基于重测序技术的塔河马鹿特异性SNP位点筛选

【目的】 筛选出塔河马鹿高质量的单核苷酸多态性位点(SNP),构建特异性分子遗传标记,为塔河马鹿的纯种鉴别提供参考。【方法】 对国家特种经济动物资源共享平台1999年收集整理的32份塔河马鹿血液DNA样本进行全基因组重测序,与梅花鹿染色体级别的参考基因组进行比对,统计比对率、覆盖度和测序深度。用SNPEff统计每条染色体上SNP位点的分布,用SNPhylo基于位点构建分子进化树,用VCFTOOLS计算遗传分化指数(Fst),按降序排序并设定阈值Fst≥0.25,淘汰不符合条件位点,用R语言进行主成分分析(PCA),统计33条染色体排名前1 500的SNPs位点,提取前100个SNPs集合的特征值,分别进行主成分分析。【结果】 全基因组重测序结果表明,32份质检合格的塔河马鹿血液基因组DNA有效数据量为868 791 354 600 bp,测序质量均符合后续数据分析要求。32份样品测序数据的平均比对率为98.06%,平均覆盖度为97.66%,平均深度为6.787。过滤后得到20 139 122个高质量的SNPs位点,其中4号染色体上SNPs分布最多,90%以上的变异位于基因间和外显子区域。建树后候选特异性SNPs位点数为12 050 781个。使用VCFTOOLS筛选得到544 717个SNPs位点。选取每条染色体排名前1 500的SNPs位点进行主成分分析,主成分分析结果显示,当SNPs从49 500降至100时区分效力没有下降,最终筛选出100个特异性强、稳定性高的塔河马鹿SNPs位点。【结论】 通过全基因组重测序技术和生物信息学分析得到了100个塔河马鹿特异性SNPs位点,为塔河马鹿的纯种鉴别以及核心种质的筛选工作提供了理论依据。     

SNP分子标记的研究及应用

SNP作为一种新的遗传标记，越来越受到世人的关注。本文主要介绍了SNP的概念、特点、检测分析技术、存在的问题及应用前景。     

SNP分子标记及其应用

SNP（single nucleotide polymorphism，SNP），即单核苷酸多态性，主要是指由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换．以及单碱基的插入／缺失等。在SNP之前有过两代遗传标记：①限制性片段长度多态（restriction fragment length polymerphisms，RFLP），为20世纪70年代中后期建立起来的标记系统，在整个基因组中确定的位点可达100，000以上；②微卫星多态（microsatellite polymorphisms），     

基于GBS技术对梅花鹿、马鹿及其杂交后代基因组SNP特征的分析

旨在利用基因分型测序（genotyping by sequencing,GBS）技术对梅花鹿、马鹿及其杂交后代（F1、F2）基因组的SNP特征进行分析。本试验采用GBS技术对梅花鹿（63个）、马鹿（12个）及其杂交后代（F1代112个,F2代38个,未知类型个体1个）共226个个体的血液基因组DNA进行测序,并利用本实验室前期110只梅花鹿、197只马鹿和1只F1代杂交鹿的测序数据,以梅花鹿全基因组为参考序列进行比对分析。结果,226个个体共产生Clean data 322.683 Gb,平均每个样品1 427.802 Mb;将所有样本作为一个群体检测SNP变异,共检测出SNP位点23 943 582个,质控过滤后得到SNP位点31 630个。对31 630个SNPs使用最大似然（maximum likelihood,ML）法构建的分子进化树显示,梅花鹿、马鹿、F1及F2代区分明显。对梅花鹿和马鹿的SNPs进行比对分析,筛选出可用于鉴别马鹿、梅花鹿、F1、F2的物种特异SNP位点1 032个（马鹿特异SNP位点474个,梅花鹿特异SNP位点558个）,计算结果显示,F1代个体包含马鹿特异SNPs的比例主要在40%~60%之间,F2代个体含马鹿特异SNPs的比例主要在10%~30%之间,马鹿个体中不含梅花鹿的特异SNPs,梅花鹿中55.49%的个体不含马鹿特异SNPs,17.34%的个体含马鹿特异SNPs的比例低于1%,13.29%的个体含马鹿特异SNPs的比例在1%~10%之间,其余个体含马鹿特异SNPs的比例为10%~20%（其中有一个个体含马鹿特异SNPs的比例为33.3%）。该研究为花马杂交鹿后代的鉴定提供了可靠标记,并定量估计了F1和F2代个体含马鹿特异SNPs的比例,马鹿个体中不含梅花鹿的特异SNPs,这对梅花鹿、马鹿及其杂交后代（F1、F2）的鉴别具有重要意义。     

