORFV129）蛋白为研究对象,在构建山羊鼻甲骨原代细胞cDNA文库的基础上,通过酵母双杂交筛选与其相互作用的蛋白。【方法】采用Smart^TM技术构建山羊鼻甲骨原代细胞cDNA文库。构建诱饵质粒pGBKT7-129,并将其转化至Y2HGold酵母感受态细胞,验证质粒pGBKT7-129是否具有自激活性。对转化了质粒pGBKT7-129的菌液进行生长曲线测定,验证该质粒是否对酵母细胞有毒性作用。以ORFV129为诱饵蛋白,利用酵母双杂交系统筛选出与ORFV129相互作用的宿主胞内蛋白并对阳性菌落进行PCR和测序鉴定。利用DAVID 6.7的GO数据库对胞内宿主蛋白进行功能分类和通路分析,并依据Cytoscape v 3.8.0软件绘制ORFV129与胞内蛋白相互作用的网络图。以山羊脾脏为组织样本,采用RT-PCR技术克隆山羊补体C1q结合蛋白（complement C1q binding protein,C1QBP）基因CDS区序列,并采用在线软件进行生物信息学分析。将C1QBP基因CDS区序列连接至pcDNA3.1（+）构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-C1QBP,并将其转染至山羊鼻甲骨原代细胞进行亚细胞定位分析。【结果】试验成功构建山羊鼻甲骨原代细胞cDNA文库,文库容量约为6.0×10⁶ CFU/mL。成功构建诱饵质粒pGBKT7-129,重组质粒pGBKT7-129无自激活能力且对酵母细胞无毒性。利用酵母双杂交筛选出14个与ORFV129进行互作的胞内蛋白并对阳性克隆进行PCR、测序验证。试验成功克隆山羊C1QBP基因CDS区,长度为837 bp,编码279个氨基酸。系统进化树显示,山羊和绵羊亲缘关系最近。C1QBP蛋白为不稳定的亲水性蛋白,无信号肽结构和跨膜结构域,主要包括3种磷酸化位点,分别是18个丝氨酸、4个苏氨酸和3个酪氨酸位点。C1QBP蛋白二级结构由α-螺旋（33.81%）、无规则卷曲（46.40%）、延伸链（16.91%）和β-转角（2.88%）组成,三级结构与二级结构一致。间接免疫荧光试验表明,C1QBP蛋白散在分布于细胞质中。【结论】筛选出了与ORFV129蛋白相互作用且在天然免疫应答中发挥作用的宿主胞内蛋白C1QBP,通过间接免疫荧光试验验证C1QBP定位于细胞质中,推测ORFV129与能C1QBP相互作用诱导炎症,为进一步验证ORFV129蛋白介导ORFV抑制机体免疫应答的过程奠定基础。     

Comparison Analysis of Immune Related Gene of Orf Virus in Sheep and Camels

The purpose of this study was to investigate the variation of Orf virus (ORFV) immune related genes after infection with different species.The ORFV genomes of sheep and camel were extracted and named ORFV-Y and ORFV-LT,respectively.Based on ORFV genome sequence published in GenBank (accession No.:KF234407.1),three pairs of specific primers were designed and synthesized to amplify the B2L,F1L and VIR gene fragments of ORFV-Y and ORFV-LT,respectively,and the amplified fragments were cloned into pMD19-T vector,transformed into E.coli DH5α competent cells.The recombinant plasmid was identified,and positive clones were selected for sequencing,DNAStar software was used to analyze the homology,amino acid sequence and phylogenetic tree of 13 ORFV genome sequences published on NCBI.The results showed that the nucleotide homology of B2L,F1L and VIR genes were 92.8% to 99.2%,95.7% to 99.5% and 77.6% to 100%,respectively.After comparing the amino acid sequence between the two genomes and the reference sequence,it was found that there were obvious differences in the immune related genes between the two genomes,and F1L gene had some rules to follow.The phylogenetic analysis of B2L,F1L and VIR genes showed that ORFV-Y was closely related to the Chinese Fujian goat strain,while ORFV-LT was far from the reference strains,and was a separate branch.The results showed that ORFV had obvious difference in immune related genes between sheep and camels,it provided a reference basis for further research on the changes of ORFV gene sequences in different species and the development of vaccines for different species in the future.     

羊传染性脓疱病毒分离及生物学特性研究

用犊牛睾丸细胞及BK细胞,从内蒙古自治区达拉特旗发病的进口小尾寒羊痂块中分离到一株病毒,对其进行连续传代至病变稳定。通过对该分离株进行动物回归试验,在犊牛睾丸细胞及BK细胞中的增殖特性试验、病毒核酸类型鉴定试验、脂溶剂敏感试验及其它生物学特性试验、电镜观察等,初步鉴定该分离株为羊传染性脓疱病毒。     

绵羊痘病毒、山羊痘病毒及羊口疮病毒多重PCR检测方法的建立和应用

为了建立鉴别绵羊痘病毒(SPPV)、山羊痘病毒(GTPV)和羊口疮病毒(ORFV)的多重PCR检测方法,针对GenBank中3种病毒的基因组序列,合成了3对引物,通过优化多重PCR反应条件,建立了鉴别检测3种病毒的多重PCR方法。特异性试验表明,应用该方法可分别扩增出3种病毒对应的目的片段,对大肠埃希菌、沙门菌、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、Vero细胞、正常羊组织的DNA和灭菌双蒸水均无扩增;敏感性试验表明,该方法最低检测量分别为30.46pg/μL的绵羊痘病毒、28.9pg/μL的山羊痘病毒和26.94pg/μL的羊口疮病毒基因组DNA;应用本方法对85份临床病料进行检测,结果与其他已建立的单项PCR检测方法结果一致,说明该方法可以用于临床上SPPV、GTPV和ORFV的鉴别诊断。     

