褐黄血蜱雌蜱不同消化阶段中肠蛋白组学分析

本研究旨在探明4个时间段褐黄血蜱（采自刺猬体表）中肠蛋白质成分,揭示参与血餐消化的蛋白种类及其含量变化规律。采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对采集于刺猬体表的4个时间段褐黄血蜱的中肠蛋白组成分进行检测。基于该蜱的唾液、中肠转录组翻译文库及Uniprot数据库,利用软件Mascot 2.2对所获肽段及蛋白质进行鉴定。结果显示：在褐黄血蜱中肠蛋白提取液中共检测出特异性肽段3 046条,鉴定303种蛋白,其中271种为高可信蛋白;在所有的高可信蛋白中,23种含量较为丰富,125种在后期消化阶段（第2至第4阶段）的含量为0,123种的含量发生不同程度的变化（24种蛋白的含量变化明显,其中12种含量上升明显,12种含量下降明显）。确定148种高可信蛋白来自于刺猬血清,推断24种可信蛋白可能参与蜱虫对血餐的消化。     

褐黄血蜱产卵和孵化规律观察

褐黄血蜱是我国中东部各省、市、自治区的优势蜱种,其可携带多种病毒、细菌、支原体、螺旋体等病原,对人类健康和公共卫生安全构成潜在威胁.由于该蜱偏好于侵袭野生动物,尤其是刺猬,故长期被忽视.该论文对褐黄血蜱产卵和孵化进行观察,结果表明,褐黄血蜱卵呈椭圆形,其大小约535.63μm×361.56μm,重量0.064 mg.2...     

褐黄血蜱中肠内容物菌群结构分析

为了解褐黄血蜱的带菌情况及其公共卫生意义,本研究在无菌条件下采集褐黄血蜱中肠内容物,提取细菌总DNA为模板,采用通用引物PCR扩增细菌16S r DNA V3区,经DGGE电泳回收DGGE 16个优势条带,并选取其中13个条带进行测序分析,结果显示,选取条带分别与立克次氏体属、柯克斯氏体属、假单胞菌属、葡萄球菌属、大肠杆菌属等高度相似。采用传统细菌学方法,从中肠内容物培养分离到2株细菌,经鉴定其中1株为蜡样芽胞杆菌。对各地区褐黄血蜱半饱血雌成蜱和吸血雄成蜱中肠菌群结构分析结果表明其带菌情况基本相同,但饱血雌成蜱3个地区间具有较大的差异;而饱血雌蜱和其它两种状态下的蜱肠道菌群也有差异。贝纳柯克斯氏体、菊欧文氏菌、肺炎克雷伯菌及软腐果胶杆菌是褐黄血蜱中肠内的优势菌。本研究利用PCR-DGGE技术分析褐黄血蜱中肠内容物,为蜱传播疾病的研究奠定基础。     

褐黄血蜱的形态学与分子生物学鉴定

鉴定采自河南信阳、湖南华容、山西太谷刺猬、犬的蜱。借助体视显微镜对蜱样进行形态观察;克隆、分析其COX1与ITS1序列,对比分析同源性并构建系统发生树。形态学鉴定和分子生物学鉴定结果表明,采自河南信阳、湖南华容、山西太谷刺猬、犬体表的蜱均为褐黄血蜱。湖南、河南、山西也成为褐黄血蜱的分布地。     

褐黄血蜱卵蛋白质组分析

本研究旨在探明褐黄血蜱卵内蛋白组分,揭示蜱胚胎发育中的关键营养物质,为筛选可干扰胚胎发育的抗原分子奠定基础。采用液相色谱-串联质谱法对新鲜褐黄血蜱的卵蛋白成分进行分析,基于该蜱的唾液腺转录组翻译文库、中肠转录组翻译文库和Uniprot数据库对各蛋白成分进行鉴定。结果显示:从褐黄血蜱卵黄蛋白提取液中检出特异性肽段221条,由此鉴定蛋白53种,其中高可信蛋白12种,能够确定的功能蛋白有肌动蛋白(actin)和卵黄蛋白原Ⅱ(vitellogenin 2,Vg-2),且Vg-2与卵黄蛋白(vitellins, Vn)一级结构相同。蜱卵原生质所含蛋白较少;Vg-2是蜱卵内存在的唯一一种卵黄蛋白原。     

