茶叶微生物固态发酵中咖啡碱降解途径初探

为探究微生物作用下咖啡碱的降解产物与途径,将普洱茶发酵中筛选鉴定的Aspergillus sydowii NRRL250（聚多曲霉）、Aspergillus pallidofulvus NRRL4789、Aspergillus sesamicola CBS137324和Penicillium mangini CBS253.31等优势菌株分别接种至晒青毛茶进行单菌种固态发酵,并采用高效液相色谱（HPLC）测定咖啡碱、可可碱、茶碱的含量,探究微生物对咖啡碱代谢的影响;另外,基于UHPLC-QTOF-MS代谢组学技术,以灭菌处理组（ST组）和原料组（RM组）为对照,对聚多曲霉接种发酵样进行代谢组学分析。结果表明,A. pallidofulvus NRRL4789、A. sesamicola CBS137324和Penicillium mangini CBS253.31等优势菌株对咖啡碱等嘌呤类碱代谢均无显著影响,而在聚多曲霉接种发酵中,咖啡碱含量显著下降（P<0.05）,降幅达83.89%;茶碱含量显著增加（P<0.05）,发酵末期含量为(25.03±1.17) mg·g^-1;而可可碱保持基本稳定。由此可知,聚多曲霉对咖啡碱降解代谢有显著影响。采用UHPLC-QTOF-MS方法检出茶碱、3-甲基黄嘌呤、1,7-二甲基黄嘌呤等9种与咖啡碱降解相关的代谢物。在聚多曲霉作用下,茶碱、3-甲基黄嘌呤、1,7-二甲基黄嘌呤、7-甲基黄嘌呤含量显著提高（P<0.05）。茶碱、3-甲基黄嘌呤、1,7-二甲基黄嘌呤和1-甲基黄嘌呤与咖啡碱及其相关代谢物的N-脱甲基化途径相关。1,7-二甲基尿酸、1-甲基尿酸与咖啡碱相关代谢物的氧化途径相关。由此可知,聚多曲霉为降解普洱茶咖啡碱的优势菌株,且具有将咖啡碱转化为茶碱的潜在能力;在咖啡碱降解代谢过程中,存在聚多曲霉作用下的N-脱甲基化和氧化,并以N-脱甲基化为主。     

可可茶经济性状评价

可可茶CamelliaPtilopyhllaChang是中山大学张宏达教授在进行茶树分类时发现的一个新菜种，其主要特征是内含物中咖啡碱含量较少，而可可碱含量比其他茶种高出许多。可可碱在某些药理、保健功能上都优于咖啡碱。茶叶植物含嘌呤类生物碱主要有咖啡碱、可可碱和茶叶碱三种。这些嘌呤碱的含量是决定茶叶品质因素之一。传统的饮用茶都以咖啡碱为主，并含有微量的可可碱和茶叶碱，而可可茶是以可可碱含量为主的茶叶植物。这种茶叶在其原始分布地区为当地农民所世代饮用。本文就其经济性状进行调查分析，探讨其开发利用的可能性。可可茶的野生树…     

茶叶中嘌呤碱的薄层分析法

茶叶中含有多种嘌呤碱,以咖啡碱含量最高,约占茶叶干重的1—5%;其次是可可碱和茶碱,分别约占茶叶干重的0.05%和0.002%。由于这几种嘌呤碱在化学结构上极为相似,而其含量却差异悬殊,就使得它们的同时分离测定难度较大。近年来,随着色层分离技术的发展,相继出现了茶叶中嘌呤碱分离测定的柱层析法、液相色谱法等。作者采用薄层扫描法分离测定绿茶中的嘌呤碱,也获得了比较满意的结果。     

茶树体内咖啡碱生物代谢研究进展

咖啡碱是由嘌呤核苷酸衍生的次生代谢产物,通常占茶叶干重的2%～4%,是茶叶苦味品质的主要贡献成分。茶树中的咖啡碱主要分布在幼嫩的芽叶中,并随芽叶的老化而逐渐减少。咖啡碱在茶树中的主要合成途径为:黄苷→7-甲基黄苷→7-甲基黄嘌呤→可可碱→咖啡碱,N-甲基转移酶在此过程中起着重要的作用。本文从茶树中咖啡碱的含量分布、生物合成与分解代谢途径以及相关基因的表达研究进行综述,并展望其发展前景。     

