类器官的培养方法及应用前景

近年来随着体外建模领域研究的不断深入,发现细胞试验存在着细胞单一、难以模拟机体复杂的组织结构和正常生理、病理状态等缺点,以及动物试验的昂贵费用和相关生理伦理等问题,类器官逐渐成为科学家们关注的热点。类器官来源于机体自身组织及干细胞,是通过体外3D培养形成的具有原始组织及器官的三维结构细胞团块,在组织结构、细胞类型和功能等方面与来源组织高度一致。这种类器官模型的构建,不仅为替代再生组织及器官的研究提供更多方法,还在组织移植和修复等工作中发挥重要作用。作者主要对促进类器官成熟的培养方法进行介绍,详细阐述了微孔阵列法、微流体法、生物反应器法和水凝胶基质法4种方法,并回顾了有关类器官培养系统的历史演变,分析了近年来学者们在类器官研究领域中存在的诸多限制和未来挑战,以及类器官在新兴工程技术中的应用前景和展望,旨在为类器官培养方法的进一步完善及在相关领域的研究和应用提供更多的理论依据和新的思路。     

诱导性多能干细胞研究及临床应用

自从2006年研究者利用重编程技术发现诱导多能干细胞(iPSCs)以来,iPSCs一度成为科学家们在干细胞领域研究的热点,这是继胚胎干细胞(ESCs)之后又一能够进行自体细胞移植、组织工程学研究、药物筛选、药物安全性检测研究和体外疾病模型研究等方面得到广泛应用的细胞来源。目前iPSCs应用于临床实践还有一段距离,但因其在再生医学方面的优势,在临床应用上有很好的应用前景。     

肠道类器官的构建及其在畜禽营养和肠道健康研究中的应用

肠道类器官是由肠干细胞、多能干细胞或肿瘤干细胞在3D培养条件下自我更新、分化、组装而成的一种体外培养物,它包含多种类型肠道内皮细胞,能有效模拟肠黏膜功能,可以作为研究畜禽营养、肠道生理和肠道病理的体外模型。不同畜禽肠道类器官的分离、培养方法和条件存在差异,因此优化不同畜禽肠道类器官的构建方法并开展相关的生理、病理学机制探索是当前的研究热点之一。本文较为系统地介绍了畜禽肠道类器官的分类、特性及其分离、培养和鉴定的方法,并总结了近年来肠道类器官在畜禽营养与肠道健康相关研究中的应用,希望能为畜禽肠道类器官培养和相关研究提供参考。     

动物肠类器官培养技术

类器官被定义为三维(three-dimensional, 3D)多细胞体外自组装组织结构，在细胞类型、结构和功能方面能模拟还原相应的体内器官，具有明显的组织特异性，可作为新型体外模型。随着技术的发展，肠类器官已被应用于器官发育、器官功能、器官修复与移植、疾病诊断和药物筛选等多个研究领域。目前除了小鼠肠类器官外，关于其他种属动物肠类器官培养的研究较少。但在临床中，其他动物，特别是家畜动物仍存在多种传染性或非传染性的肠道疾病，亟待新型的体外模型用于揭示致病机理或开发新的治疗方案。为此，本文对近十年动物肠类器官培养的研究进展进行综述，总结了动物肠类器官培养的优、缺点并对动物肠类器官培养进行了小结与展望，以期为动物肠类器官的培养提供参考。     

浅谈糖尿病足的现代治疗

干细胞移植技术近年已应用到医学领域,所用干细胞有胚胎干细胞和成体干细胞两类。成体干细胞是指存在于体内多种分化成熟组织内,具有一定自我更新及分化潜能的幼稚细胞。造血干细胞,神经干细胞,肝脏肝细胞等,已应用于我国临床领域,对于糖尿病足的治疗,成体干细胞主要起血管再生作用,即在缺血肢体局部参与代偿性血管重建。对改善糖尿病足的预后具有重要意义。     

同源结构蛋白Nanog基因的研究进展

胚胎干细胞(ES细胞)可以从囊胚期内细胞团(ICM)或原始生殖细胞(PG)中分离得到,在体外能够无限的自我更新,且具有全能性,能够发育成各种不同功能的细胞[1-2].这种独特的性质使其在修复治疗、药物研究和再生医学等方面具有广阔的应用前景.     

