牦牛、黄牛和绵羊EPO基因部分片段遗传多态性分析

为研究低氧调控促红细胞生成素EPO基因表达的分子机制,本试验选择青藏高原低氧环境中的牦牛和乔科、欧拉、甘加3个藏羊群体及较低海拔的早胜牛和蒙古羊、滩羊、小尾寒羊为研究对象,对EPO基因的部分片段(1 308 bp)进行多态性分析.对38个核苷酸序列进行比对分析共得到16个单倍型,84个突变位点,其中有义突变6个.分析发现单倍型Hap_9,10,11,12,13为黄牛特有,Hap_14,15,16为牦牛特有;Hap_1为6个绵羊品种所共有,Hap_3为除小尾寒羊外其他绵羊共有,Hap_6,7为低海拔绵羊小尾寒羊特有,Hap_2为高海拔绵羊甘加羊和乔科羊共有,Hap_5为乔科羊特有,Hap_8为位于中等海拔的蒙古羊特有,Hap_4为乔科与蒙古羊所共有.在该段基因编码的141个氨基酸上,3个物种中共发现6个突变位点.试验结果表明EPO基因多态性丰富,不同海拔物种单倍型分布不同.     

牦牛、犏牛及黄牛肉脂肪酸和风味物质的分析

随机选取青海省果洛州同一放牧群体的1.5岁牦牛（♂）和犏牛（♂）各3头,与青海省湟中县1.5岁的3头黄牛（♂）做比较研究,利用气质联用仪对牦牛、犏牛和黄牛肉中脂肪酸组成及含量进行分析,利用高效液相色谱法对其肉中的肌苷、肌苷酸和硫胺素进行测定,采用高氯酸滴定法测定其肉中谷氨酸钠的含量。结果表明：①牦牛、犏牛和黄牛肉中饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸的含量无显著差异（P〉0.05）;多不饱和脂肪酸在犏牛肉中含量最高,明显高于牦牛和黄牛肉（P〉0.05）。②牦牛肉肌苷的含量明显高于同龄黄牛（P〈0.05）;三种牛肉中肌苷酸的含量无显著差异（P〉0.05）;犏牛肉硫胺素的含量最高,明显高于同龄黄牛（P〈0.05）;犏牛与黄牛肉谷氨酸钠的含量明显高于同龄牦牛（P〉0.05）。     

大通牦牛DQA2基因CDS区序列分析

为了获得大通牦牛DQA2基因序列,并研究其序列特征及编码蛋白的结构和功能,本研究采用DNA混合池扩增后直接测序的方法,通过DNAstar软件和在线服务器预测大通牦牛DQA2基因CDS区编码蛋白的理化性质、疏水性/亲水性、糖基化位点、信号肽、跨膜结构、二级结构以及三级结构。结果表明,大通牦牛DQA2基因CDS区长度为765bp,编码253个氨基酸。蛋白结构预测结果表明,该蛋白是一种混合型的可溶性蛋白质,具有4个潜在的N-糖基化位点,分别为Asn31、Asn96、Asn260、Asn369;在第1~23位氨基酸之间存在信号肽;存在1个典型的跨膜螺旋区,氨基酸序号为216-239;蛋白质功能显示该蛋白存在信号受体活性、催化活性、运载体、调节代谢过程、细胞定位及免疫系统过程的功能。本研究结果为进一步研究大通牦牛的遗传育种提供理论基础。     

牦牛PRDM9基因的CDS序列及其生物信息学分析

文章通过RT-PCR技术克隆了牦牛PRDM9基因的cDNA序列,利用DNAMAN、MAGA4、ExPASy等多个生物信息学软件进行了分析研究。结果表明:扩增出的牦牛PRDM9基因的编码区长1 533 bp,编码510个氨基酸。与普通牛、人和鼠相应基因核苷酸序列进行比对,其一致性分别为99%、76%和69%。预测的牦牛PRDM9蛋白二级和三级结构显示它是一个具有3种功能结构域的弱碱性螺旋状蛋白。这为今后的进一步研究提供了理论基础。     

牦牛和犏牛促卵泡素受体基因5′-侧翼区序列多态性研究

本研究旨在分析牦牛和犏牛促卵泡素受体(follicle-stimulating hormone receptor,FSHR)基因的多态性,为从遗传角度上解决其繁殖产仔率低的问题提供参考,为筛选繁殖性状分子标记奠定理论基础。研究采用PCRSSCP和直接测序技术,对麦洼牦牛、九龙牦牛、大通牦牛和犏牛共110头个体的FSHR基因5′-侧翼区进行遗传多态性分析,统计基因频率和基因型频率,进行Hardy-Weinberg平衡性检测,计算纯合度、杂合度、多态信息含量和有效等位基因数等遗传多态性指标。结果表明,麦洼牦牛、大通牦牛和九龙牦牛FSHR基因5′-侧翼区核苷酸序列具有多态性,犏牛无多态性;麦洼牦牛存在AA、AB和BB 3种基因型,九龙牦牛和大通牦牛均存在AA、AB 2种基因型,AB基因型在3个牦牛品种中占绝对优势,等位基因A为优势等位基因;麦洼牦牛、九龙牦牛和大通牦牛的多态信息含量分别为0.3693、0.3565、0.3705,均达到了中度多态(0.25PIC0.5),表明各牦牛品种遗传变异较大。     

