中国黑茶对PPARs的作用研究

选用茯砖茶、花砖茶、青砖茶、黑砖茶、六堡茶、普洱茶六种黑茶,并以沱茶、米砖茶为对比材料,研究黑茶对PPARδ及PPARγ两种核受体模型的激活能力。结果显示,黑茶具有良好的激活PPARγ及PPARδ核受体作用,且黑茶中的PPAR核受体激活作用组分用热水即可浸出。因此,黑茶在降脂减肥、调节糖代谢、抗动脉粥样硬化等方面具有一定的作用。     

茯砖茶中几种单体成分功效的高通量筛选研究

选择与降脂减肥作用相关的FXR、LXR、PPARδ、PPARγ及3T3-L1模型对从茯砖茶中分离制备的6个单体化合物进行高通量药物筛选研究。结果表明,各单体对所选模型均有活性。对于FXR激活模型,没食子酸(GA)和表儿茶素没食子酸酯(ECG)在50μg/ml的初筛浓度时激活值分别达1.766和3.220;表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)在10μg/ml和50μg/ml的初筛浓度时激活作用均较强,特别是50μg/ml的初筛浓度时,其激活倍数达6.000;对于PPARδ模型,此三种单体添加量均需达50μg/ml,作用才显著。在初筛浓度为30μg/ml时,没食子儿茶素(GC)对PPARγ模型的激活倍数达1.619;3-甲氧基-4,5-二羟基苯甲酸(MDBA)对PPARγ模型的激活倍数达1.734;3,4-二羟基苯甲酸(DBA)对FXR抑制值为3.641,明显小于对照初级胆汁酸鹅脱氧胆酸(CDCA)的抑制值6.435,因此其抑制模型的作用非常明显。以上试验结果说明此6个化合物均为活性化合物。     

调控橡胶树法尼基焦磷酸合酶基因转录因子的初步筛选

为研究橡胶树中法尼基焦磷酸合酶基因(Hb FPS)的表达调控机制,采用酵母单杂交技术筛选了胶乳中与Hb FPS启动子结合的蛋白因子。将Hb FPS启动子与报告质粒p HIS2.1连接构建诱饵质粒p His-FPS,经筛选确定抑制背景表达的3-氨基三唑(3-aminotriazole,3-AT)浓度为10 mmol/L。同时以橡胶树胶乳m RNA为模板合成双链c DNA,并将双链c DNA、线性化的p GADT7Rec2载体和诱饵质粒p His-FPS共同转化酵母菌株Y187,两载体共转化效率为1.7×106 cfu/μg。筛选共得到阳性克隆36个,获得31条序列。对获得的c DNA序列进行生物信息学分析,得到2个转录因子序列,分别为类乙烯响应转录因子ERF003和Hb LMYC2。结果为进一步研究Hb FPS表达调控机制奠定基础。     

高粱花叶病毒Hcpro、CP和PIPO基因酵母双杂交载体构建及自激活验证

采用同源克隆技术获得侵染甘蔗高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)的Hcpro、CP、PIPO基因片段.将该基因片段连接至pGBKT7载体,分别构建酵母双杂交诱饵载体pGBKTT-Hcpro、pGBKT7-CP和pGBKTT-PIPO,经PCR、酶切及测序鉴定,证明重组诱饵载体构建成功后,将重组质粒导入Y2H Gold酵母菌株,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用.结果表明,含重组诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性.含重组诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Leu、SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His营养缺陷平板上不能生长,表明重组诱饵质粒表达产物对ADE2、HIS3报告基因无自激活作用.研究结果为下一步利用酵母双杂交系统检测与高粱花叶病毒Hcpro、CP、PIPO蛋白相互作用的甘蔗蛋白提供基础.     