国外茶叶文献摘要(二十四)

0134 茶树中黄嘌呤核苷向咖啡碱的转化Osamu NEGLSHL等给离体茶芽饲喂~14C标记的甲基蛋氨酸,黄嘌呤核苷和7—甲基黄嘌呤核苷。在饲喂后的初期,便有约10％的甲基蛋氨酸的甲基参入7—甲基黄嘌呤核苷。在24小时内,便有约50％的黄嘌呤核苷的放射活性通过7—甲基黄嘌呤核苷、7—甲基黄嘌呤和可可碱而     

茶叶中咖啡碱、茶碱、可可碱的高效液相色谱分离测定法

本文报道了茶叶中咖啡碱、茶碱,可可碱的高效液相色谱分离测定方法的研究结果,进行了反相 HPLC 分离的条件试验.考察了流动相二甲基甲(月先)胺、甲醇、醋酸浓度及其与水的比例对上述3种嘌呤碱色谱行为的影响。结果表明,该法分离效果好,操作简便,重现性好,分析结果准确,咖啡碱、茶碱和可可碱的检出限分别为8.4×10~(-9)g,7.5×10~(-9)g和5.0×10~(-9)g,变异系数在0.99%—10.22%范围内。     

低pH沉淀法检测茶叶中的结合咖啡碱

探讨了低pH沉淀法检测茶叶中结合咖啡碱的可行性和优势,旨在为更精确地定量茶叶中的咖啡碱提供理论参考。研究以绿茶水提物、红茶水提物和普洱茶(熟茶)水提物为材料,应用低pH沉淀法检测了试样中的结合咖啡碱含量,并结合氯仿萃取法对检测结果进行了验证。结果表明,低pH沉淀法能够准确、简便地检测茶叶中的结合咖啡碱,其中普洱茶(熟茶)水提物中的结合咖啡碱含量最高(含2.59%),而绿茶和红茶水提物中只有极少量的咖啡碱为结合态(含量分别为0.04%和0.07%)。     

茶树体内黄嘌吟核苷到咖啡碱的转化

将用~(14)C标记的甲硫氨酸、黄嘌呤核苷和7—甲基黄嘌呤核苷喂饲离体茶树新梢。在摄取后的培养初期,甲硫氨酸的甲基基团就被结合进7—甲基黄嘌呤核苷(约10%)。在24小时内就约有50%的黄嘌呤核苷的放射性经 7—甲基黄嘌呤核苷,7—甲基黄嘌呤、3、7—二甲基黄嘌呤(可可碱)迅速结合进咖啡碱。7—甲基黄嘌呤核苷也以高速率转化成咖啡碱。本研究结果提出咖啡碱的生物合成途径如下:黄嘌呤核苷→7—甲基黄嘌呤核苷→7—甲基黄嘌呤→3、7—二甲基黄嘌呤(可可碱)→咖啡碱。     

茶叶中咖啡碱和可可碱的电泳—扫描定量测定

咖啡碱、可可碱是茶树体内嘌呤碱代谢的主要形式,与茶树体内碳氮代谢和茶叶品质密切相关。茶叶中咖啡碱的测定已有许多方法,本文着重介绍咖啡碱与可可碱的同时测定。由于采用了纸电泳分离和扫描定量,使得本方法具有微量、快速和准确的优点。     

茶叶咖啡碱生物合成能力的季节性变化

常绿茶树的嘌呤代谢与其他多数有机体不同,因为它具有一从嘌呤核苷酸到咖啡碱的特殊代谢途径。尽管在花等器官中观察到咖啡碱,其生物合成主要在叶片中。茶叶咖啡碱含量的季节变化已有报道,茶叶的嘌呤代谢在年周期中似乎有相当大的波动。本研究检测了茶叶嘌呤代谢的季节性变化,并测定了咖啡碱生物合成中几个关键酶的活性。结果表明:咖啡碱在早期发育阶段(4～6月)的茶丛叶片中,由腺嘌呤核苷酸合成,合成速率看来主要取决于N-甲基转     

