沙门氏菌鞭毛蛋白重组乳酸乳球菌的构建及其免疫效果评价

为了开发基于乳酸乳球菌载体表达的新型沙门氏菌口服疫苗,试验按照乳酸菌偏好优化密码子,将合成的截短的聚-γ-谷氨酸合成酶A(PgsA′)和截短的沙门氏菌鞭毛融合基因(Salmonella FliC)克隆到载体pUC57中,通过PCR和双酶切鉴定正确性;通过双酶切和T4连接插入目的基因到乳酸乳球菌表达载体pNZ8048中,构建重组质粒pNZ8048-PgsA′-FliC,通过PCR和双酶切鉴定正确性;提取质粒后将重组质粒利用电穿孔法转入乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)NZ9000中,挑取阳性克隆,扩增培养后提取质粒,通过PCR和双酶切鉴定正确性;通过Western-blot检测外源基因在重组菌中的表达情况;对Balb/c小鼠口服免疫重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8048-PgsA′-FliC,以NZ9000/pNZ8048和PBS为对照,通过ELISA测定小肠黏液中特异性sIgA抗体表达水平。结果表明:成功构建了重组质粒pNZ8048-PgsA′-FliC与重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8048-PgsA′-FliC,并成功表达PgsA′-Fli...     

表达堆型艾美耳球虫3-1E蛋白的三种重组乳酸乳球菌构建与鉴定

为探索堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)表面抗原3-1E基因在乳酸乳球菌L.lactis NZ9000中的不同表达形式,首先通过PCR扩增3-1E目的基因片段,克隆入pTX8048载体中,构建胞内表达质粒p TX8048-3-1E;将乳球菌未知分泌蛋白(Usp45)信号肽(SP)与3-1E基因片段融合(SP-Δ3-1E),并克隆入pTX8048中,构建分泌表达质粒pTX8048-SP-Δ3-1E;将化脓性链球菌M6蛋白细胞壁锚定序列(Cell wall anchor,CWA)克隆入pTX8048-SP-Δ3-1E中的Δ3-1E下游(去除Δ3-1E终止密码子,即NAΔ3-1E),构建表面表达质粒pTX8048-SP-NAΔ3-1E-CWA;将三种表达载体电转化到乳酸乳球菌L.lactis NZ9000中,构建三种乳酸乳球菌L.lactis NZ9000/pTX8048-3-1E(胞内表达菌)、L.lactis NZ9000/pTX8048-SP-Δ3-1E(分泌表达菌)及L.lactis NZ9000/pTX8048-SP-NAΔ3-1E-CWA(表面表达),通过Western blot来检测3-1E目的蛋白在三种阳性乳酸乳球菌中的表达。结果表明,构建的三种重组乳酸乳球菌均可表达目的蛋白。研究结果为进一步评估重组乳酸乳球菌的抗球虫免疫保护作用及后续非抗性标记乳酸菌体系建立奠定基础。     

多粘类芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶bglA、bglB和bgl基因在大肠杆菌中的表达

为了有效地提高β-葡萄糖苷酶的活性,本实验将多粘类芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)β-葡萄糖苷酶bglA、bglB和bgl(bglA和bglB基因)基因分别连接在pET-28a上并在大肠杆菌C41中表达。将这3株重组菌分别命名为EA、EB及共表达菌株EAB,并将构建好的工程菌EA和EB按1∶1,1∶2,2∶1进行混合培养,分别比较单一酶组分、共表达及混合表达菌株的酶活。SDS-PAGE电泳图显示BglA和BglB的大小都为50ku,EA和EB混合培养的蛋白大小也为50ku,Bgl大小为100ku,表明BglA和BglB在体外不能形成蛋白复合物,只有在生物体内才能形成Bgl复合蛋白。酶活测定结果表明共表达Bgl与多粘类芽孢杆菌的酶活差异不显著,但显著高于其他组分酶活(P0.05)。刚果红染色结果也表明Bgl酶活比单一酶组分的酶活明显提高。本实验为纤维素酶多组分人工组装及集成生物工艺菌种的构建奠定实验基础。     