甘蓝型油菜胚胎特异启动子pBnaA09g21960D的分析

为筛选甘蓝型油菜胚胎特异性表达启动子,以甘蓝型油菜冬性品种Darmor的叶片基因组为模板,克隆了Bna A09g21960D基因上游990bp的启动子序列。顺式调控元件的预测分析表明,该启动子除具有核心调控元件TATA box和CAAT-box外,还含多个组织特异性、激素、逆境、光合作用等表达相关的顺式作用元件,如ABRE、GCN4_motif、TGACG-motif等。为了验证该基因启动子的表达模式,构建了由其驱动GUS报告基因的植物融合表达载体DX2181-p Bna A09g21960D,并采用农杆菌介导的花序浸染法转化野生型拟南芥。对筛选和鉴定的阳性转基因株系进行GUS组织化学法染色,结果表明GUS活性在拟南芥胚胎中特异表达,而在其他组织和器官均未表达,这表明p Bna A09g21960D具有驱动GUS报告基因在拟南芥种子胚胎中特异表达的潜质。这为该启动子在转基因技术提高油菜品质方面和人工创建种质资源等方面的应用提供了较好的基础。     

与水稻黑条矮缩病毒p5b互作的水稻基因片段筛选

 由水稻黑条矮缩病毒基因组S5片段第2个开放阅读框（ORF）编码的p5b是一个功能未知的病毒非结构蛋白。构建了酵母双杂交体系的含水稻cDNA表达文库的pGADT7载体,同时将p5b 基因构建到诱饵质粒pGBKT7上（pGBK p5b）,Western Blot和自激活实验结果显示p5b可在酵母中正确表达且无自激活活性。进一步利用p5b蛋白作为诱饵用酵母双杂交筛选水稻cDNA表达文库,鉴定出一些参与光合作用、呼吸作用等重要代谢过程的关键酶基因片段,这些酶可能与p5b蛋白之间存在相互作用,推测这些互作在病株症状发展过程中起作用。     

中国黑茶对FXR及LXR核受体的作用

选用茯砖茶、花砖茶、青砖茶、黑砖茶、六堡茶、普洱茶六种黑茶,并以沱茶、米砖茶为对照材料,研究黑茶对FXR核受体及LXR核受体的活性。结果显示,黑茶具有良好的FXR核受体活性,同时,普洱茶还具有很好的LXR核受体活性;而沱茶乙酸乙酯洗脱组分具有增加FXR受体敏感性的作用。因此,黑茶具有调节胆固醇及糖代谢,有较好的抗代谢综合症活性。     

普洱茶功能成分单体降糖降脂作用研究

本文选取与糖脂代谢相关的PPARδ、PPARα、PPARγ、FXR、LXR、3T3-L1和α-淀粉酶模型,探讨了普洱茶中单体功能成分尿嘧啶、没食子酸的降糖降脂作用。结果表明:尿嘧啶、没食子酸在PPARγ、FXR、LXR模型表现出明显的活性作用,其中尤以没食子酸对PPARγ的激活效果最为显著,其值高达2.438,与阳性对照药物的激动效果相当,而对PPARδ、PPARα、3T3-L1模型的活性作用较弱。在PPARγ模型中,没食子酸对PPARγ受体的激活作用强于尿嘧啶,而在FXR、LXR模型中尿嘧啶的活性作用要强于没食子酸。此外,没食子酸对α-淀粉酶也有较强的抑制作用。本研究结果可为普洱茶的降糖降脂作用机理提供一定的理论依据。     

槟榔碱和铜离子络合物抗溶血作用研究

模拟嚼食槟榔的口腔环境,在碱性条件下初步研究槟榔碱与一定浓度的Cu2+联合抑制家兔红细胞溶血的机理。结果表明,在碱性条件下,一定浓度的Cu2+和槟榔碱共存能明显抑制家兔红细胞溶血,并与模型存在极显著差异(p0.01)。UV扫描结果表明,碱性条件下,Cu2+在5~100μmol/L范围内和槟榔碱反应在268 nm左右出现了一个新峰且该新峰的吸收值随Cu2+浓度的增加而逐渐增加,说明二者相互作用并有新的络合物产生。SOD活性评价结果表明,该络合物具有SOD活性,能够清除邻苯三酚自氧化产生的超氧阴离子,并且与模型存在极显著差异(p0.01)。     

茯茶中"金花"孢子粉提取物对体外诱导的非酒精性脂肪肝细胞内甘油三酯代谢的影响

建立非酒精性脂肪肝细胞模型,研究茯茶中"金花"孢子粉提取物对非酒精性脂肪肝细胞甘油三酯代谢的影响,筛选出具有降脂功效的活性组分,为茯茶的深度开发及"金花"孢子粉降脂成分的分离纯化提供一定的指导.以正常人肝细胞LO2为实验对象,采用脂肪乳剂加入细胞培养液培养肝细胞,建立非酒精性脂肪肝细胞模型;以MTT法筛选出提取物最佳作...     