不同种类微生物对普洱茶发酵过程的影响

为阐明微生物在普洱茶发酵过程中作用机制,进行了普洱生茶单菌发酵实验,通过跟踪不同菌种对普洱茶发酵过程中感官品质和理化指标的影响,发现不同微生物对普洱茶发酵的作用,并对优势菌种进行混菌发酵实验,以期为工业化微生物发酵普洱茶提供理论和数据支持。结果表明,普洱茶发酵过程中,叶色由黄绿变为猪肝色,茶汤的苦涩感逐渐减弱,汤色红浓明亮,理化成分中茶多酚和水浸出物含量均减少,茶褐素和咖啡碱含量增加,且霉菌对这些成分的影响最大,酵母次之,细菌最小。混菌发酵茶样20d即具有普洱熟茶的品质。结果证明采用合理配比微生物发酵普洱茶可以缩短发酵时间,而且能更好地控制和规范普洱茶的发酵趋势和结果。     

绿茶茶汤混菌发酵过程中内质成分的变化

利用从普洱茶中分离的优势种群黑曲霉H-15和酵母菌P1接种绿茶茶汤进行混菌发酵,对发酵过程中茶汤内质成分的变化规律进行分析。结果表明,发酵过程中咖啡碱和茶多酚总量变化较小,但儿茶素各组分的含量变化较大,其中酯型儿茶素GCG、ECG、EGCG的含量快速降低,ECG、EGCG在30h后不能检出,GCG在40h后不能检出,发酵60h后,非酯型儿茶素EGC、DL-C、EC和GA含量显著增加,增幅分别达到589.9%、26.5%、139.9%和219.4%,氨基酸含量减少75.9%,可溶性总糖减少15.2%,pH由发酵前的4.93降至3.25。     

外源接种黄曲霉污染普洱茶安全性研究

以云南普洱茶为实验材料,外源接种黄曲霉(Aspergillus flavus)菌株于普洱茶原料及成品中,设未接种菌株普洱茶为对照,分别置于室温,湿度80%、温度30℃,湿度90%、温度30℃的恒温恒湿箱条件下存放,在第7天、14天、21天、28天分别取样以LC-MS/MS检测法进行黄曲霉毒素检测。检测结果表明,所有受试茶样中均未检测到黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2,检出率为0。说明无论是室温还是在高温高湿条件下,被黄曲霉污染的普洱茶,经存放后,不会产黄曲霉毒素,就这一点而言普洱茶具有较高的饮用安全性。     

普洱茶中真菌种群的分离与分子鉴定

采用平板稀释法以孟加拉红(DRBC)和18%的甘油琼脂(DG18)两种培养基对60个普洱茶样品中的真菌种群进行了分离,种群分离结果显示:样品中真菌种群数量变化值范围为1.6×103～1.16×105cfu/g;应用分子生物学的手段,对分离到的71株真菌做了分子鉴定,鉴定结果表明:这些真菌分别属于19个属,40个种,主要是曲霉属13种,青霉属7种,其他属20种。数量上占优势的真菌种群是酵母和曲霉属的不同种。这些真菌的安全性有待进一步评估。     

普洱茶样中“金花”微生物的分离鉴定

＂金花＂是茯砖的品质特征,部分普洱茶样品也有＂金花＂,但是对普洱茶中＂金花＂微生物研究较少。本文从1个类似＂金花＂的普洱茶样品中,分离出4株真菌,经形态观察和ITS序列同源性搜索比对鉴定为塔宾曲霉（Aspergillus tubingensis）、伞枝犁头霉（Lichtheimia corymbifera）、阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami）和黑附球菌（Epicoccum nigrum）。在自制的普洱茶砖上接种阿姆斯特丹散囊菌,茶砖表面也长出类似的＂金花＂,表明该普洱茶样品的＂金花＂是阿姆斯特丹散囊菌的闭囊壳。     