农业动物肠道类器官研究进展

由干细胞自组建形成的肠道类器官（Intestinal organoids,IOs）是一种新兴的体外研究模型。这种多功能细胞组成的有机复合体能够高度模拟肠上皮组织,因此被广泛应用于肠道营养学、生理学、毒理学、病理学和药理学研究。近十年来,猪、鸡、牛、羊和兔等农业动物肠道类器官培养体系相继建立,有望成为推动营养素及功能性饲料添加剂活性评价和药物筛选及畜禽肠道疾病机制解析的新平台。文章简要概述IOs的结构和来源,重点结合实验室十年来开展猪肠道干细胞研究的工作经验,归纳总结农业动物IOs培养体系组成及其应用,旨在为IOs技术的应用推广提供指导。     

犬干细胞技术的研究进展及临床应用

干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞,以干细胞为基础的再生医学治疗是把健康的干细胞全身或局部移植到患犬体内,修复或替换受损的细胞或组织器官,从而达到治愈疾病的目的。本文对犬干细胞治疗犬的骨关节疾病、非感染性中枢神经系统炎症、1型糖尿病、假肥大性肌营养不良、炎症性肠病作一综述,为开展犬干细胞的相关研究和临床应用奠定理论基础。     

干细胞分化调控研究进展

干细胞具有自我更新和多向分化潜能,使之成为再生医学、组织工程和创伤修复等研究领域的热点。明确干细胞分化调控机制是干细胞应用的重要前提和理论基础,现对近期干细胞分化调控研究进展作一综述。     

精原干细胞研究进展

精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)具有自我更新和分化产生子代的能力,并且SSCs本身就是生殖细胞,能将遗传信息传递给下一代,是雄性成体内唯一可复制的二倍体的永生细胞。SSCs在有限时间内可在体外培养扩增,并且能定向诱导为特异性细胞,可以为探讨精子的发生机制,治疗雄性不育和胚胎干细胞建系提供一条新的途径。通过对SSCs的体外培养,为细胞移植提供足够的来源,再植入受体内,达到修复损伤、治疗疾病的目的,是临床医学、干细胞生物工程库和组织工程理想的种子细胞之一,在干细胞生物学、医学、畜牧业等领域具有重要价值。本文对SSCs的生物学特性、分离培养、分化潜能和移植技术等做一概述。     

猪精原干细胞体外分离培养及移植的研究进展

精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）位于睾丸曲细精管基底小室内,因其具有持续的自我更新能力和分化为精子的能力,被认为是雄性哺乳动物体内唯一能将自身遗传物质传递给后代的成体干细胞。对SSCs的研究已成为干细胞学科研究的热点之一,但目前SSCs的研究多集中于啮齿类动物,而猪SSCs（porcine SSCs,pSSCs）的研究进展相对落后,主要是由于存在以下几个问题：睾丸中pSSCs本身数量极少,且缺乏特异的分子标记;pSSCs的分离纯化技术仍不成熟;pSSCs体外培养体系仍不够完善。这些问题的存在导致pSSCs分离纯化效率低,并且难以在体外长期稳定培养及传代,以至于pSSCs的相关机理研究缺乏稳定的材料,为其体外研究及应用带来了不便。基于以上现状,文章总结了pSSCs体外分离培养及移植的研究进展,详细介绍了pSSCs的分子标记、分离纯化和体外培养的相关方法,以及pSSCs移植技术的研究现状,旨在为pSSCs研究提供参考,以期加快pSSCs在猪的遗传育种与繁殖领域以及男性生殖医学领域的研究和应用。     

