1株分离自云南省师宗县库蠓的新型西藏环状病毒

西藏环状病毒(Tibet orbivirus,TIBOV)为环状病毒属的新成员,病毒于2009年首次从我国西藏墨脱县采集的圆斑按蚊中分离,目前,对该病毒的认识仍十分有限.本研究对1株分离自我国云南省师宗县库蠓的新型TIBOV毒株YNSZ/V290/2019进行了鉴定,结果表明,病毒可在C6/36与BHK-21细胞上引起...     

1株麻雀源坦布苏病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

从山东地区某发病鸭场周围的麻雀体内分离到1株坦布苏病毒,命名为SDS株,并对分离毒株进行毒力测定。应用RT-PCR技术对分离株全基因组进行扩增并测序,将获得的SDS株坦布苏病毒全基因组序列与已在Gen Bank发表的24株坦布苏病毒和6株其他黄病毒属病毒全基因组序列进行遗传进化分析。结果表明,该株坦布苏病毒的基因组全长为10 990 nt,包含94 nt的5'端非编码区、618 nt的3'端非编码区和一个开放阅读框(3 425个氨基酸),编码11种病毒蛋白;与Gen Bank已发表的坦布苏病毒的核苷酸序列同源性为98.2%~99.5%,氨基酸序列同源性为98.1%~99.4%,其中与鸭源WFZ株(KC990545.1)的核苷酸序列同源性最高为99.5%,与鹅源坦布苏病毒(duck eggdrop syndrome virus strain goose,JQ920424.1)和鸡源坦布苏病毒(CJD50,JF926699)的核苷酸序列同源性较低为98.9%。用Net NGlyc 1.0 Server在线软件对病毒蛋白潜在糖基化位点进行预测,结果表明在SDS株病毒多聚蛋白中共有13个潜在的糖基化位点,分别位于5个不同病毒蛋白中。     

1株林麝源绿脓杆菌的分离鉴定及全基因组序列分析

旨在确定甘肃省天水市某林麝养殖场致死林麝的病原菌,并开展其致病性和耐药性研究及全基因组序列分析。采集病死林麝肺,通过细菌的分离纯化、生化鉴定和16S rRNA基因序列分析,对分离菌进行鉴定;随后对其致病性和药物敏感性进行分析,并在分离菌全基因组测序的基础上,对分离菌全基因组序列进行组装和注释,对毒力基因toxA和exoT进行遗传进化分析。结果表明,从病死林麝肺中分离到一株绿脓杆菌,命名为TS2019。致病性试验测得分离菌对小鼠的LD₅₀为2.82×10⁷CFU·mL^-1;药敏试验结果表明,TS2019具有多重耐药性,但对环丙沙星、洛美沙星等药物敏感。基因组测序表明,TS2019基因组全长为6 308 327 bp,编码5 929个基因,其中有1 035个编码产物参与新陈代谢途径;全基因组中有毒力因子编码基因875个,产物有黏附蛋白、调控因子、毒性蛋白等;有四环素类、氨基糖苷类等抗生素耐药相关基因5 288个。遗传进化分析表明,TS2019毒力基因toxA、exoT与GenBank中绿脓杆菌众多菌株相应基因序列相似性均高于99%,其中eoxT基因与中国杭州人源分离株P33的遗传关系最近,但处于独立分支。本研究从病死林麝肺分离鉴定到一株绿脓杆菌,并证实该菌有较强致病性和多重耐药性,其毒力基因toxA和exoT与GenBank中绿脓杆菌相应基因序列具有高度相似性。研究结果为林麝绿脓杆菌感染相关疾病的防治提供了理论支持,也为绿脓杆菌致病机制和耐药机制的深入研究奠定了基础。     