SPATA3基因克隆及其在牦牛和犏牛睾丸中的差异表达研究

旨在克隆牦牛精子发生蛋白3（spermatogenesis associated 3,SPATA3）基因,并检测其在牦牛不同组织及在不同发育时期牦牛和犏牛睾丸中的表达水平,探讨SPATA3对睾丸发育和精子成熟的影响,为进一步研究该基因在精子形成过程中的作用机制提供理论依据。本试验以牦牛为研究对象,利用RT-PCR克隆技术获取牦牛SPATA3 cDNA序列,使用生物信息软件分析其结构和功能,并检测其在牦牛心、肝、脾、肺、肾、脑、小肠、卵巢、子宫和睾丸组织中的表达谱。通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,RT-qPCR）检测SPATA3基因在牦牛和犏牛睾丸不同发育时期的表达规律;采用免疫组化技术检测SPATA3在牦牛和犏牛睾丸中的细胞定位及表达差异。结果显示,SPATA3基因CDS区为693 bp,编码230个氨基酸,与黄牛、野牦牛和水牛的同源性较高;SPATA3仅在耗牛睾丸组织中特异性表达,其它组织未见其表达。RT-qPCR结果显示,SPATA3基因在牦牛睾丸发育过程中均有表达,其中成年期（4~5岁）睾丸中的表达极显著高于胎牛时期（5~6月,P<0.01）,且其在牦牛不同发育时期睾丸中的表达均极显著高于犏牛（P<0.01）。免疫组化结果发现,SPATA3在圆形精子、长形精子细胞胞浆中均表达,且成年期牦牛睾丸中该基因的表达水平极显著高于犏牛（P<0.01）。综上表明,SPATA3在遗传进化中高度保守,且在牦牛和犏牛睾丸组织中差异表达,该基因低表达可能引起精子形成障碍,从而参与精子成熟进程,但具体功能有待进一步的研究。     

牦牛与犏牛睾丸支持细胞分离培养及生物学特性比较分析

旨在建立牦牛与犏牛睾丸支持细胞分离培养及鉴定方案,比较两种牛睾丸支持细胞的生物学特性.本研究分别采集24月龄的3头健康公牦牛与3头F1代公犏牛睾丸组织作为2个样品组,其中每组3个生物学重复,分别通过混合酶消化、差速贴壁和饥饿处理分离得到两种牛的睾丸支持细胞,采用DMEM高糖及DMEM/F12培养基培养睾丸支持细胞,筛选...     

Differential Expression and Function Prediction of miR-383 in Yak and Cattle-yak Testis

The aim of this study was to detect the differential expression of miR-383 in yak and cattle-yak testis,and explore the important roles of miR-383 in spermatogenesis.Using the testis tissue of mature yak and cattle-yak as experimental material,Real-time PCR was performed to detect the miR-383 expression.miR-383 targets were obtained using TargetScan and miRanda database,and biological functions of these target genes were predicted by David and Gene Ontology online softwares.The miR-383 had significantly differential expression in F₁ testis tissue between yak and cattle-yak(P<0.05),and it had the highest expression level in yak testis tissues.131 target genes were obtained by target gene prediction which involved in cell proliferation,apoptosis,regulation of nucleic acid synthesis and other processes by GO analysis and KEGG pathway analysis.The results showed that miR-383 might participate in the regulation of germ cell differentiation and spermatogenesis,which would provide clues and theoretical basis for studying the function and regulation mechanism of miR-383 in cattle-yak germ cell.     

miR-383在牦牛、犏牛睾丸组织中的差异表达及功能预测

本研究旨在分析miR-383成熟体在雄性牦牛和犏牛F1代睾丸组织中的差异表达,以了解其在精子形成中的重要作用.以发育成熟的牦牛和犏牛睾丸组织为材料,利用实时荧光定量PCR方法检测miR-383成熟体在牦牛及犏牛睾丸组织中的差异表达情况;利用TargetScan和miRanda数据库获得miR-383的靶基因集合,通过David和Gene Ontology在线软件分析miR-383靶基因的生物学功能.实时荧光定量PCR结果显示miR-383成熟体在牦牛和犏牛F1代睾丸组织中表达显著差异(P<0.05),在牦牛睾丸组织中表达量较高,靶基因预测共获得131个靶基因,GO分析及KEGG信号通路分析得到miR-383靶基因功能,这些靶基因参与了细胞增殖、凋亡、核酸合成调控等过程.结合miR-383成熟体的表达差异和靶基因功能预测结果,miR-383可能参与生殖细胞的分化及精子形成调控,为miR-383在犏牛生殖细胞中的功能与调控机制研究提供了理论依据.     