高通量筛选法对普洱茶降血糖血脂作用的研究

利用高通量筛选法寻找普洱茶降血糖血脂作用的活性成分的研究。实验以SMMC-7721细胞为模型,确定普洱茶各样品的合适筛选浓度为50μg/ml,并以此浓度对激活PPARα、PPARδ、PPARγ受体的活性进行筛选。结果发现,普洱茶醇提物对PPARδ受体有激活作用,有潜在的降血糖和降血脂作用的可能。     

香蕉条斑病毒ORFⅠ、ORFⅡ酵母双杂交系统诱饵质粒的构建及鉴定

以连接在pMD-18T载体上的香蕉条斑病毒(BSV)全基因组为模板，PCR扩增得到了带有GatewayR重组反应接头序列的香蕉条斑病毒ORFⅠ及ORFⅡ基因片段，经过BP、LR重组后，构建成带有目的片段的酵母双杂诱饵质粒pDEST32-O1及pDEST32-O2。将质粒转化E.coli DH5α感受态细胞，筛选序列和编码框均正确的重组质粒。将以上2种正确的重组质粒分别与用于构建诱饵质粒的pDEST22空质粒共转化酵母MaV203感受态细胞，利用营养缺陷培养基(SC-Leu-Trp)筛选转化子，并对转化子进行毒性鉴定、自激活鉴定以及3-AT抑制浓度鉴定。结果显示，2种转化子均生长正常，说明所构建的2个重组质粒表达蛋白对酵母无毒性作用，其在特异营养缺陷培养基(SC-Leu-Trp-Ura)中无法生长，不能产生自激活现象，3-AT抑制浓度分别为50、75 mmol/L。以上结果说明所构建的2种诱饵质粒均可用于后续酵母双杂工作，为BSV与宿主的蛋白互作奠定了基础。     

香蕉ROP1基因酵母双杂交体系的诱饵载体构建及毒性与自激活效应检测

用PCR技术获得香蕉ROP1基因片段,构建酵母双杂交系统表达载体pGBKT7-ROP1,测序正确后将重组质粒导入AH109酵母菌株,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用.结果表明,用PCR技术获得了正确的ROP1基因片段,并正确构建了ROP1基因的酵母双杂交表达载体,并转化到AH109酵母菌株中,含诱饵载体的AH109在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,说明表达产物对酵母细胞无毒性,含诱饵载体的AH109在His、Trp二重营养缺陷平板上不能生长,说明对报告基因无自激活作用,为下一步利用酵母双杂交系统筛选与ROP1蛋白相互作用的蛋白奠定基础.     

黑茶初制中主要酶类的变化

运用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合活性测定,分析了黑茶初制中多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)同工酶谱及纤维素酶(CEL)、果胶酶(PEC)和蛋白酶(PRO)活性的变化。结果表明,在传统渥堆过程中,由于微生物的代谢活动而分泌了不同于鲜叶内源酶的多酚氧化酶、纤维素酶、果胶酶和蛋白酶等胞外酶,为茶叶中儿茶素的氧化,纤维素的分解,蛋白质和果胶的水解等提供了有效的生化动力,证明微生物酶促作用在黑茶特征性品质风味形成中具有重要的作用。     

苎麻纤维素含量近红外预测模型的建立与探讨

本文旨在探讨用近红外光谱技术建立预测模型快速测定苎麻中纤维紊含量的可行性.以80个样品组成校正集采用偏最小二乘法(PLS)建立近红外光谱信息与纤维素含量之间的定量预测模型,该模型的相关系数为0.9726.利用该模型对22个样品的纤维素进行预测,预测值与化学测定值之间的平均相对误差为1.17%.结果表明,利用近红外光谱技术建立预测模型可以快速测定苎麻纤维素含量,对苎麻育种和优质资源的筛选利用具有重大意义.     