羊口疮病毒活载体疫苗和生物制剂的研制现状

羊口疮病毒的基因组结构、编码基因复制特性及其在宿主和非宿主体内快速启动机体的免疫反应特点,使其具有作为活病毒疫苗载体的特殊优势。此外,该病毒自身及其编码蛋白的双向免疫调节功能使其具有作为临床使用生物制剂的巨大潜力。作者对基于羊口疮病毒的重组疫苗和生物制剂的研制现状进行了详细的综述,以期为该病毒的疫苗研制、生物制剂研发及临床应用提供参考。     

Research Status on the Development of Live Vector Vaccine and Biological Agents of Orf Virus

Orf virus (ORFV) has special advantages as the live viral vaccination vectors due to its structure of genome, replication characteristics of encoding gene and quick activation of immunoreactions in host and non-host.In addition, ORFV and its coding proteins have huge potential as clinical biological agents for their function as dual immune modulators.Research statuses on recombinant vaccine of ORFV and biological agents were reviewed which would provide the reference for the development and clinical application of vaccination and biological agents.     

青海省刚察县羊口疮病毒的分离与鉴定

利用MDBK细胞从青海省刚察县某藏羊养殖小区发病羊唇部痂皮中分离获得一株病毒,通过临床症状、PCR检测以及组织病理学观察等方法对该株病毒进行了鉴定,证实分离株为羊传染性脓疱病毒(Orf Virus,ORFV),命名为ORFV-QHGC01。参照Gen Bank中ORFV F1L基因的核苷酸序列,设计合成一对特异性引物,对ORFV-QHGC01株F1L基因进行了克隆、测序,并推导出其氨基酸序列。序列分析表明,分离株F1L基因片段长987bp,编码328个氨基酸,与Genbank中AF097215、AY040081、AY040082、AY040083、AY040084、AY040085、FJ808075、HQ221964、JQ271535株的核苷酸序列同源性分别为:96.7%,95.6%,96.1%,96.2%,97.5%,97.2%,96.5%,95.3%,98.3%。系统发育进化树结果表明,ORFV-QHMH01分离株与参考毒株JQ271535的亲缘关系较近,这表明不同地区分离株的F1L基因具有较好的保守性。     

羊口疮病毒PMA-PCR检测方法的建立

【目的】 为快速有效评估宿主动物体内及周围环境中的羊口疮病毒(Orf virus,OrfV)是否失活,本研究应用核酸染料叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)联合PCR扩增技术,以F1L基因为靶向检测对象,旨在建立一种针对具有感染活性OrfV的PMA-PCR检测方法。【方法】 将病毒悬液经不同温度相同时间的水浴处理,通过PCR确定病毒样本最佳的热灭活温度;分别设置PMA曝光时间梯度及浓度梯度,进一步对PMA的曝光时间和工作浓度等因素进行优化,确定有效区分具有感染活性OrfV和失活OrfV的PMA最佳处理条件;对所建立PMA-PCR方法进行特异性试验验证,并通过对不同数量比例的热灭活OrfV、活OrfV混合病毒悬液样本进行检测来验证该方法的敏感性。【结果】 OrfV样本经60 ℃热水浴处理10 min即可被完全灭活;PMA与失活OrfV的DNA共价结合且溶液中游离PMA光解的最佳曝光时间为15 min;热灭活OrfV基因组扩增被完全抑制的最小PMA浓度为20 μmol/L,活OrfV基因组扩增不受抑制的最大PMA浓度为35 μmol/L;特异性试验结果表明,该方法检测活OrfV时出现阳性条带,而口蹄疫病毒(FMDV)、绵羊痘病毒(SPPV)、山羊痘病毒(GTPV)的扩增结果均呈阴性;经PMA处理后,在不同数量比例的活、热灭活OrfV病毒悬液中检测到活OrfV的灵敏度为10^-1.68 TCID₅₀/0.1 mL。【结论】 本试验成功建立了针对活OrfV的PMA-PCR检测技术,该方法特异性强、敏感度高,可为相关工作领域评估OrfV致病性提供技术参考。     

猪流行性腹泻病毒逃避宿主干扰素抗病毒作用机制的研究进展

猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）是一种全球分布的α冠状病毒,能引起仔猪流行性腹泻,猪流行性腹泻一旦暴发会给养殖业带来巨大的经济损失。在病毒感染期间,Ⅰ型干扰素（type Ⅰ interferon,IFN-Ⅰ）是先天性抗病毒反应的关键介质。大多数冠状病毒通过限制IFN的产生和IFN应答的激活而产生一些策略以规避IFN应答。然而,PEDV颉颃IFN抗病毒作用的分子机制尚未完全清楚。猪感染PEDV后,机体的先天免疫不能有效抵抗PEDV的侵害,PEDV通过限制或阻断IFN的功能和隐藏自身的病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMP）两种途径逃逸宿主先天免疫。在此过程中,PEDV的结构蛋白和非结构蛋白及一些蛋白酶起到了关键作用,核衣壳（nucleocapsid,N）蛋白能抑制IFN-Ⅰ的产生,协助病毒逃避机体的抗病毒天然免疫,木瓜样蛋白酶通过去泛素化酶活性阻断天然免疫信号通路,PEDV也可通过阻断双链核糖核酸（double-stranded RNA,dsRNA）诱导IFN-Ⅰ的产生,以逃避宿主的先天免疫。这些研究为深入了解IFN在PEDV致病过程中的作用及PEDV逃避IFN抗病毒的机制提供了理论依据,并有助于深入了解病毒与宿主先天性免疫之间的关系,同时也为PEDV的防治及PEDV疫苗的研发提供参考。