茶树CsASR基因的克隆及其表达分析

逆境胁迫影响茶树生长发育及茶叶品质,ASR(abscisic acid,stress,ripening-induced)基因在植物抗逆响应中具有重要功能。本研究以龙井43品种茶树为材料,从中克隆了CsASR基因的全长cDNA序列、基因组序列及其启动子序列,分析了该基因的生物信息学特征及在组织间和不同胁迫处理下的表达模式。结果显示,CsASR的cDNA序列全长875 bp,含有546 bp的ORF序列,编码181个氨基酸,蛋白质分子量19.89 kD,理论等电点5.69;CsASR蛋白结构序列中74.5%的序列为无序结构,是一种无序蛋白;CsASR的C-端含有ABA/WDS功能结构域,主要定位于细胞质和细胞核中;茶树CsASR与海枣的ASR相似性最高,为87%,而在进化树中与枣的关系最近。CsASR基因含2个外显子,第1个外显子长363 bp,第2个外显子长183 bp,内含子较大为2 750 bp,内含子中含7种简单重复序列和2种DNA转座子序列。克隆获得起始密码子ATG上游2 554 bp的启动子区序列,该启动子上含有干旱、低温、高温以及ABA等相关的顺式作用元件。CsASR在根中的表达量最低;ABA抑制CsASR的表达,而干旱、NaCl和低温胁迫能够显著上调CsASR的表达。表明CsASR基因可能与茶树抗逆密切相关。     

茶树DNA去甲基化酶基因的全基因组鉴定及表达分析

DNA去甲基化酶(dMTase)是主动去甲基化过程中具有糖基化酶和脱嘌呤裂合酶活性的双功能酶.基于茶树基因组数据,本研究利用生物信息学方法对茶树DNA去甲基化酶(CsdMTase)编码基因进行了全面鉴定和序列分析.全基因组鉴定结果表明,舒茶早基因组中包含4个CsdMTases,系统进化分析将CsdMTases分为DME...     

茶树NUDIX基因家族的鉴定及表达分析

NUDIX水解酶属于焦磷酸酶,在信息传递、植物生长协调和响应逆境胁迫等方面起着重要作用。基于茶树(Camellia sinensis)基因组鉴定出43个NUDIX家族基因,并运用生物信息学和实时荧光定量PCR等方法对其分析。结果表明,43个CsNUDXs蛋白质分子量介于11.8～89.2 kDa,氨基酸长度为102～342个,理论等电点为4.49～9.26,18.6%的蛋白为稳定性蛋白;根据进化关系将CsNUDXs分为6个亚家族;启动子顺式作用元件分析发现CsNUDXs具有许多与激素响应、逆境胁迫和生长发育等调控相关的作用元件;对CsNUDXs家族基因在不同器官表达模式进行分析,发现CsNUDX3、CsNUDX7在果实中表达量较高,而CsNUDX22、CsNUDX25在果实中表达量极低,CsNUDX30在老叶中表达量极低;不同处理组的实时荧光定量PCR结果表明,1 mmol·L^-1茉莉酸甲酯(MeJA)处理下CsNUDX1、CsNUDX2和CsNUDX33等表达量呈现先升后降再升的趋势,而1 mmol·L^-1水杨酸(SA)处理下CsNUDX4...     