ETEC粘附素蛋白亚基Fae G在乳酸乳球菌中的表达及免疫反应性分析

为探索研制预防仔猪腹泻口服基因工程疫苗,本研究根据GenBank中登录的产肠毒素大肠杆菌(ETEC)Fae G基因序列设计一对引物,以ETEC C83907菌株为模板,通过PCR方法扩增出K88菌毛粘附素主要蛋白亚基Fae G的基因,将其定向克隆到乳酸乳球菌(L.lactis)分泌表达载体pNZ8112中,构建了分泌表达载体pNZ8112-fae G.并转化到L.lactis NZ9000中.重组菌株经5 ng/mL nisin诱导3 h后,仅在L.lactis菌体内检测到Fae G的表达,上清液中未检测到Fae G蛋白.SDS-PAGE电泳检测结果显示,表达的目的蛋白分子量大小约为27 ku,表达产物的量达到了菌体总蛋白的13.56%.Western blot分析结果表明,表达蛋白具有免疫反应性.本实验为进一步研究Fae G在L.lactis中分泌表达的影响因素奠定了基础.     

葡聚糖外切酶和葡聚糖内切酶基因密码子的优化及表达

[目的]合成经过密码子优化的葡聚糖外切酶和葡聚糖内切酶基因,并将2个基因在乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)中进行分泌表达。[方法]对瘤胃真菌(Piromyces rhizinflatus,P.rhizinflatus)的外切葡聚糖酶cbhYW23-1基因(Gen Bank登录号:EU314937.1)和产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes,F.succinogenes)的内切葡聚糖酶end-1基因(Gen Bank登录号:X88561.1)进行L.lactis MG1363密码子偏爱性优化,并在2个基因的上游和下游分别引入ClaⅠ/XbaⅠ和Hind Ⅲ酶切位点,得到含有优化的cbhYW23-1基因和end-1基因的克隆载体p UC57-cbhYW23-1和p UC57-end-1;通过酶切后分别连接到构建的组成型分泌载体p MG36e+P32+SPusp45上,得到2个基因的表达载体,然后电转至L.lactis MG1363中,利用红霉素抗性筛选得到高拷贝转化重组子;以CMC-Na(羧甲基纤维素钠)为底物验证其活性及表达情况。[结果]成功地构建了cbhYW23-1基因和end-1基因的分泌型表达载体,2个基因均能够在L.lactis MG1363中高效稳定表达,2株重组菌株表达的外切葡聚糖酶酶活和内切葡聚糖酶酶活分别为118.80 U/mL和294.32 U/mL。[结论]密码子优化后的2个纤维素酶基因在L.lactis中获得理想稳定的表达,其高效基因工程菌的构建为将来实现这2种纤维素酶的工业化生产奠定了技术基础。     

TGEV和PEDV融合S蛋白在乳酸乳球菌食品级细胞内高效诱导表达与免疫原性分析

本研究以乳酸乳球菌食品级细胞内高效诱导表达载体pRNA48为基础,构建了含猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)融合S基因的表达质粒pRNA48-TPs和重组菌L.lactis NZ9000/pRNA48-TPs。SDS-PAGE分析nisin诱导后重组菌表达的细胞内目的蛋白,然后分别对兔子进行注射免疫和口服免疫,并用Western Blot进行免疫原性分析,结果表明,重组菌细胞内表达的TPs融合蛋白具有较好的免疫原性,注射免疫产生的抗体能特异性识别胞内TPs融合蛋白,同时发现口服免疫也能产生特异的抗体血清,初步证明重组蛋白具有黏膜免疫原性。     

抑菌肽在枯草芽孢杆菌中的构建表达、抑菌特性及发酵条件优化

本研究从蚯蚓中克隆得到抑菌肽基因ew T1,将其构建在枯草芽孢杆菌表达载体p HT43中得到重组质粒p HT43-ew T1,并转化至枯草芽孢杆菌蛋白酶缺陷型菌株WB800N中,得到重组菌,然后进行诱导表达以及发酵条件优化。优化后的重组菌发酵上清液对猪粪大肠杆菌的抑菌效价为47,362U/m L。蚯蚓抑菌肽基因ew T1可以在枯草芽孢杆菌中实现异源表达,为枯草芽孢杆菌抑菌肽分泌表达系统的进一步优化奠定了基础。     