褐黄血蜱卵蛋白的鉴定及在卵孵化过程中的量变

【目的】 探明褐黄血蜱卵蛋白成分及其在胚胎发育过程中的作用,为筛选抗蜱生殖疫苗分子奠定基础。【方法】 提取褐黄血蜱孵化0、7、14、21 d的卵蛋白,以过滤器辅助样品制备（filter-aided sample preparation,FASP）法酶解卵蛋白,液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）分离、检测酶解特异性肽段,搜索该蜱中肠转录组文库鉴定卵原生质中的蛋白,登录NCBI对各蛋白进行注释;以Maxquant计算各蛋白的iBAQ （intensity-based absolute quantification）和非标记定量（Label-free quantification,LFQ）,分析各蛋白在不同孵化时间的相对丰度及其增减,并对高可信蛋白序列进行GO功能富集分析。【结果】 本研究共检出特异性肽段1 044条,由此鉴定多肽291种,其中高可信的（unique peptides≥2）112种,但仅39种有相关文献。基于文献,按照功能将39种蛋白归类于酶、酶抑制剂、转运蛋白、热休克蛋白、细胞骨架蛋白及未知蛋白6类;酶、酶抑制剂、转运蛋白、热休克蛋白都有家族蛋白共存的情况。定量分析显示,在新产褐黄血蜱卵中,丰度最高的是Contig14782,其次为Contig6575。至孵化结束时,在20种高丰度蛋白中,1种（Contig2242）显著升高（P<0.05）,14种显著下降（P<0.05）,5种增减不显著。GO功能富集分析表明,本次鉴定的高可信蛋白主要定位于胞外区域,参与免疫调节过程,发挥结合蛋白质和RNA的作用。【结论】 褐黄血蜱卵蛋白成分复杂、种类众多,包括酶、酶抑制剂、转运蛋白、热休克蛋白、细胞骨架蛋白等,其中酶是最多的一类。在孵化期间,绝大多数蛋白酶和酶抑制剂丰度显著下降。     

褐黄血蜱HSP70-b2及其类14-Mer肽的作用研究

褐黄血蜱(Haemaphysalis flava,H.flava)热休克蛋白70-b2(heat shock protein 70-b2, HSP70-b2)属于HSP70家族。为评估褐黄血蜱HSP70-b2的抗凝血活性、免疫原性及其类14-Mer肽的作用,本研究通过RACE技术扩增褐黄血蜱HSP70-b2基因全长;定点突变其编码类14-Mer肽段序列获得HSP70-b2^M基因全长;分别构建原核表达质粒,经原核表达、镍柱层析纯化获得可溶性重组蛋白,体外凝血四项试验评估rHSP70-b2与rHSP70-b2^M的抗凝血活性;将重组蛋白与弗氏(不)完全佐剂按推荐剂量乳化,皮下免疫Sprague Dawley(SD)大鼠,间接ELISA检测血清抗体效价,探究rHSP70-b2与rHSP70-b2^M的免疫原性。结果显示：HSP70-b2基因全长2 413 bp,开放阅读框长1 905 bp,编码蛋白中具有HSP70蛋白家族标签。成功将HSP70-b2中编码类14-Mer肽段的核酸序列突变为编码14-Mer肽段的核酸序列。与对照组相...     

蜱传斑点热群立克次体青海分离株分离与遗传进化分析

根据已发表斑点热群立克次体外膜蛋白OmpA基因序列设计特异性引物,对青海省采集的蜱标本进行PCR检测,并对阳性样本进行测序和序列分析,建立分子系统进化树。结果显示在454个蜱样本池中检测到14个SFGR阳性样本,其中9个西伯利亚立克次体阳性样本和5个黑龙江立克次体阳性样本,总感染率3.08%。序列分析结果显示,西伯利亚立克次体青海株HUN与与黑龙江立克次体虎林株HL-93(AF179364)、绥芬株HLJ-054(AF179362)共处一个分支,一致性分别为99.18%和99.51%;黑龙江立克次体青海株GL-1与西伯利亚立克次体前苏联株246(U43807)和北京株BJ-90(AF179365)同处一个分支,序列一致性分别为99.49%和99.67%。说明青海省存在SFGR感染,应尽快制定防控措施,以免危害动物及人类健康。     

怀化地区犬瘟热病毒H、F基因遗传多样性及其遗传进化分析

【目的】探究怀化地区犬瘟热病毒的基因变异与遗传多样性情况,阐明其遗传进化关系。【方法】从怀化地区收集30株犬源犬瘟热病毒样本,用PCR法扩增其H、F基因序列。利用DNAStar软件分析H、F基因序列碱基组成;利用Clustal X、MegAlign软件进行变异位点和遗传多样性分析;运用Clustal X、PhyML 3.0软件,采用最大似然法(ML)对怀化地区犬瘟热病毒进行遗传进化分析,并用FigTree v 1.3.1软件构建遗传进化树。【结果】30株怀化地区犬瘟热病毒均为Asia-Ⅰ型,其H、F基因序列长度分别为1 778和1 850 bp,其AT含量分别为56.8%～57.9%和54.9%～56.1%,GC含量分别为42.2%～43.0%和44.1%～44.9%。H基因的种内差异为0～3.1%,种间差异为51.36%～60.15%;F基因的种内差异为0～2.4%,种间差异为39.60%～53.09%。基于H、F基因序列所构建的遗传进化树发现,来源于怀化地区的30株犬源犬瘟热病毒全部位于遗传进化树的同一分支上。【结论】来源于怀化地区犬瘟热病毒之间虽存在一定程度的基因变异和遗传多样性...     