西门塔尔牛牙龈间充质干细胞的分离鉴定及诱导分化

本研究旨在建立西门塔尔牛牙龈间充质干细胞（gingival mesenchymal stem cells，GMSCs）体外分离培养体系，并对其生物学特性进行探讨，为细胞治疗、再生医学等提供种子细胞。取14周龄西门塔尔牛牙龈，采用0.1%Ⅳ型胶原酶消化法分离GMSCs，进行体外培养和冷冻保存，测定冻存前后细胞活率，MTT检测法绘制GMSCs生长曲线；通过免疫荧光、流式细胞术和PCR等方法鉴定西门塔尔牛GMSCs特异性标记物（CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166和STRO-1），并通过体外成脂、成骨诱导检测其多向分化潜能。结果表明，西门塔尔牛GMSCs折光性强、贴壁后呈长纺锤形；冻存前和复苏后细胞的活率检测结果显示，细胞复苏后的活率均小于冻存前的活率，但均维持在85%以上，细胞生长曲线呈典型的"S"型；免疫荧光结果显示，西门塔尔牛GMSCs表达CD29、CD105和STRO-1，不表达CD31；PCR结果显示，西门塔尔牛GMSCs表达CD44、CD73、CD90和CD166，不表达CD34和CD45；流式细胞术结果显示，西门塔尔牛GMSCs高表达CD73（99.94%）、CD90（99.87%）和CD105（99.90%），几乎不表达CD34（1.16%）和CD45（1.18%）；成脂诱导分化后，可见大小不一的脂滴，脂滴可被油红O染色，且PCR检测结果表明其表达成脂关键基因过氧化物酶体增殖因子活化受体-γ（PPAR-γ）和脂蛋白酶（LPL）；成骨诱导分化后，可见被茜素红染色的矿化结节，且PCR检测结果表明其表达成骨关键基因Ⅰ型胶原蛋白（CollagenⅠ）和骨桥蛋白基因（OPN）。综上，本研究成功分离出西门塔尔牛GMSCs，建立了西门塔尔牛GMSCs体外分离、培养体系，并通过成脂和成骨诱导分化证明其具有多向分化潜能，结果可为再生医学和牙齿修复等研究提供参考。     

猪多潜能干细胞系的研究进展

猪多潜能干细胞是在体外建立起来的具有自我更新及三胚层分化潜能的一类干细胞,可应用于发育生物学研究、基因组编辑和疾病模型建立等各方面,在畜牧业生产及再生医学研究中具有重要的应用价值。培养体系对多潜能干细胞的成功构建具有重要意义,其包含多种成分,包括基础培养液、氨基酸等营养成分、小分子化合物(信号通路激活剂/抑制剂及细胞因子)共同维持细胞的多能性并抑制其分化。目前已有诸多关于猪多潜能干细胞的报道,但尚未获得高效的培养体系可以维持猪多潜能干细胞的长期传代并完成生殖嵌合。猪多潜能干细胞可分为原始态(Na6ve)、形成态(Formative)及始发态(Primed)3种不同多能性的状态特点,根据建系来源的不同分为猪扩展多潜能干细胞、猪胚胎干细胞、猪前原肠胚上胚层干细胞、猪诱导多能干细胞4种干细胞类型。作者综述了猪多潜能干细胞培养体系中常用的细胞因子和信号通路激活剂/抑制剂对猪多潜能干细胞的多能性和分化能力的影响和作用,为进一步建立具有真正生殖嵌合能力的Na6ve多能性的猪多潜能干细胞系提供研究思路。     

犬造血干细胞移植的作用机制及应用研究进展

造血干细胞(hematopoietic stem cell, HSC)位于造血系统的顶端, 是造血系统中唯一具有多能性和自我更新能力的细胞, 可以分化为各种功能的血细胞, 维持血液系统的建立和动态平衡, 是目前研究最为透彻、临床应用最为成熟的成体干细胞。造血干细胞的这些重要特性, 使得基于造血干细胞在治病机制研究和临床应用中的研究取得了很大进展。以造血干细胞为基础的再生医学治疗是目前治疗恶性血液病和遗传病的首选方法, 如造血干细胞治疗犬白细胞黏附缺陷综合征、犬遗传性贫血、犬淋巴瘤、犬白细胞减少症、犬X连锁严重联合免疫缺陷病等, 但由于白细胞抗原匹配的供体稀缺、可获得的造血干细胞数量有限等原因, 无法满足临床需求, 因此, 如何通过体外培养获得满足临床需要的造血干细胞成为近年来学者们研究的热点问题。作者参照现有研究成果对造血干细胞的来源和体外分离培养、治病机制进行系统的描述, 并对造血干细胞移植治疗遗传性溶血性贫血、白细胞黏附缺陷综合征、淋巴瘤、白细胞减少症、X连锁严重联合免疫缺陷病的临床研究进行综述, 以期为今后将造血干细胞广泛应用于临床治疗提供参考依据。     

文心兰组织培养及转基因研究进展

综述了文心兰组织培养及转基因研究的主要进展。外植体、培养基及其添加物、植物生长调节剂和培养方式对文心兰类原球茎或丛芽诱导均产生重要影响,大田植株的花梗、花芽、茎尖、根尖等均可用作初代培养的外植体,其中花梗及花芽为最常用的外植体,试管苗的所有组织器官均是有效的外植体;文心兰离体培养以固体培养方式为主,1/2MS、MS是用于文心兰离体培养最常用的基本培养基,培养基中植物生长调节剂种类、浓度及其配比是文心兰离体培养成功与否的关键因素。文心兰类原球茎形成过程是典型的体细胞胚胎发生发育过程,体细胞胚胎发生受植物生长调节剂、基因型、培养条件等影响较大。文心兰转基因研究尚处于初步阶段。     