大麦DUF668家族基因鉴定及表达分析

DUF668家族基因对植物逆境胁迫响应有重要作用。为探讨大麦DUF668家族基因的结构及表达模式，采用生物信息学的方法对大麦DUF668基因结构、蛋白结构、系统进化树、共线性及表达模式进行了分析。结果显示，供试大麦中共鉴定出9个DUF668基因，分布在5条染色体上。系统发育进化树将9个DUF668基因分为三个亚组，第Ⅰ亚组包括HvDUF668-01、HvDUF668-02和HvDUF668-09，内含子数量较多，均有11个内含子；第Ⅲ亚组包括HvDUF668-04、HvDUF668-05、HvDUF668-07和HvDUF668-08，内含子数0~3个，其中HvDUF668-04与HvDUF668-05没有内含子；第Ⅱ亚组包括HvDUF668-03和HvDUF668-06，内含子数量（9和7）介于第Ⅰ亚组和第Ⅲ亚组之间。蛋白保守基序分析表明，9个蛋白均含有DUF668保守结构域的特征序列及DUF3475保守结构域的特征序列（HvDUF668-06除外）；第Ⅰ亚组蛋白的Motif数量（8~10个）比第Ⅱ、Ⅲ亚组（4~6个）多，且包含第Ⅱ、Ⅲ亚组中的所有Motif。表达谱分析表明，不同DUF668基因在不同组织和发育时期的表达量存在差异，HvDUF668-09在颖果中的表达量随着颖果的发育而升高，而HvDUF668-01和HvDUF668-02则相反；HvDUF668-01和HvDUF668-02在花序中的表达量随着花序的发育而升高。qRT-PCR结果显示，受黄矮病病毒侵染大麦幼苗与未受侵染幼苗相比，HvDUF668-04、HvDUF668-05和HvDUF668-08表达量提高了100~180倍。     

茶树CsLHTs亚家族基因的克隆与表达分析

氨基酸是茶叶的重要品质成分和氮素贮存形式,因此开展茶树体内氨基酸转运蛋白的研究尤为重要。本研究从茶树转录组中筛选得到5条茶树LHTs(Lysine histidine transporters,赖氨酸/组氨酸转运蛋白)家族基因序列,并从龙井43中成功克隆获得4个茶树LHTs基因,分别命名为CsLHT1、CsLHT6、CsLHT8.1和CsLHT8.2。对该亚家族编码的氨基酸序列的理化性质和功能结构进行预测,结果显示CsLHTs亚家族含有9~11个跨膜区;且含有与氨基酸转运相关的结构域。为了明确在不同茶树品种和氮素水平间CsLHTs基因的表达差异,本研究选用3个茶树品种的扦插苗为试验材料,水培条件下氮饥饿两周后,分别用0.2、2、10mmol·L^-1的NH4NO3进行处理。利用qRT-PCR分析了CsLHTs在不同组织间的表达情况,结果表明4个基因在茶树营养组织中均有表达。经氮素处理后,CsLHTs基因在3个氮素水平和3个品种中呈现出不同的变化规律。CsLHT1、CsLHT6和CsLHT8.2在品种间的表达差异程度高于不同氮素水平间的基因表达差异。CsLHT8.1对氮素处理有明显的响应,尤其经0.2mmol·L^-1和10mmol·L^-1的NH4NO3处理72h后,在氮高效品种中茶302根中呈上调表达,表明CsLHT8.1可能参与氨基酸由根部向地上部的转运过程。     

茶树抗逆相关基因ERF的克隆与表达特性分析

对利用cDNA-AFLP技术所获得的茶树低温诱导差异表达片段TDF,通过RACE方法获得含完整编码区序列的茶树ERF基因cDNA克隆,其开放阅读框编码212个氨基酸,包含一个保守的结构域AP2/ERF,与多种植物ERF蛋白具有高度同源性。qRT-PCR分析表明,茶树ERF基因受低温、乙烯、脱水、NaCl等上调表达,最大表达量分别是诱导前的121.1、22.6、2.6和2.2倍。在不同组织器官中,茶树ERF基因在转录水平上存在显著差异,成熟叶片中表达最高,其次是芽,而根和茎中表达量较低且相当,花和种子中表达极低。推测该基因在茶树响应非生物胁迫中发挥重要作用以及在组织中的表达受到严格控制。     