奶山羊低密度液相SNP芯片开发及有效性验证

为更好地了解奶山羊在世代更替中的遗传谱系,避免因错误谱系记录造成群体近交程度过高,本研究利用液相SNP芯片标记技术确立羊群遗传谱系及其亲缘关系。通过简化基因组测序,对25个不同种群的崂山奶山羊基因组DNA样本进行分析,挑选出1 792个SNP多态性位点,再通过靶向测序基因型分型,合成低通量的探针,最后对探针进行相应的捕获测试,开发出检测崂山奶山羊遗传基因的低密度液相SNP芯片。将该液相芯片应用于300只崂山奶山羊群体的血缘关系鉴定,与已知300只奶山羊系谱记录的亲缘关系进行对比,发现结果高度吻合,证明此芯片具有很高的准确性。本实验开发出均一性高、位点多态性好的低密度液相芯片技术,可专门用于崂山奶山羊亲缘关系鉴定,从而更好地指导奶山羊的选种选配。     

基于SNP标记的滩羊亲子鉴定研究

旨在筛选可用于滩羊亲子鉴定的部分SNP标记,对羊群的保种和繁衍具有重要意义。本试验以宁夏盐池地区的159只滩羊为研究对象,利用600K基因芯片进行SNP测定,通过主成分分析了解样本的遗传背景,依据系统进化树划分家系,最后进行亲子鉴定研究。结果显示,大多数滩羊之间遗传背景相近,系统进化树将其划分为5大家系;亲子鉴定筛选到了211个高质量SNPs,单亲累积排除概率超过99.99%,具有很高的准确性和可靠性;父权鉴定结果表明,在95%置信水平下,观测鉴定率为79%,80%置信度下,观测鉴定率达到87%。在有结果的子代中,大部分真实亲本在疑似父本中找到,即非系谱记录的父本,说明场内应加强系谱管理,尽量避免错误的发生。     

天山马鹿起源与分子进化的研究

马鹿(Cervus elaphus)属偶蹄目鹿科鹿亚科,又名红鹿、赤鹿、白臀鹿.马鹿由梅花鹿分化而来,与梅花鹿亲缘关系非常近,在自然条件下可与梅花鹿杂交延续后代.     

东北马鹿的妊娠期

对８个年度有关３个养鹿场的２５３头东北马鹿的母鹿妊娠天数进行整理统计,东北马鹿的妊娠天数为２４２．９３±４．０４ｄ,其中母鹿怀公仔时妊娠天数为２４３．４８±３．８１ｄ,怀母仔时为２４２．３８±４．２７ｄ,比怀公仔时少１ｄ。对所有数据采用两因素处理不等重复资料最小２乘分析,推断差异不显著（Ｐ＞０．０５）。     

鸭不同品种特异性分子标记SNP的筛选与鉴定

为开发和鉴定鸭品种特异性分子标记,试验选取樱桃谷鸭、北京鸭、枫叶鸭、金定鸭、绍兴鸭、山麻鸭、高邮鸭7个群体共56只鸭通过Illumina Hi Seq 2500平台进行了重测序,筛选出686个存在于特定群体中的单核苷酸多态性突变(SNP)和插入缺失标记(INDEL),并随机选取了7个SNP位点进行PCR验证,结果完全符合预期,说明通过二代测序筛选出的特异性SNP可以作为鸭品种鉴定的分子标记。     

基于分子粪便学的马鹿性别鉴定方法研究

粪便DNA分析技术因其对研究对象零伤害而越来越受到研究者的青睐。本试验以粪便为研究材料,对马鹿进行性别鉴定。结果表明,该方法能够准确、快速、高效地进行马鹿性别鉴定。本研究将为其他野生动物性别鉴定提供一种更加科学的方法,从而进一步促进分子粪便学在濒危野生动物研究中的应用。     

梅花鹿与欧洲马鹿染色体水平基因组的比较研究

旨在从基因组层面揭示梅花鹿与欧洲马鹿的起源进化,找到与进化过程相关的信号通路并与表型进行关联.本试验以成年雌性梅花鹿与成年雄性欧洲马鹿染色体水平基因组作为研究对象,利用比较基因组学的方法对梅花鹿和欧洲马鹿基因组进行染色体共线性分析,获得两个物种间基因组序列的同源关系和基因组发生的染色体倒位现象,并对被倒位截断和在倒位内...     