柠檬苦素对小鼠卵母细胞体外成熟及其体外受精胚胎发育的影响

【目的】研究柠檬苦素(limonin,Lim)对小鼠卵母细胞体外成熟(IVM)及后续体外受精(IVF)胚胎发育潜能的影响,旨在为体外成熟培养系统的优化提供参考。【方法】在小鼠体外成熟培养液中添加不同浓度的Lim(0、10、20、50 μmol/L),成熟培养12 h后统计小鼠卵母细胞第一极体(PBI)排出率,筛选体外成熟培养液中添加Lim的最适浓度;在体外成熟培养液中添加最适浓度的Lim,以0 μmol/L Lim为对照组,成熟培养12 h,通过免疫荧光染色检测活性氧(ROS)、谷胱甘肽(GSH)以及线粒体膜电位(MMP)水平;通过实时荧光定量PCR检测卵母细胞抗氧化及凋亡相关基因的mRNA表达水平。将最适Lim组及对照组卵母细胞体外成熟24 h后进行体外受精,于体外受精24 h和3.5 d分别统计胚胎卵裂率和囊胚率,并用Fluorescein-dUTP和Hoechst 33342染色分别检测囊胚总细胞数及囊胚内凋亡细胞比率。【结果】与0 μmol/L Lim组相比,20 μmol/L Lim组小鼠卵母细胞PBI排出率显著升高(P＜0.05),后续试验均用20 μmol/L Lim进行处理。与对照组组相比,20 μmol/L Lim组小鼠卵母细胞内ROS水平显著降低(P＜0.05),GSH、MMP水平均显著增加(P＜0.05),抗氧化相关基因(GPx3、CAT和Prdx3)、抗凋亡相关基因(Bcl-2、Bcl-xl)表达水平均显著上调(P＜0.05),促凋亡相关基因(Caspase-3)表达水平显著下调(P＜0.05);体外受精胚胎的卵裂率、囊胚率、囊胚总细胞数均显著增加(P＜0.05),囊胚内细胞凋亡比率显著下降(P＜0.05)。【结论】在体外成熟培养液中添加20 μmol/L Lim可以通过抑制氧化应激和细胞凋亡、增加MMP水平提高小鼠卵母细胞质量,从而提高体外受精胚胎的发育潜力。     

高通量SNP芯片在牛体外早期胚胎染色体质量鉴定中的初步应用

旨在基于高通量SNP芯片建立一种可评估牛早期胚胎染色体质量和生产性能的方法,为胚胎牛育种提供技术支撑。本研究通过胚胎切割技术分别对荷斯坦奶牛体内囊胚(n=27)、体外囊胚(n=21)、体外2细胞胚胎(n=6)和8细胞胚胎(n=5)进行切割取样并统计发育率,其中体内囊胚组分为1/2体内胚组(切取半个胚胎)和体内滋养层(trophoblast cells, TE)组(切取体内胚胎少量TE),体外囊胚组、体外2和8细胞胚胎分别为体外TE组(切取体外胚胎少量TE)、体外2细胞(切取体外2细胞胚胎的1个卵裂球)和8细胞组(切取体外8细胞胚胎的1个卵裂球)。切割取样后进行全基因组扩增(whole-genome amplification, WGA),对扩增成功且DNA量大于1 000 ng的样品进行SNP芯片检测,芯片检出率大于90%的进行生产性能评估,低于90%的进行染色体片段缺失分析和数据填充。结果显示：1)切割部分TE后,体内TE组剩余部分和体外TE组剩余部分继续培养24 h后的发育率分别为(94.4±5.6)%和(90.5±6.6)%,而1/2体内胚组剩余部分的发育率显著降低,仅为(22....     