茶树CsAAPs亚家族基因的克隆与表达分析

采用RT-PCR技术,从龙井43中成功克隆了5个茶树AAPs（Amino acid permeases,氨基酸通透酶）基因。氨基酸序列比对结果表明,5个CsAAPs亚家族蛋白的序列同源性较高,为70.27%。根据氨基酸序列同源性构建系统发育树,结果显示5个CsAAPs分属3组。生物信息学分析表明,CsAAPs均含有9~10个跨膜区域和16~18个AAP保守基序。为了研究该亚家族对氮素的响应情况,选用3个茶树品种的扦插苗为试验材料,氮饥饿两周后,分别供应不同浓度的NH₄NO₃,然后利用qRT-PCR对CsAAPs在不同组织、氮素水平及茶树品种中的表达情况进行分析。研究发现CsAAPs在营养组织中均有表达,但是存在一定的组织表达差异,其中CsAAP3在茎中表达量最高,CsAAP8的主要表达部位为根和茎。在给氮素饥饿处理的茶苗从新供氮之后,CsAAP3的基因表达在3个氮素利用效率不同的品种间差异较大;在氮高效品种中茶302茎中表达的CsAAP3和CsAAP8,可以快速地对低氮条件做出响应,在低氮处理3 h后,基因表达水平明显增加。此研究预示着CsAAPs亚家族在茶树体内可能通过复杂的氨基酸转运参与氮代谢调控。     

茶树生长素受体基因CsTIR1的克隆与表达分析

吲哚-3-乙酸（又称IAA或生长素）,在植物生长发育中具有重要的调控作用,其作用主要通过信号转导途径来完成。生长素受体是其信号转导的关键元件之一。本研究通过RACE克隆,获得了茶树中生长素受体CsTIR1基因的cDNA全长序列（NCBI登录号：JX050147）。CsTIR1序列全长2β315βbp,含1β746βbp的完整开放阅读框,编码581个氨基酸,预测分子量65.18βkD,理论等电点（pI）5.64。茶树CsTIR1与烟草TIR1的相似性最高达82%,亲缘关系最近。CsTIR1含有1个F-box结构域和6个LRR结构域,三级结构形如“蘑菇状”。CsTIR1在茶树的根、茎、叶和花中具有组织表达特异性;其表达受IAA诱导,3种不同浓度的IAA均能诱导CsTIR1上调表达,且在50βμmol·L^-1浓度下表达量最大;ABA、GA3、MeJA和BR等激素也能够显著上调其表达;CsTIR1在越冬休眠芽中的表达量低,在活跃期中上调表达。     

茶树小G蛋白CsRAC5基因的克隆与低温胁迫下的表达分析

小G蛋白是一类重要的信号转导蛋白,参与植物的各项生命活动,但目前在茶树中的研究尚少。本研究以茶树品种龙井长叶为实验材料,克隆获得1个小G蛋白基因,命名为CsRAC5。序列分析显示,CsRAC5含有597βbp,编码198个氨基酸,具有Rho蛋白的保守结构域;序列多重比对发现,该序列与其他物种序列的一致性高达95.96%。CsRAC5蛋白质的相对分子质量为21.79βkDa,为亲水性蛋白;烟草瞬时表达实验显示,CsRAC5定位于细胞膜和细胞核中。荧光定量PCR结果显示,CsRAC5在茶树中的表达具有明显的组织特异性,其中在叶片中的表达最高,在花粉中的表达最低;低温（4℃）胁迫抑制茶树叶片中CsRAC5的表达。     

茶树PPO基因家族的鉴定与分析

多酚氧化酶（Polyphenol oxidases,PPO）是由核酸编码的一种以氧为受体的含铜金属酶,为一种末端氧化酶,在茶叶加工中也发挥重要的作用。从最新发布的茶树基因组数据库中获得了5条PPO基因：CsPPO1、CsPPO2、CsPPO3、CsPPO4（GenBank登录号为GQ129142.1）、CsPPO5。本研究利用生物信息学方法,对5条基因的核酸序列和氨基酸序列进行分析,并对基因编码蛋白的理化性质和结构功能进行预测。结果表明,5个基因CDS区全长在597~1β839βbp之间,编码氨基酸数目198~612;系统进化树分析显示CsPPO1、CsPPO3、CsPPO4和CsPPO5具有较近的亲缘关系;编码的蛋白均属于亲水性不稳定类脂类结合蛋白,都不具有信号肽;无规则卷曲是蛋白质的主要结构元件,α-螺旋和β-折叠分散于整个多肽链中,CsPPO1、CsPPO2、CsPPO3可能存在一个或多个跨膜螺旋;5个蛋白均含有PPO1_DWL（pfam12142）保守结构域,除了CsPPO2外,其余4个蛋白均预测到TYROSINASE功能结构域。实时定量PCR结果表明,PPOs基因在不同茶树品种间呈现出不同的表达模式。     