耐碱性短小芽孢杆菌木聚糖酶在枯草杆菌中的表达及发酵条件优化

研究耐碱性短小芽孢杆菌木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中异源表达。从耐碱性木聚糖酶高产短小芽孢杆菌BYG5-20中克隆得到带有自身启动子的木聚糖酶基因xynA,将其构建在大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pGJ148中得到重组质粒pGJ148-xynA。采用电转化法将重组质粒pGJ148-xynA转入枯草芽孢杆菌1A747中,得到重组菌B.GJ148-xynA,然后进行诱导表达以及培养基的优化。重组菌GJ148-xynA发酵上清液中木聚糖酶酶活可达93.32IU/ml。耐碱性短小芽孢杆菌木聚糖酶基因xynA可以在枯草芽孢杆菌中实现异源表达,为枯草芽孢杆菌木聚糖酶分泌表达系统的进一步优化奠定了基础。     

杏鲍菇漆酶基因原核表达载体的构建及乳酸菌的遗传转化

为获得有效表达的产漆酶乳杆菌工程菌和既可以产乳酸又可以产漆酶的益生菌制剂。以杏鲍菇为试验材料,利用RT-PCR方法,克隆漆酶基因,将其与乳酸菌食品级表达载体质粒p MG36e进行连接,构建漆酶乳酸杆菌表达载体质粒p MG36e-Lacc1,通过电激转化法使其进入从青贮饲料中提取的布氏乳杆菌中,并探究影响布氏乳杆菌电转化的最适条件。试验结果表明:扩增得到长度为1 596 bp的漆酶基因片段,成功构建漆酶乳酸杆菌表达重组质粒,利用电激转化技术使其导入布氏乳杆菌基因组中,研究表明当电场强度达到1.75 k V,用SMRS培养基复苏培养1.5 h后,得到较高的电激转化率。     

产肠毒素大肠杆菌K88黏附素蛋白亚基Fae G在L.lactis中的表达及其抗原性

在构建L.lactis表达载体pNZ8148-fae G的基础上,将该载体转化到L.lactis NZ9000中,重组菌经5 μg/Lnisin诱导3 h,SDS-PAGE结果显示,FaeG在L.lactis中表达的目的蛋白相对分子质量大小约为27 000,表达产物的量达菌体可溶性总蛋白的10.89%.Western blot分析结果表明,该目的蛋白具有良好反应原性.将重组L.lactis口服免疫BALB/c小鼠,小鼠产生特异性IgG及黏膜slgA.本试验为进一步研究仔猪口服重组L.lactis疫苗,诱导其产生抗ETEC K88黏膜免疫的同时,发挥L.lactis的益生功能,预防仔猪腹泻奠定了基础.     

幽门螺旋杆菌lpp20-cagA融合基因在乳酸球菌中的表达及免疫原性研究

为研究载体疫苗对幽门螺旋杆菌(HP)感染的免疫保护作用,本实验应用无缝克隆技术将HP的两个候选抗原基因lpp20和cagA直接连接后克隆于表达载体pNZ8149中,构建重组表达质粒pNZ8149-lpp20-cagA。将重组质粒电转化乳酸球菌(L.lactis)NZ3900,构建了不含任何抗生素筛选标记的食品级原核表达系统pNZ8149-lpp20-cagA/NZ3900,经nisin诱导表达,得到的重组蛋白分子量约为50.3ku。将以上得到的重组L.lactis灌胃免疫BALB/c小鼠,利用ELISA方法分别检测各组小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a及细胞因子IL-4、IFN-γ水平。结果显示,与对照组相比,实验组小鼠血清中IgG、IgG1、IL-4水平显著升高,表明重组蛋白Lpp20-CagA可以诱导良好的体液免疫应答;利用HP攻毒经重组菌灌胃免疫的小鼠,检测小鼠胃组织中HP的定植密度及脲酶活性,结果显示重组蛋白Lpp20-CagA在一定程度上可以减少HP在小鼠胃组织中的定植。本实验构建的载体疫苗在预防HP感染方面具有重要的应用价值。     