红麻酮脂酰辅酶A合成酶(KCS)酵母双杂交诱饵载体构建及自激活检测

酮脂酰辅酶A合成酶(KCS)是超长链脂肪酸合成过程中的限速酶,参与超长链脂肪酸和蜡质的合成,在植物抗旱和应对生物胁迫反应中发挥重要调控作用。研究采用PCR方法从红麻中(茎皮)分离KCS基因片段,将该基因按正确方式插入酵母双杂交表达质粒pGBKT7中,酶切鉴定正确后,用PEG/Li Ac方法转化酵母MaV203,经抗性筛选后,用X-Gal对转化酵母进行自激活检测。结果表明,KCS基因的DNA结合结构域与酵母GAL4转录因子的上游激活位点(UAS)结合,可激活报告基因半乳糖苷酶的表达。经删除KCS基因DNA binding区域后重新转化酵母,结果表明,不携带KCS基因DNA binding区域的截短蛋白可以作为诱饵蛋白来研究与之相互作用的蛋白。     

水稻叶片特异性不表达启动子pOsMTG3的克隆与表达分析

利用水稻基因芯片筛选到1个在水稻孕穗期和抽穗期穗中的相对表达量明显高于苗期、孕穗期和抽穗期叶片中相对表达量的基因Os MTG3,该基因在孕穗期穗中受低温、干旱诱导上调表达,而在抽穗期穗中受低温诱导下调表达。把该基因ATG密码子上游1.8kb左右的DNA片段预测为启动子区,并将其命名为p Os MTG3。用PCR技术克隆该启动子,并以GUS基因作为报告基因,在水稻中分析了该启动子在不同时期不同组织中的表达特性。GUS组织化学染色分析表明:p Os MTG3启动子能启动GUS基因在水稻根、芽、茎、穗中表达,而不能启动GUS基因在叶片中表达,是一个全新的叶片特异性不表达的启动子。     

黑茶渥堆(堆积发酵)过程中微生物种群的变化

采用传统渥堆与无菌渥堆法,对黑茶初制中微生物数量及其优势菌群进行了分析。结果表明,黑茶渥堆过程中,微生物在一定温湿条件下,以茶叶为基质,进行大量繁殖,并通过其代谢活动对黑茶特征性风味的形成起着重要的作用。参与作用的主要微生物有:假丝酵母菌属(Candida)中的种类,黑曲霉(Aspergillus niger),青霉属(Penicillium)及其他少数霉菌,无芽孢短杆菌,芽孢细菌和球菌等。在渥堆过程中,叶温的升高、pH 值下降及含水量的变化,都是微生物新陈代谢活动的结果。茶坯含水量的高低对渥堆中微生物的     

大豆GmPHD3基因的克隆及逆境表达分析

为探讨大豆PHD-finger转录因子家族编码基因GmPHD3在抵抗中国南方高温高湿非生物胁迫造成种子劣变过程中的调控作用,分离全长GmPHD3基因并进行生物信息学分析、亚细胞定位和转录激活活性分析,以种子劣变抗性品种湘豆3号和不抗品种宁镇1号叶片及不同组织cDNA为材料,通过RT-PCR,进行组织表达模式分析和高温高湿胁迫下的表达模式分析。生物信息学分析结果表明基因CDS序列长度为738 bp,编码246个氨基酸,包含Alfin和PHD-finger 2个结构域。进化树结果表明该基因与木豆ALFIN-Like 3-like(XM_020363358.1)的遗传距离较近。亚细胞定位结果显示该蛋白在细胞核内表达。转录激活试验结果表明基因全长有转录激活活性,激活域为N端Alfin结构域,C端PHD-finger结构域无转录激活活性。组织表达模式分析发现该基因主要在成熟期高表达,且2个品种间存在差异。胁迫下的表达模式分析发现随着胁迫时间的延长,基因的表达量逐渐升高。研究结果为进一步阐明高温高湿胁迫下的调控机制研究奠定一定理论基础。