一株猪蓝耳病毒的分离鉴定及其全基因组序列的比较分析

从湖北省某猪场分离了一株猪蓝耳病毒(CH-WH-19),其基因组全长是14993 bp。同源性分析结果显示CH-WH-19与NADC30、JXA1、CH-1a、VR-2332和GM2的相似性分别为91.9%、84.3%、83.9%、83.3%和80.5%,但是与欧洲型的毒株Lelystad virus相似性仅有58.9%。GP5基因和全基因组的进化树分析显示,CH-WH-19与NADC30毒株处于同一分支。Nsp2基因氨基酸比对结果发现,CH-WH-19和NADC30毒株与VR2332毒株相比具有不连续的131个氨基酸缺失的特征。同源性和进化树的结果都显示了CH-WH-19属于新变异的类NADC30毒株。GP5序列比对结果表明,CH-WH-19有一些氨基酸的突变,A137是疫苗株VR2332的标志,但CH-WH-19毒株突变成了S,N34是四个潜在的N-糖基化位点之一,突变成了D。试验表明,本研究分离了一株变异的NADC30毒株,生物学特性分析也表明属于类NADC30毒株。     

犬细小病毒北京分离株的鉴定及其全基因组序列分析

首先对疑似犬细小病毒(CPV)感染的病犬粪便进行特异性PCR扩增,经目的片段测序分析,初步证明为CPV感染。将该病犬粪便处理物接种F81细胞,自第3代起,细胞出现典型CPE。对该株病毒进行电镜观察、理化特性试验、HA-HI及基因型等方面鉴定,证明该分离株为CPV,命名为CPV/BJ-L1株。该分离株的血凝效价为1∶512,其血凝性能被特异性抗体抑制;Reed-Muench法测定分离株病毒TCID_(50)为10-5.15/0.1 mL;电镜观察可见25nm左右的病毒颗粒;动物回归试验显示,攻毒犬能复制出CPV的典型临床症状和病理变化;对分离株的全基因组(包含两端完整的发夹结构序列)进行克隆、测序与分析。结果表明,BJ-L1为CPV-2a亚型,与GenBank中的21株CPV全基因序列核苷酸同源性为98.8%~99.8%,且与国内近期分离毒株高度同源。对2006-2014年北京市CPV分离株VP2基因进行序列分析,结果显示,CPV流行株的变异具有某种时间相关性。     

竹鼠源细小病毒分离鉴定及全基因组序列分析

【目的】了解并掌握广西地区竹鼠细小病毒(Bamboo rat parvovirus, BRPV)的生物学特性及遗传变异情况,为BRPV的防控提供理论依据和技术支撑。【方法】用养殖场患病死亡的竹鼠病料制备组织上清液,采用Vero细胞同步接毒法进行病毒分离,通过细胞病变观察、PCR、透射电镜观察及血凝试验等方法鉴定,设计合成特异性扩增引物对BRPV全基因组序列进行测序分析。【结果】分离获得的病毒可在Vero细胞上稳定生长增殖,感染细胞变长、变梭或成拉丝状;病毒纯化后经电镜观察可见呈立体对称、无囊膜、直径20～25 nm的病毒粒子;经PCR鉴定、凝集试验及全基因组测序表明,分离株为BRPV。本研究共获得3株BRPV(GenBank登录号：MF497824、MF497825、MF497826),毒株基因组全长约4 758 bp,全基因组序列比对发现,其与蝙蝠源细小病毒关系较近。BRPV基因编码氨基酸遗传特征与其宿主特异性有很强的相关性,NS1基因编码氨基酸变异与蝙蝠及大鼠源细小病毒更接近,与其处于同一分支,核苷酸相似性为96.9%～97.6%,氨基酸相似性为97.5%～98.4%。其中第257...     