氟对黑茶中的冠突散囊菌和黑曲霉生长的影响

用单孢子接种,分别通过固体平板培养与液体培养,测定氟对分离自黑茶的6株冠突散囊菌和1株黑曲霉生长的抑制率、菌体生长速率和菌丝生物量,研究氟对各菌株生长的影响。结果表明：6株冠突散囊菌在含氟2 000 mg/L、黑曲霉在含氟1 800 mg/L的固体培养基中能生长。100 mg/L剂量的氟对冠突散囊菌生长的抑制率为0.76%~10.24%,对黑曲霉的抑制率达35.71%。随氟浓度的增加,生长速率变小,抑制率增大。液体培养中,100 mg/L的氟对冠突散囊菌与黑曲霉菌丝生物量的抑制率分别为34.47%、80.59%。冠突散囊菌的子囊孢子与黑曲霉的分生孢子对氟具有较强的耐受性,且两种培养方式表明冠突散囊菌比黑曲霉更耐氟。     

不同有益菌固态发酵对普洱茶香气成分的影响研究

采用同时蒸馏萃取法(SDE)提取有益菌固态发酵普洱茶的香气成分,经气质联用分析鉴定,探讨了授权专利有益菌种（绿色木霉Trichoderma viride Pers.ex Fr.、黑曲霉Aspergillus niger van Tieghem、少根根霉Rhizopus arrhizus Fischer、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae）固态发酵对普洱茶香气成分的影响。结果表明,绿色木霉固态发酵共分离鉴定出13种化合物,占总检测量的53.66%,其中萜烯醇类化合物及其衍生物含量最高,占33.5%;黑曲霉固态发酵共分离鉴定出18种化合物,占总检测量的74.77%;少根根霉固态发酵共分离鉴定出19种化合物,占总检测量的54.19%;酿酒酵母固态发酵共分离鉴定出19种化合物,占总检测量的59.15%。黑曲霉、少根根霉固态发酵的普洱茶甲氧基苯及其衍生物含量最高,分别占31.24%、24.04%;酿酒酵母固态发酵的普洱茶萜烯醇类化合物及其衍生物与甲氧基苯及其衍生物含量都比较高,分别达21.89%、24.07%。感官审评表明,绿色木霉发酵的普洱茶滋味醇厚回甘,香气陈香透花-木香;黑曲霉发酵的普洱茶滋味醇厚,陈香透花果香;少根根霉发酵的普洱茶滋味醇厚甘滑,陈香浓;酿酒酵母发酵的普洱茶滋味醇和甘滑,香气陈香较显。     

茯砖茶发花微生物生物学特性研究

在探明湖南省冬夏两季茯砖茶发花期间真菌种群的生长特性及演替规律的基础上,试验对分离鉴定的27株真菌微生物开展了不同培养基、碳源、氮源、温度等生物学特性研究,探讨不同菌株菌丝生长及产孢的情况。结果表明,所有的发花微生物均能在茶汁培养基上生长,在不同碳、氮源的培养基上以单糖、二糖和有机氮源为碳、氮源的培养基上菌丝生长较快且利于产孢,发花微生物生长的最适温度为25~30℃,超过30℃或低于25℃将会抑制生长。但不同发花微生物个体之间又存在着一定差别,表明不同季节茯砖茶发花微生物的种类和演变规律与发花微生物自身的生物学特性存在着紧密联系。     

从湖北青砖茶渥堆过程中分离真菌总状枝毛霉菌的鉴定与模拟发酵研究

对从青砖茶发酵堆中纯化分离的主要微生物进行鉴定。采用平板梯度稀释法对发酵茶渥堆中的微生物进行纯化分离;选取1株菌株LC-2利用分子生物学手段结合形态学鉴定等方法进行分类鉴定;并用高浓度冷冻菌粉对小鼠进行灌胃试验,检测急性毒理效果;最后对菌株LC-2进行青砖茶固态模拟发酵效果验证。结果表明,真菌LC-2菌落形态与显微形态与总状枝毛霉菌（Mucor racemosus Fres）相似,分子鉴定结果与总状枝毛霉菌（Mucor racemosus Fres）同源性最近,因此确定为总状枝毛霉菌（Mucor racemosus Fres）。菌粉灌胃未见对动物造成急性毒理损害。利用该菌株发酵生产的青砖茶汤色红黄,香气甜香略青,滋味绵软略甜,与传统工艺生产的青砖茶品质无大差异。由此证明该菌株确实是参与青砖茶渥堆发酵过程的重要菌株,并可以利用于未来青砖茶自动化发酵过程。