63株IBV分离株M基因的遗传变异与系统进化分析

对1993－2010年从中国不同地区分离的63株传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)野毒株,采用RT-PCR方法克隆测定所分离野毒株的M基因核苷酸序列,并与GenBank中公布的部分国内外IBV毒株的M基因序列进行比较分析,研究中国IBV的分子流行病学特点和分子遗传变异规律。结果显示,所测毒株M基因具有6种不同长度的开放阅读框,这些长度的差异是由于5'端的核苷酸插入或缺失造成的;N端含有1~2个N-糖基化位点,其中1个糖基化位点"Asn-Cys-Thr"(NCT)是高度保守的。63个IBV分离株间氨基酸序列相似性为88.9%~100%,分离株与参考株间相似性为87.2%~100%。系统进化分析结果显示,本研究的63个IBV分离株可分为9个基因型,2005－2010年IBV中国流行株大部分与Mass型疫苗株处于不同的基因型,而且氨基酸序列相似性都小于94%。     

鸡蛔虫线粒体cox1和nad4基因的遗传变异分析

为探究鸡蛔虫的种内遗传变异和系统发育关系,对分离自四川省西昌市的15个鸡蛔虫分离株的线粒体细胞色素c氧化酶第Ⅰ亚基（cox1）基因部分序列和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚单位Ⅳ（nad4）基因全序列进行PCR扩增、序列测定及分析,并用cox1和nad4基因部分序列构建鸡蛔虫与其他蛔虫的NJ树和贝叶斯树。测序结果显示,所获得的鸡蛔虫cox1和nad4基因全序列长度分别为1 152和1 236 bp,分别有33和40个变异位点,碱基变异率分别为0~2.1%和0~2.3%;分别检测到8和11个单倍型,总的单倍型多样性分别为0.733±0.124和0.933±0.054,核苷酸多样性分别为0.00433±0.00153和0.00541±0.00157,平均遗传距离分别为0.004和0.005。构建的种系发育树均显示15个鸡蛔虫西昌分离株与其他国家/地区的鸡蛔虫分离株聚类形成一个分支,与鸽蛔虫的亲缘关系最近,与其他蛔虫所属的分支相隔较远。研究结果表明鸡蛔虫西昌分离株的遗传变异程度低,且nad4基因比cox1基因更适合作为研究鸡蛔虫分离株遗传变异的分子标记。     

Genetic Variation Analysis of Mitochondrial cox1 and nad4 Genes of Ascaridia galli

To study the genetic variations of Ascaridia galli (A. galli) and the phylogentic relationships with other Ascaridata, fragment of the mitochondrial cytochrome c oxidase subunit 1 (cox1) gene and complete sequence of NADH dehydrogenase subunit 4 (nad4) gene of 15 adult A. galli isolated from Xichang city in Sichuan province were amplified by PCR, then analyzed the sequences. NJ trees and Bayes trees based on pcox1 and pnad4 genes were reconstructed. The partial sequences of cox1 gene and complete sequence of nad4 gene were 1 152 and 1 236 bp, respectively. There were 33 and 40 variable sites in the pcox1 and nad4 gene sequences, the intraspecific sequence variations within A. galli were 0 to 2.1% for pcox1 gene, 0 to 2.3% for nad4 gene. 8 and 11 haplotypes were detected in pcox1 and nad4 genes, the global haplotype diversity were 0.733±0.124 and 0.933±0.054, the nucleotide diversities were 0.00433±0.00153 and 0.00541±0.00157, and the average genetic distances were 0.004 and 0.005, respectively. Phylogenetic trees based on pcox1 and pnad4 genes with Neighbour-Joining and Bayesian analysis method revealed that all A. galli were clustered in one clade, and they were more closely related to A. columbae than any other members of Ascaridata. These findings indicated that 15 isolates of A. galli from Xichang city kept low genetic variation, nad4 gene was more suitable and effective than cox1 gene as molecular marker for detecting genetic variation of A. galli.     