塔里木马鹿结核病的诊治

2007年新疆某规模马鹿场部分马鹿发病,仔鹿多表现为消瘦、食欲下降,营养消耗性死亡;成年鹿多表现为咳嗽、喘气、体温升高、突然喘气死亡。通过病理解剖,细菌培养,接种动物等方法确诊该鹿场马鹿死亡原因是感染了牛型结核分枝杆菌,说明牛型结核分枝杆菌可以感染马鹿。     

塔里木马鹿微卫星遗传多样性与产茸量的相关性研究

利用7个微卫星遗传标记,采用PCR扩增,12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、Sanguinetti银染法显色,对新疆塔里木马鹿亚种遗传多样性进行检测,统计各群体的等位基因组成、平均有效等位基因数(E)和平均基因纯合率(Rh),根据等位基因频率计算出各群体的平均遗传杂合度(h)、多态信息含量(PIC)和群体间的遗传距离,利用分子进化遗传分析软件(MEGA),采用邻结法(NJ)重建系统发生树。根据等位基因频率,利用PHYLIP(3.6)分析软件,采用最大似然法(ML)构建系统发生树,应用自举检验(bootstrap test)估计系统树中节点的自引导值(bootstrap value),并进行了系统发生分析。同时对部分马鹿群体个体基因型与产茸量之间进行了相关分析。结果表明:7个微卫星位点在3个塔里木马鹿中的多态信息含量除BMS2508和Celjp0023没有多态性,以及BM5004为中度多态外,其他4个微卫星均为高度多态,可作为有效的遗传标记用于3个塔里木马鹿群体遗传多样性和系统发生关系的分析。所有马鹿群体的平均PIC为(0.5196)、h(0.5552)和E(2.45),其基因多态性和遗传多样性相对丰富。塔里木马鹿35团群体与沙雅群体的血缘关系及遗传距离近于阿拉尔群体,3个塔里木马鹿群体的系统发育关系基本符合其地理分布和育成史。微卫星位点BM4208的166bp/185bp基因型和微卫星BM888的208bp/208bp基因型可以对塔里木马鹿35团群体高产茸量进行分子遗传标记。     

马鹿X/Y精子分离及人工授精技术研究

对马鹿X/Y精子进行分离、冷冻保存和人工授精,探讨马鹿鲜精保存运输、精子分离以及性控冻精的受胎及后代性别控制准确率.结果表明:①马鹿鲜精中加入三联抗生素、18℃恒温保存最有利于精子活力的保持.②马鹿鲜精死精率与X/Y精子分离速度有明显相关性,死精率越低,分离速度越快.③来自同一马鹿供体的3组样品分离精子解冻后活力(0.61 vs 0.60 vs 0.65)及4 h时活力(0.30 vs 0.30 vs 0.32)无显著差异(P>0.05).④应用马鹿性控冻精对80只发情母鹿进行子宫角深部输精,有55只母鹿妊娠期满产下仔鹿,情期受胎率67.5%,均为雄性,性别控制准确率100%.结论:分离马鹿X/Y精子的冷冻保存、人工授精,在技术上已达到产业化应用水平,通过进一步改善后,可以大规模推广应用.     