1株鸡滑液囊支原体的分离鉴定与全基因组分析

鸡滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae,MS）能引起家禽呼吸道疾病、传染性滑膜炎、蛋壳顶端异常及生长迟缓等,给全球养禽业带来巨大的经济损失。然而不同国家和地区MS的耐药性和致病性存在差异,因此本研究旨在挖掘福建MS菌株的特征。作者采集福建省疑似患MS的病鸡关节腔内容物,对菌株进行分离鉴定,并利用三代联合二代测序技术对其进行全基因组测序。结果显示,该分离株病原特性稳定,已保藏至中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC No.：M 2021210,并将其命名为MS-FJ01。MS-FJ01基因组全长为795 381 bp,GC含量为28.39%;预测编码基因数为704个,占整个基因组的90.48%;并在COG、GO和KEGG数据库分别注释到476、382、425个基因。通过各数据库的分析,注释了40个耐药相关基因,4个碳水化合物相关酶基因,136个病原与宿主互作相关基因,47个毒力因子相关基因,106个膜转运蛋白相关基因,25个限制修饰相关基因。通过与MS HN01和MS 5-9基因组进一步比较发现,MS-FJ01与这两个中国菌株均存在良好的共线性关系,且与MS 5-9的亲缘关系更近。本研究阐明了福建MS菌株的基因组结构、通过相关数据库的分析,预测和注释了其基因的功能,为深入研究MS提供参考依据。     

牛病毒性腹泻病毒LN-1株的分离鉴定及基因组序列分析

【目的】查明并掌握辽宁地区牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)的流行特性及生物学特点,为BVDV的防治提供理论基础和技术支持。【方法】采集辽宁省某养牛场疑似发生BVDV感染的病死牛脾脏组织,用牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus, BRSV)、牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)及BVDV基因特异性引物进行RT-PCR鉴定,将组织液接种MDBK细胞分离病毒。对细胞进行细胞病变效应(CPE)观察后再通过电镜观察、间接免疫荧光试验(IFA)鉴定病毒,PCR扩增病毒全基因组序列并对其进行遗传进化分析。【结果】BVDV特异性引物RT-PCR鉴定结果为阳性,在280 bp处有条带,与预期条带大小相符,其余病原特异性引物未扩增出条带,证明未感染其他病原;分离得到的毒株在MDBK细胞中培养未出现明显细胞病变效应;病毒纯化后,...     

云南省蓝舌病病毒血清7型毒株的分离与基因组序列分析

2014年,我国广东省的哨兵牛上分离出蓝舌病病毒血清7型(B T V-7)毒株,但该血清型病毒在我国的流行情况尚不清楚,本研究旨在分离我国流行的BT V-7型毒株并掌握其遗传特征.作者在云南省景洪市勐罕镇设立哨兵牛,每周定时采血,并接种C6/36、B H K-21细胞分离虫媒病毒,通过病毒蚀斑试验与增殖曲线分析病毒在细...     

猪圆环病毒2型吉林分离株全基因组的克隆与序列分析

从吉林某猪场采集疑似患断奶仔猪多系统衰竭综合征死亡的猪体病料,进行猪圆环病毒2型(PCV-2)的分离;分离培养物经荧光标记的PCV-2特异抗体染色鉴定,并用PCV-2全基因组的特异性引物扩增,进行序列测定和分析。结果表明,从采集病料中成功分离出一株猪圆环病毒2型,并将此吉林分离株命名为PCV-2-JL11S,对其进行全基因测序,拼接结果显示,基因组全长为1 767bp;将分离株病毒的全基因组序列与14株GenBank已登录病毒进行比较,结果显示,核苷酸同源性最高可达99.2%;全基因序列系统进化树结果表明,分离株与HQ395057关系最近,而与HQ395037关系较远。上述结果表明,PCV-2吉林分离株存在一定的基因变异,而变异的发生原因尚需深入研究。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GZZJ201711株全基因组序列分析