白鸡冠茶树CsPPH基因全长cDNA克隆与表达分析

脱镁叶绿素酶（Pheophytinase,PPH）是叶绿素降解过程中的一个关键酶,它能使脱镁叶绿素a转化为脱镁叶绿酸a,脱镁叶绿酸a是叶绿素降解途径中最后一个保持植物绿色的产物,被认为是叶片衰老和黄化的关键步骤。以新梢白化茶树白鸡冠叶片为材料,克隆获得CsPPH基因cDNA的全长序列（登录号：MK359094）,并对其进行生物信息学分析。结果表明,CsPPH全长为1 298 bp,包含的ORF序列为1 241 bp,编码413个氨基酸。序列分析表明,该基因编码的蛋白质为稳定疏水蛋白,其预测分子量为45 741.50 Da,理论等电点为6.12。预测该基因主要定位于叶绿体中。qRT-PCR结果显示,遮荫抑制白鸡冠叶片CsPPH的表达,叶绿素升高,叶色变绿;光照促进白鸡冠叶片CsPPH的表达,叶绿素降解,导致叶片白化。     

茶树无色花色素还原酶基因克隆及表达分析

采用EST测序技术和3′RACE技术,获得了茶树儿茶素代谢途径中的一个重要酶—无色花色素还原酶的全长基因,在GenBank的登录号为EF205148,序列全长1 301 bp,其中开放阅读框长1 029 bp,编码342个氨基酸,3′端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号,推测的蛋白分子量约为37.5 kD,理论等电点为5.81。将该基因重组到表达载体pET-32a(+)中进行原核表达,经IPTG诱导、SDS-PAGE检测,结果表明茶树无色花色素还原酶基因能在大肠杆菌BL21中表达,电泳检测到一条大约60 kD的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量相符。同源性分析表明茶树无色花色素还原酶基因编码的氨基酸序列与其他植物具有较高的相似性,例如与亚洲棉、草莓和葡萄的相似性分别为70%、68%、71%。利用半定量PCR技术检测总儿茶素含量不同的4个茶树品种中与类黄酮合成相关的黄酮醇合成酶(FLS)、二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)、无色花色素还原酶(LAR)、花色素合成酶(ANS)等7个基因的表达情况,结果表明DFR和LAR基因的表达量与茶树中总儿茶素含量呈一定的相关性,而其他基因则与其相关性不大。     

茶树CsCDF1基因克隆及表达分析

采用SMART-RACE技术克隆了茶树Dof（DNA binding with one finger）基因CsCDF1的全长cDNA序列,并利用在线生物信息学软件对其进行了分析。采用实时荧光定量PCR分析该Dof基因在茶树不同组织间的表达差异和昼夜表达规律,及其在氮饥饿处理2周后对不同浓度氮素诱导的响应。该cDNA序列全长1β606βbp,包含1个编码464个氨基酸的完整开放阅读框,含有高度保守的DOF结构域,推导的蛋白分子量为50.8βkDa,理论等电点（PI）为5.52;其编码的蛋白序列与茸毛烟草、马铃薯和美花烟草的CDF蛋白（Cycling dof factor）相似性分别为69%、67%、68%。系统发育分析结果表明,该基因编码的氨基酸序列与拟南芥CDF蛋白聚为一类,因此将其命名为CsCDF1;CsCDF1在3个不同茶树品种根系中的表达量均高于一芽二叶和成熟叶;在一天中,该基因的表达呈现出昼夜节律变化;在氮饥饿后重新供氮,不同组织中该基因对不同浓度氮素的响应均为上调。     