湖南省山羊脑多头蚴的线粒体nad1和nad4基因的序列测定及种系发育分析

本研究旨在阐明脑多头蚴湖南分离株线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( NADH)脱氢酶亚单位1基因(nad1)部分序列(pnad1)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位4基因(nad4)部分序列(pnad4)的遗传变异情况,并用pnad1和pnad4序列重构脑多头蚴与其它带科绦虫的种群遗传关系.利用聚合酶链反应(PCR)扩增脑多头蚴的pnad1和pnad4,应用ClustalX 1.81程序对序列进行比对,再用Phylip3.67程序MP法和Mage4.0程序NJ法绘制种系发育树,并用Puzzle5.2程序构建最大似然树,同时利用DNAstar5.0中的Megalign程序进行同源性分析.结果显示所获得的pnad1和pnad4序列长度分别均为666和887 bp,湖南分离株与已知多头带绦虫位于同一分枝.由于脑多头蚴pnad1和pnad4序列种内相对保守,种间差异较大,故均可作为种间遗传变异研究的标记,从而为脑多头蚴的分子流行病学和其相关疾病的诊断奠定基础.     

湖南省猬迭宫绦虫的线粒体cox1和nad1基因的序列测定及种系发育分析

本研究旨在阐明猬迭宫绦虫湖南分离株线粒体细胞色素c氧化酶第I亚基(cox1)基因部分序列(pcox1)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位l基因(nad1)部分序列(pnad1)的遗传变异情况,并用pcox1和pnad1序列重构猬迭宫绦虫与其它绦虫的种群遗传关系。利用聚合酶链反应(PCR)扩增猬迭宫绦虫的pcox1和pnad1,应用ClustalX1.81程序对序列进行比对,再用Phylip3.67程序MP法和Mage4.0程序NJ法绘制种系发育树,并用Puzzle5.2程序构建最大似然树,同时利用DNAStar5.0中的Megalign程序进行同源性分析。结果显示所获得各样品株的pcox1和pnad1序列长度一致,分别为396和566bp,湖南分离株与已知猬迭宫绦虫位于同一分枝。由于猬迭宫绦虫pcox1和pnad1序列种内相对保守,种间差异较大,故均可作为种间遗传变异研究的标记,从而为猬迭宫绦虫的种群体遗传学研究和其相关疾病的诊断奠定基础。     

Analysis on Genetic Diversity and Phyletic Evolution of mtDNA Cytb Gene in Zhongdian Yak

In order to investigate the genetic diversity and the origin of evolutionary relationship of Zhongdian yak,we analyzed the complete sequence of 15 individuals Cytb gene,its sequence polymorphism was analyzed,and the phylogenetic tree was constructed.The results showed that the length of the nucleotide sequence were 1 140 bp,with nucleotide frequencies of 26.3%,31.8%,13.1% and 28.8% for T,A,G and C,respectively.Three haplotypes were identified of 15 individuals,with 3 polymorphic sites,including two conversions,one transversion,haplotype diversity was 0.2571 and nucleotide diversity was 0.00035.Phylogenetic analysis suggested that Zhongdian yak and Bos mutusc clustered firstly,then gathered with Bison bison,which indicated that there were high genetic similarity and closer genetic relationship,genetic similarity with other cattle genus was relatively low.Combining with the proof of molecular biology and paleontology,the result supported the point that Bos grunniens and Bos mutus were classified as an alone genus in Bovinae.     

2006－2016年中国羊口疮病毒的遗传演化分析

羊口疮（Orf disease）是由羊口疮病毒（Orf virus,ORFV）引起的人兽共患传染病,该病广泛分布于世界各地,对公共卫生造成了严重的影响。为了解中国ORFV毒株的起源、分子流行病学及病毒系统研究的信息,本研究对中国2006-2016年分离到82株ORFV毒株进行了系统的遗传演化分析,利用DNAStar和Mega 5.0软件对ORFV011（B2L）、ORFV020（VIR）、ORFV059（FIL）和ORFV127（vIL-10）基因序列进行核苷酸和氨基酸同源性比对,并在此基础上构建系统发育树。结果显示,82株病毒B2L基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为95.9%~100%和86.5%~100%,F1L基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为94.5%~100%和94.0%~100%;系统进化分析显示,中国不同地方分离的ORFV毒株处于不同分支上,甚至同一个省内的毒株也分布在不同分支上。表明中国ORFV毒株进化特殊,处于不同的进化分支上,且有发生突变的可能性,世界各地流行的代表性毒株在中国均有变种分布,这增加了中国防控ORFV的难度。本研究结果为中国防控羊口疮的流行和研制高效疫苗提供了基础数据。