为了解贵州省毕节地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因变异情况,于2017年从贵州毕节地区某疑似感染PRRSV猪群分离到1株PRRSV,将其命名为GZZJ201711毒株。采用RT-PCR分段扩增出PRRSV GZZJ201711株13个基因片段,分别连接到pMD19-T载体上进行测序,拼接后得到PRRSV GZZJ201711株全基因组长15 322 bp (去除polyA尾),包括5’UTR、ORFla-ORF7、3’UTR。序列分析表明,GZZJ201711株与欧洲型Lelystad virus(LV)株核苷酸同源性为60.3%,与美洲型毒株代表株ATCC VR-2332核苷酸同源性为89.2%,与HP-PRRSV(HUN4、JXA1、TJ)等毒株同源性在98.8%~98.9%之间。GZZJ201711株与高致病性毒株JXA1、HUN4、TJ属于同一小分支,其中与XJu-1、GDHY毒株遗传关系最近。GZZJ201711毒株的NSP2基因有30个氨基酸缺失,与JXA1、HUN4、TJ等HP-PRRSV毒株缺失位置一致。     

猪捷申病毒HB株的分离与全基因序列分析

为分析河北省某规模化猪场猪捷申病毒(PTV)的遗传变异和进化关系,作者成功分离到PTV HB株,对其进行了毒力测定和动物回归试验,设计引物进行了全基因序列测定,并与国内外42株PTV全基因序列进行了同源性比较。结果表明猪捷申病毒HB株病毒滴度为10-6.4 TCID50.mL-1,健康仔猪接毒28d后均出现明显猪捷申病症状,该毒株全基因组序列长度为7 090bp。系统进化树分析表明,猪捷申病毒HB株(JQ664746)属于PTV-8型血清型,和国内分离的PTV-jilin/2003株(GQ293092)同源性最高,从而为进一步研究该毒株的遗传变异提供参考。     

猪流行性腹泻病毒CH/GX/2015/750A株的分离鉴定及全基因组序列分析

本研究旨在获得可在细胞培养中稳定、有效生长增殖的猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）分离毒株,并对其全基因组序列进行测定分析。应用Vero细胞从广西腹泻仔猪肠道内容物中进行病毒分离,通过细胞病变和RT-PCR对细胞培养物进行鉴定,应用下一代测序技术对分离毒株全基因组序列进行测定。结果显示,成功分离到1株PEDV,命名为CH/GX/2015/750A。该毒株可稳定有效地在Vero细胞生长增殖,并引起典型的细胞病变;已在Vero细胞连续传代25代,病毒滴度随着传代次数的增加逐渐提高并稳定在10^7.50TCID₅₀/mL。该毒株全基因组序列长28 038 bp;与22个参考毒株的全基因序列比对显示,核苷酸同源性为96.8%~99.8%,其中与YC2014株同源性最高,为99.8%。全基因组和S基因系统进化分析显示,PEDV CH/GX/2015/750A分离毒株属于Ⅱa亚群,与YC2014、PEDV-WS等变异毒株亲缘关系密切。结果表明,本研究分离获得的CH/GX/2015/750A毒株是PEDV地方流行变异毒株。     

禽网状内皮组织增生症病毒的分离鉴定、全基因序列分析及致病性试验

本试验采集广东某鸡场疑似禽网状内皮组织增生症患病鸡病料并进行处理,经接种DF1细胞、聚合酶链式反应（PCR）及特异性间接免疫荧光试验（IFA）,分离鉴定出1株禽网状内皮组织增生症病毒（REV）,命名为 GD1210。依据已发表的REV前病毒全基因组序列设计并合成6对引物,采用分段扩增的方法完成了分离株的全基因组序列测定。结果显示,该分离株基因组序列全长8443 bp。将该分离株的基因序列与国内外各参考株相应序列进行同源性比对分析,与SNV株亲缘关系最近,核苷酸同源性最高。将该分离株感染1日龄SPF鸡以鉴定其致病性,结果显示该分离株使SPF鸡产生严重的免疫抑制作用。     