茶树CsPAL3基因cDNA全长克隆及其表达分析

苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase,PAL）由多基因家族编码,是花青素等多酚物质合成途径的起始酶,对其合成具有调控作用。本研究以紫化茶树武夷奇种C18茶树为材料,采用RACE技术克隆获得CsPAL基因cDNA,命名为CsPAL3（登录号为KY865305）,分析其生物信息学特征,并检测不同叶色茶树品种（系）中的花青素总量及茶树PAL家族成员基因的表达情况。结果表明,获得CsPAL3基因全长cDNA为2β518βbp,包含一个完整的2β130βbp开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）,编码709个氨基酸。序列分析表明,该基因编码的蛋白质为稳定亲水性蛋白,预测分子量为77.40βkD,理论等电点为6.26;Blast分析序列发现CsPAL3与芒果的MiPAL相似性最高,为87%。而在同源进化树分析中与芍药的PiPAL亲缘关系较近。紫化茶树的花青素总量和CsPALa、CsPALc、CsPAL3（CsPALe）基因表达量均高于常规绿叶茶树和白化茶树。这表明茶树CsPALa、CsPALc、CsPAL3（CsPALe）基因上调表达可能促进茶树花青素合成积累,使得茶树叶片呈现紫色。     

茶树Na+/H+逆向转运蛋白基因CsNHX1、CsNHX2的克隆及表达分析

Na⁺/H⁺逆向转运蛋白（Na⁺/H⁺ antiporter,NHX）在植物生长发育与逆境响应过程中扮演着重要角色。本研究以龙井长叶茶树品种为材料,克隆获得了茶树CsNHX1和CsNHX2基因cDNA全长序列,GeneBank登录号分别为：MG722977和MG515211。生物信息学分析结果显示,CsNHX1和CsNHX2的cDNA全长分别为1β691βbp和1β757βbp,均包含1个1β626βbp的开放阅读框,编码541个氨基酸,预测分子量为59.5βkD和59.7βkD,理论等电点为7.07和8.79;蛋白序列分析结果显示,CsNHX1和CsNHX2属于典型的跨膜蛋白,均含有保守的Na⁺/H⁺ Exchanger结构域;进化树分析显示,CsNHX1和CsNHX2均为IC类中定位于液泡膜上的Class I成员。qRT-PCR结果显示,干旱、低温和盐胁迫能够显著诱导CsNHX1和CsNHX2上调表达;外源ABA处理下,CsNHX1和CsNHX2表达水平整体变化趋势不显著;高温胁迫处理下,茶树CsNHX1表达水平显著降低,而CsNHX2表达水平逐渐增加,表明茶树CsNHX1和CsNHX2参与了茶树对多种环境胁迫的响应过程,但对于不同逆境胁迫的应答模式存在一定差异。     

茶树磷转运蛋白基因CsPT4的克隆、亚细胞定位及表达分析

茶园中磷肥的利用效率取决于茶树体内与磷元素吸收、转运及生理利用等相关蛋白的协同调控,而磷转运蛋白(Phosphate transporter proteins,Phts)在此过程中起着关键的调控作用。本研究以茶树品种龙井长叶(Camellia sinensis cv.Longjing-changye)为试验材料,采用同源克隆的方法首次克隆获得茶树磷转运蛋白编码基因Cs Pht1:4(Cs PT4)的全长c DNA。该基因全长1 642 bp,开放阅读框(ORF)1 620 bp(Gen Bank登录号:KY132100),编码539个氨基酸。生物信息学分析显示,Cs PT4基因编码蛋白分子量为59.12 k D,理论等电点(p I)为8.51;具有典型的Pht1家族特性:"6-亲水-6"跨膜结构。亚细胞定位结果显示,该蛋白分布于质膜上,与Softberry软件预测结果一致。荧光定量PCR表明:Cs PT4在正常生长的茶树根、茎、嫩叶、老叶中均有表达,在老叶中的表达量较高,在根部表达量最低。低磷处理,根和叶中Cs PT4上调表达水平均先上升后下降;根部Cs PT4表达量48 h内各个时间点均高于叶部。缺磷处理,根和叶中Cs PT4上调表达水平均升高;根部和叶部分别在72 h和48 h达最大值。本研究为茶树响应低磷的分子机制提供了参考。     