鸡消化道β-半乳糖苷酶基因缺陷型共生乳酸菌的筛选

以健康雏鸡消化道优势共生乳酸菌为试验对象，用氮—甲基—氮—硝基—氮—亚硝基胍对其进行β—半乳糖苷酶基因缺陷型菌株定向诱导突变，在选择培养基上对突变体菌株进行筛选。结果成功地对鸡消化道共生乳酸菌进行了诱导突变，筛选到β—半乳糖苷酶基因缺陷型的乳酸菌受体菌株，为构建以β—半乳糖苷酶基因为选择标记的食品级载体表达系统奠定了基础。     

组成型表达绿色荧光蛋白的重组干酪乳杆菌的构建

以干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)组成型表达质粒p PG-T7g10-PPαT为重组载体,在限制性内切酶SacⅠ和ApaⅠ酶切位点之间,插入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,构建重组质粒p PG-T7g10-EGFP,电转化干酪乳杆菌ATCC393(L.casei 393),获得重组菌p PG-T7g10-EGFP/L.casei 393;利用Western blot检测可见约27 ku的重组蛋白特异性反应带;激光共聚焦显微镜下可见重组菌出现特异的绿色荧光;流式细胞术分析可见重组菌出现了明显的荧光信号。结果表明:已经获得组成型表达EGFP的重组干酪乳杆菌。本研究为进一步利用该表达系统表达功能蛋白,拓展乳酸菌的应用提供了参考。     

不同剂量猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗肌肉注射诱导仔猪细胞免疫的研究

将猪流行性腹泻病毒（PEDV）纤突蛋白S1基因片段插入干酪乳杆菌分泌型表达载体pPG-2中,构建了重组表达载体pPG-sl,将其电转化干酪乳杆菌Lcasei393,获得了表达PEDVsl蛋白的重组乳酸菌杆菌。重组杆菌诱导后,经westernblot、间接ELISA实验表明,目的蛋白获得了分泌表达。     

口服疫苗抗原递送载体Lactococcus lactis NZ9000研究进展

综述了基因工程菌Lactococcus lactis NZ9000在基因组学、安全性、功能性、疫苗载体构建、菌株改造等方面的研究进展,对NZ9000作为口服疫苗载体的表达系统进行了评述,展望了其在生物制药、疫苗开发和食品工业等领域的应用前景,并对今后研究的发展方向做了分析。     

纤维二糖水解酶在乳酸乳球菌中的表达

为在乳酸乳球菌中表达纤维二糖水解酶II(CBH II)基因,对绿色木霉(T.reesei)CBH II基因序列进行密码子优化和合成,通过PCR及T4 DNA连接酶将人工合成的序列插入到表达载体pNZ8148中,获得重组质粒pNZ8148-CBH II,重组质粒经双酶切及测序鉴定正确后,将正确的重组质粒通过电击转化进入乳酸菌NZ3900感受态细胞,通过选择性抗生素氯霉素筛选阳性克隆,放大培养后使用终浓度为20 ng/mL的Nisin进行诱导表达,诱导后的菌液经SDS-PAGE鉴定,有符合预期大小的条带,说明CBH II基因在乳酸乳球菌NZ3900中表达。研究为乳酸乳球菌的改造及开发临床应用奠定基础。     