PRRSV HEB-2013株的分离与全基因序列分析

2013年9月从河北某发病猪场分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),将该毒株命名为HEB-2013株,在进行全基因组测序后发现,HEB-2013株基因组全长为15336 nt,包含9个开放阅读框,其中5’UTR长189 nt,3’URT长165 nt;随后将该毒株的全基因序列与NCBI上可查的历年华北地区PRRSV基因组序列进行了比对分析,发现其与2006年分离的TJ株同源性最高,为99.80%,而与2000年分离的BJ-4株同源性最低,仅为88.39%,进一步综合NSP2、GP3和GP5的氨基酸序列比对结果,系统分析了潜在毒力位点与病毒致病性的关系,并且提出了5个新的有可能与病毒致病性相关的潜在毒力位点。     

猪丁型冠状病毒CH/GX/1468B/2017的分离鉴定及全基因组序列分析

本研究于广西某猪场采集疑似感染猪丁型冠状病毒（porcine deltacoronavirus,PDCoV）的腹泻仔猪小肠及其内容物进行病毒分离,并通过细胞病变（CPE）、RT-PCR、间接免疫荧光（IFA）和全基因序列测定分析对分离的病毒进行鉴定。结果显示,试验成功分离到1株PDCoV,命名为CH/GX/1468B/2017（简称PDCoV 1468B）。该毒株可稳定有效地在LLC-PK细胞生长增殖,并引起典型CPE;该毒株已在LLC-PK细胞连续传代15代,病毒滴度随着传代次数的增加逐渐提高并稳定在10^8.10TCID₅₀/mL以上。该毒株全基因组序列长25 399 nt;与23个GenBank中登录的参考毒株的全基因组序列比对显示,核苷酸同源性为97.2%~99.4%,其中PDCoV 1468B分离毒株与Vietnam/Binh21/2015株同源性最高,为99.4%。全基因组系统进化分析显示,PDCoV 1468B分离毒株属于Ⅱ群,与东南亚国家PDCoV毒株亲缘关系密切,处于同一进化分支。综上所述,本研究成功分离出PDCoV 1468B株并进行了全基因序列分析,为进一步开展PDCoV致病性等生物学特性研究及疫苗研制奠定了基础,同时可为PDCoV的遗传进化提供数据支持。     

1株传染性法氏囊病病毒的分离鉴定及VP2基因序列分析

【目的】 研究1株传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）广西分离株的毒力特征及其与VP2基因序列特征的关系,为IBDV的流行病学研究和疫病防控提供参考。【方法】 通过PCR、鸡胚传代培养、DF-1细胞的适应培养及琼脂扩散试验等方法分离鉴定病毒,并扩增其VP2基因,利用Mega 7.0、MegAlign软件将其与其他不同毒力IBDV毒株进行核苷酸及氨基酸序列比对分析,并进行SPF鸡致病性试验,用实时荧光定量PCR方法测定IBDV拷贝数变化情况。【结果】 成功分离到1株IBDV毒株,命名为GX20210126株。该毒株接种SPF鸡胚可导致鸡胚出现出血、矮化和肝脏发黄、出血及针尖状坏死;且GX20210126对DF-1具有良好的细胞适应性,可引起显著细胞病变。琼脂扩散试验显示,该毒株具有良好的抗原性,病毒液能与IBDV阳性血清之间形成白色沉淀线。VP2基因进化分析显示GX20210126株与国际标准超强毒株在同一个大的分支上,氨基酸序列相似性在86.8%~99.6%之间,其中与UK661株相似性最高,为99.6%,仅有2处氨基酸位点发生改变,即D279N和I272T。以EID₅₀为10^-3.8/0.1 mL,0.5 mL/只的剂量点眼、滴鼻接种8日龄SPF鸡,攻毒后鸡出现羽毛蓬松、精神萎靡、拉白绿色水样粪便等临床症状,剖检可见肌肉、肝脏出血,肾脏尿酸盐沉积,法氏囊萎缩,IBDV拷贝数在感染后第5天达到峰值。【结论】 IBDV广西流行株GX20210126具有超强毒株基因序列特征,人工感染鸡群可导致IBDV典型临床症状和病理变化。