茶树牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因CsGGDPS的克隆及表达分析

以铁观音芽叶为材料,验证从茶树转录组数据库中筛选到的1条牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGDPS)的编码全长序列c DNA。该c DNA全长1 661 bp,含有1个1 137 bp完整的开放阅读框,命名为Cs GGDPS。该基因编码378个氨基酸,氨基酸序列具有类异戊二烯合成酶家族的5个保守域和2个特征功能域;序列分析显示,该c DNA与其他植物GGDPS高度保守,与三七(Panax notoginseng)的亲缘关系最近。Cs GGDPS属于不稳定、亲水蛋白,可能定位到叶绿体中,不存在跨膜结构,无信号肽,发生磷酸化的位点可能有20个;二级结构主要由α-螺旋构成,三级结构与拟南芥GGPPS11匹配度最高。实时荧光定量PCR结果表明,在茶树发育过程和不同叶位Cs GGDPS的表达量随芽叶成熟度的增加呈上升趋势,随着做青过程的进行,Cs GGDPS的表达量逐渐升高;Cs GGDPS在父本黄旦、母本铁观音和子一代金观音中均有表达,但表达量存在差异。     

茶树钙依赖性蛋白激酶基因CsCDPK17的鉴定及表达分析

钙依赖型蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinases,CDPKs或CPKs)是植物细胞中重要的钙离子信号受体,普遍参与了植物生长发育和胁迫响应等调控过程。本研究从茶树龙井43中克隆到1条CDPK基因,经测序验证该序列包含1611bp的完整ORF,编码536个氨基酸。结合序列比对和进化分析发现该蛋白N-末端具有豆蔻酰化位点,具备钙依赖性蛋白激酶的保守结构域,并且与拟南芥AtCDPK17的同源关系最近,因此命名为CsCDPK17(Genbank登录号为:MK238482)。蛋白质理化特性分析发现其蛋白分子量为59.9kD,理论等电点pI为5.43,属无跨膜结构域的亲水性蛋白。使用水稻原生质体和烟草叶片两种瞬时表达的方法均证明CsCDPK17是细胞质膜和细胞核双定位蛋白。对克隆到的CsCDPK17上游2000bp的启动子区分析发现了多个与基因转录、光、激素(ABA、SA、MeJA等)相关的顺式作用元件。表达分析显示,CsCDPK17在成熟叶和种子中表达水平较高,而在根中的表达水平最低;在龙井43、大面白等4个品种冷驯化过程中,该基因的表达随着冷驯化过程显著上调,随着脱驯化过程下调;同时还发现CsCDPK17能够不同程度地响应低温(最高5.1倍)、干旱(最高2.3倍)、渗透(最高2.4倍)胁迫。本研究的结果表明CsCDPK17在茶树的生长发育和低温、干旱、渗透等非生物胁迫响应的过程中均发挥一定的调控作用。     

生长素相关基因在茶树腋芽冬季休眠不同生长阶段的表达分析

利用实时定量PCR技术研究了从本实验室构建的茶树休眠芽与萌动芽抑制消减杂交文库中分离出来的与生长素相关的基因片段在茶树腋芽冬季休眠不同阶段的表达模式.研究结果表明:(1)与生长素响应因子同源的6条EST片段中,有5条的表达量休眠期高于萌发期,另外1条则相反.(2)与生长素原初反应基因同源的3条EST片段的表达模式存在差异,其中与SAURs同源的EST在休眠阶段上调表达,休眠解除以后下调表达.而与GH3和Aux/IAAs同源的2条EST在萌发阶段有一个表达高峰,而在休眠期和萌发以后,表达量都下降.(3)与生长素结合类蛋白同源的茶树CsGLP1表达量在萌发期高于休眠期.(4)与生长素内向运输载体基