SIRT1对牦牛卵母细胞体外成熟与老化的影响

旨在探索SIRT1在牦牛卵母细胞体外成熟与老化过程中的作用。本研究在体外成熟液中分别添加SIRT1特异性激动剂SRT2104（SRT组）和特异性抑制剂Inauhzin（INZ组），牦牛卵丘卵母细胞复合体（COCs）体外培养24 h后，观察卵丘细胞的扩展和第一极体的排出情况；利用免疫荧光检测体外培养24与36 h后卵母细胞内的ROS水平；采用实时荧光定量PCR法检测体外培养24与36 h后卵母细胞内SIRT1、FOXO3a、SOD2以及Bax的表达水平；体外培养24与36 h后的牦牛卵母细胞进行体外受精，观察并统计其卵裂率与囊胚形成率。结果显示，体外培养24 h，SRT组的卵丘细胞扩展程度显著高于对照组（P<0.05），而INZ组的卵丘细胞扩展程度和第一极体排出率显著低于对照组（P<0.05）。随着体外培养时间的增加，卵母细胞内的ROS水平显著增加（P<0.05）；添加SRT2104能显著抑制卵母细胞中ROS水平的积累（P<0.05），而添加Inauhzin则显著上调卵母细胞内的ROS水平（P<0.05）。体外培养24 h后，SRT组SIRT1、FOXO3a与SOD2的表达水平显著高于对照组（P < 0.05），但Bax的表达水平显著降低（P<0.05）；INZ组的SIRT1、FOXO3a与SOD2表达均显著低于对照组（P<0.05），但Bax的表达水平显著上调（P<0.05）。牦牛卵母细胞体外培养24 h后，SRT组的卵裂率与囊胚形成率显著高于INZ组和对照组（P<0.05）；卵母细胞体外培养36 h后，INZ组的卵裂率和囊胚形成率显著低于其他组（P<0.05）。综上表明，SIRT1参与了牦牛卵母细胞的体外成熟，在体外培养液中适当添加SIRT1激动剂，有利于卵母细胞体外成熟及缓解老化，同时改善早期胚胎的发育能力。     

体外精子发生培养方法研究进展

近1个世纪以来,科研人员致力于研究在体外培养的条件下产生具有功能的精子。直到近几年,研究人员才成功利用体外组织培养的方法获得了具有受精能力的精子。体外研究精子发生的方法主要有组织培养法和体外培养分离细胞的方法,结合两种方法将分离的生殖细胞移植到睾丸组织中进行组织培养。作者回顾了体外精子发生的培养方法,为临床应用和阐明精子发生机制的基本问题提出相关见解。     

体外血脑屏障模型的构建及致脑膜炎粪肠球菌对其的影响

试验旨在探索致脑膜炎粪肠球菌对体外血脑屏障功能的影响，寻求稳定的构建体外血脑屏障损伤模型的方法。选用1周龄ICR小鼠进行原代脑微血管内皮细胞（BMEC）分离并通过BMEC特有的凝血因子Ⅷ（coagulation factor Ⅷ，Factor Ⅷ）进行荧光标记，鉴定分离的细胞并判定分离率。选用1~3日龄ICR小鼠分离星形胶质细胞并通过其特有的胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）对进行荧光标记，鉴定分离的细胞并判定分离率。将原代细胞传至3代，用Transwell二维小孔分别构建单层BMEC和BMEC与星形胶质细胞共培养的血脑屏障模型。选用致脑膜炎粪肠球菌、非致脑膜炎粪肠球菌和大肠杆菌DH5α感受态细胞分别与构建的体外血脑屏障模型共培养，评估致脑膜炎粪肠球菌对体外血脑屏障模型的穿透性。通过4 h渗透试验、荧光素钠通透性试验和血脑屏障损伤相关标志基因基质金属蛋白酶2（MMP-2）表达量的检测，评估致脑膜炎粪肠球菌对体外血脑屏障模型的影响。结果显示，试验成功分离到BMEC和星形胶质细胞，纯度分别达90%和95%以上。细菌穿透试验结果显示，所选的3株细菌只有致脑膜炎粪肠球菌可穿越体外血脑屏障模型。4 h渗透试验和荧光素钠通透性试验结果显示，共培养模型优于单层BMEC模型。与其他组相比，构建的体外血脑屏障与致脑膜炎粪肠球菌共培养组荧光素钠的穿透力更高，MMP-2基因的表达量明显上升。综上，BMEC与星形胶质细胞共培养的模型优于单层BMEC模型，致脑膜炎粪肠球菌可穿越体外血脑屏障模型，并介导体外血脑屏障损伤，本试验结果为揭示致脑膜炎粪肠球菌对体外血脑屏障损伤机制提供了理论依据。