马鹿染色体核型分析

采用常规细胞遗传学分析手段，对青海省西宁动物园饲养的马鹿染色体核型进行分析，结果：马鹿染色体数目为２ｎ＝６８，染色体臂数ＮＦ＝７０（♀）、７１（）；常染色体类型为２条中（Ｍ）着丝粒，６４条近端或端（Ａ）着丝粒；性染色体类型Ｘ为近端（Ａ），Ｙ为近中（ｓＭ）着丝粒；公母鹿核型式为６８，ＸＹ和６８ＸＸ。     

利用Y染色体SRY基因分析马鹿的父系起源和遗传多样性

试验旨在从分子水平上研究中国马鹿的父系起源结构和遗传多样性水平,判断各种群间的系统发育关系和亲缘关系远近。通过DNA提取、PCR扩增和直接测序的方法,对天山马鹿、阿尔泰马鹿、塔河马鹿、东北马鹿等11个群体共159头马鹿的SRY基因序列进行了检测和分析,计算碱基组成、核苷酸多样性（Pi）、单倍型多样性（Hd）以评估遗传多样性,构建单倍型网络图;以白唇鹿为外群,用邻接法（NJ）和最大似然法（ML）构建系统进化树,探讨马鹿的聚类及遗传多样性。结果显示,所获序列长度为1 615 bp,在基因中共鉴定出18个SNPs多态性位点,占核苷酸总数的1.11%,根据多态性位点鉴定出14个单倍型,优势单倍型为Hap-1,所占频率35.84%,为天山马鹿、阿尔泰马鹿、阿拉善马鹿、塔河马鹿、东北马鹿、甘肃马鹿、北美马鹿和高产鹿王种群的共有单倍型。其中,阿拉善马鹿、塔河马鹿、甘肃马鹿、川藏马鹿、北美马鹿和高产鹿王均具有独有单倍型。单倍型多样性介于0~0.857,核苷酸多样性介于0~0.00272,各亚种间遗传距离最大的是塔河马鹿与西藏马鹿（0.002406）,最小的是阿拉善马鹿与青海马鹿（0.000124）。基于邻接法和最大似然法构建的系统进化树一致,显示11个野生马鹿种群间共存在3个分支,支系S1包含全部马鹿种群,塔河马鹿、甘肃马鹿、北美马鹿和高产鹿王构成支系S2,北美马鹿构成支系S3,单倍型最小网络图与系统进化树一致。表明各马鹿种群之间的遗传多样性存在差异,塔河马鹿、高产鹿王和甘肃马鹿分别存在2个父系类型,北美马鹿存在3个父系类型,其他马鹿种群只存在1个父系类型,Hap-1在单倍型组S1中处于核心位置,其他单倍型分散分布于其周围,推测Hap-1为马鹿种群中较为原始的单倍型。     

梅花鹿茸和马鹿茸中牛磺酸的测定

根据牛磺酸的分子结构特性,设计一个２１ｍｉｎ短程序利用氨基酸自动分析仪分析梅花鹿茸、马鹿茸各部位中牛磺酸各部分的含量。在牛磺酸浓度为１００ｎｍｏｌ／ｍＬ时,峰位和峰面积的变异系数分别为０１２％和１３５％（ｎ＝６）。对不同浓度的牛磺酸加标回收实验,回收范围为９６８％～１０１６％,表明本法准确可靠、快速、简便。     

阿拉善马鹿冬季肠道菌群组成的性别差异

肠道菌群对于动物消化及健康有着至关重要的作用,但在性别差异上的研究仍然有限。本研究通过高通量测序技术对贺兰山阿拉善马鹿(Cervus elaphus alashanicus)的20个粪便样本进行多样性分析,雌雄各半,并讨论性别因素对肠道菌群的影响。结果表明,阿拉善马鹿雌雄肠道菌群的多样性及结构均存在差异,且雌性肠道菌群的多样性更高。菌群构成的门水平上,雄性肠道菌群的优势菌门为厚壁菌门(Firmicutes 49.47%)和疣微菌门(Verrucomicrobia 14.21%),雌性肠道优势菌门为厚壁菌门(54.47%)和变形菌门(Proteobacteria 54.41%)。在属水平上,雌雄肠道菌群的优势菌属都为孢杆菌属(Sporobacter),含量为(雌性:6.79%,雄性:7.97%),拟杆菌属(Bacteroides),含量为(雌性:3.87%,雄性:4.42%),NMDS分析及LEfSe分析表明,性别因素对阿拉善马鹿雌雄肠道菌群的影响存在显著差异(P<0.05)。本研究表明性别因素对阿拉善马鹿冬季肠道菌群的多样性及构成存在影响,可为深入研究性别因素对阿拉善马鹿肠道菌群的影响提供依据。