产肠毒素大肠杆菌STa突变体、LTB和STb融合蛋白在乳酸菌中组成型分泌表达及其免疫原性分析

为获得产肠毒素大肠杆菌(ETEC)抗原STa突变体(mSTa)、LTb和STb融合蛋白在乳酸菌表达系统中组成型分泌表达,本研究将mSTa、LTb、STb三价抗原融合基因,克隆于p23启动子-USP45分泌信号肽之后,插入到乳酸乳球菌表达载体pTX8048中,构建了重组表达载体pTX-sls,将其电转化到宿主菌乳酸乳球菌L.lactisNZ9000中进行表达,应用westernblot、ELISA方法鉴定蛋白表达情况。将重组乳酸乳球菌pTX-sls/NZ9000口服免疫BALB/c小鼠,分别测定了免疫后不同时间血清中特异性IgG、粪便中特异性的sIgA水平以及血清的中和活性;采用MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况,流式细胞术检测Th细胞免疫类型。结果显示,目的蛋白mSTa-LTB-STb以分泌形式组成型表达,可被阳性血清所识别。在免疫小鼠血清和粪便中均可检测到特异性IgG、sIgA,血清抗体具有一定的中和毒素作用。结果表明,该重组乳酸乳球菌具有作为口服疫苗的潜在应用价值,本研究为研制ETEC乳酸菌活载体口服疫苗奠定了基础。     

以木糖为选择标记的乳酸菌表达载体的构建及猪细小病毒VP2基因的表达

为构建以木糖为选择标记的乳酸杆菌表达载体,根据GenBank登录的E.coli JM109 xylA和xylB基因序列设计引物,以E.coli JM109基因组为模板,扩增xylAB基因,与人工合成的多克隆位点序列MCS基因、去除氯霉素基因的乳酸菌载体质粒pPG2片段及以pPG2载体质粒为模板扩增的repA基因连接,电击转化于L.casei 393感受态细胞,获得以木糖为选择标记的乳杆菌表达载体并命名为pOXM2。为鉴定pOXM2载体表达蛋白的效果,以含猪细小病毒VP2基因的重组质粒pMD-VP2为模板,扩增VP2基因序列,与载体质粒pOXM2连接,产物电击转化L.casei393感受态细胞,获得阳性克隆子pOXM2-VP2。重组菌经诱导,并进行SDS-PAGE及western blot分析。结果表明,有约180ku重组蛋白得到了表达,而且表达的重组蛋白具有与天然病毒蛋白一样的免疫反应特异性。本研究结果表明已成功构建了以木糖为选择标记的乳杆菌表达载体并实现了外源基因的表达,为进一步研究以重组干酪乳杆菌作为口服疫苗或表达功能性蛋白奠定了基础。     

副干酪乳杆菌6-磷酸山梨醇脱氢酶(gutF)基因的克隆和超表达

为研究6-磷酸山梨醇脱氢酶基因在乳酸菌中超表达的影响,本试验根据副干酪乳杆菌的基因序列设计引物,用PCR的方法扩增6-磷酸山梨醇脱氢酶(gutF)基因,将其连接到乳酸菌表达载体pMG36e,并将重组质粒转化到副干酪乳杆菌及乳酸乳球菌中获得重组菌株;对重组菌株表达产物进行蛋白质水平的电泳检测,检测出表达了大约28kD的蛋白;使用山梨醇替代培养基中的葡萄糖,以未转化基因菌株做阴性对照,进行生长曲线的测定,结果表明,转化菌株能够利用在以山梨醇作为碳源的条件下,重组菌株的生长速度和最终菌浓度均优越于对照菌株。本研究通过超表达6-磷酸山梨醇脱氢酶蛋白,对于进一步研究乳酸菌的耐受性具有十分重要的理论基础。     

猪脂联素球状结构域gAd基因在乳酸乳球菌中的表达

本研究旨在克隆猪脂联素球状结构域gAd基因,构建重组质粒并将其转化至乳酸乳球菌NZ9000中进行表达,并在体外对重组猪脂联素球状结构域进行生物学活性分析。提取猪脂肪组织总RNA,扩增得到脂联素基因全长并测序,设计引物引入酶切位点和His-tag,把gAd亚克隆到表达载体pNZ8048,将重组质粒转化乳酸乳球菌NZ9000中诱导表达。通过Ni 2+亲和层析柱对重组蛋白纯化后再Western blotting检测。然后,将gAd蛋白注射到高糖饲喂的小鼠体内鉴定生物学活性。结果表明成功获得了gAd基因并在乳酸乳球菌NZ9000中表达,表达产物相对分子质量约17ku。经纯化后用Western blotting检验具有反应原性,动物试验证明制备的gAd蛋白能显著降低小鼠的血糖水平。本研究为利用外源重组脂联素球状结构域调节猪的脂肪代谢打下了良好的基础。