犏牛和牦牛ESCO2基因的序列特征及其在睾丸中的表达对比分析

旨在克隆犏牛和牦牛姐妹染色单体内聚建立蛋白2（establishment of sister chromatid cohesion N-acetyltransferase 2,ESCO2）基因,并分析其在不同发育阶段睾丸中的表达与定位,为进一步解析ESCO2在减数分裂过程中的作用机制提供理论依据。本研究以健康雄性犏牛及牦牛为试验动物,根据年龄分为胎牛组（5~6月龄）、幼年组（1~2岁）和成年组（3~4岁）,每组各3头。通过RT-PCR技术克隆犏牛和牦牛ESCO2基因并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR （quantitative real-time PCR,qRT-PCR）检测ESCO2基因在犏牛不同组织中的表达谱,比较分析ESCO2在犏牛和牦牛不同时期睾丸中的表达规律,利用免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）技术检测ESCO2蛋白的细胞定位和表达差异。结果显示,犏牛ESCO2基因（GenBank登录号：MW198470） CDS区为1 833 bp,编码610个氨基酸,与牦牛相比,犏牛ESCO2序列第301~319位多19个氨基酸,另有3个氨基酸突变;犏牛ESCO2蛋白序列与黄牛的同源性高于其他哺乳动物;ESCO2可能与SMC3、SMC1A、PDS5A、PDS5B、STAG2等蛋白相互作用,互作蛋白功能与姐妹染色单体凝聚、减数分裂细胞周期、DNA修复、细胞分裂和染色体重构等生物学过程相关。ESCO2在犏牛各组织中均有表达,但在睾丸中的相对表达水平显著高于其它组织（P<0.05）;在犏牛睾丸中的表达随年龄增长呈上升趋势,幼年和成年时期犏牛睾丸中ESCO2的表达显著低于同时期牦牛（P<0.05）;IHC染色结果发现,雄性犏牛减数分裂阻滞于初级精母细胞,ESCO2蛋白在犏牛初级精母细胞中无表达并与牦牛存在差异。本研究结果表明,犏牛与牦牛的ESCO2基因、蛋白序列差异较大,且在睾丸发育过程中的表达模式差异显著,这可能是引起雄性犏牛减数分裂阻滞及不育的原因之一,其具体作用机制有待进一步研究。     

犏牛雄性不育相关lncRNA的鉴定与分析

旨在分析成年健康牦牛和犏牛(3～4岁)睾丸组织中长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)的表达谱,从而探究lncRNA与犏牛雄性不育机制的关联性,为解释犏牛雄性不育的机理提供理论依据。采集成年(3～4岁)健康牦牛、犏牛各3头的睾丸组织,构建cDNA文库后进行高通量测序,筛选出差异的lncRNA,通过对差异显著的lncRNA与mRNA位置关系以及结合能的判定预测顺式作用(cis)和反式作用(tran)的靶基因,并进行GO、KEGG功能分析。结果表明,共得到牦牛和犏牛候选lncRNA转录本分别为20 363和24 133个,两个文库筛选出6 178个显著差异lncRNA,其中有2 470个在犏牛睾丸组织与牦牛比较上调,3 708个下调。筛选得到差异显著lncRNA的候选靶基因2 676个,这些基因参与58个功能分类,共涉及306条通路;其中主要富集的通路包括轴突指导、内吞、Hedgehog等信号通路。综上表明,部分lncRNA介导的靶基因PTGDS、IGF2、MEST、GLIS3、NOTCH2、HOXA10、HOXA11与犏牛雄性不育相关,lncRNA在犏牛的生殖发育中对其雄性不育具有重要的调控作用。利用RNA-Seq技术筛选出成年牦牛和犏牛睾丸组织lncRNA,并进行差异分析,为探讨犏牛雄性不育的机制提供更完善的转录组数据。     

导入野血牦牛群体的遗传变异和基因分化

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法和火焰光度法对家牦牛和３个含野血牦牛群体ＴＦ,ＨＢ,Ｈｐ,ＫＥ,ＡＭＹ１和ＲＢＣＬＤＨ１６个基因座多态性的研究表明：家牦牛与３个含野血牦牛群体具有同样的多态性特征,但群体的遗传变异随野牦牛血比例的增多而减少。含野血牦牛群体之间的亲缘关系大于家牦牛,再大于野牦牛,但总群体所发生的基因分化程度很小（２７４８％）。     

天祝白牦牛和甘南牦牛DRB3基因外显子2多态性研究

试验通过对天祝白牦牛和甘南牦牛DRB3基因外显子2部分CDS序列进行分析,获得其准确单倍型,通过直接测序与聚合酶链式扩增阻碍突变系统(ARMS)扩增法获得干净的单链,对高度杂合的双链进行分型。结果发现65个SNPs,1个密码子的插入缺失,获得30个单倍型,其中有7个单倍型是首次发现,应该是天祝白牦牛和甘南牦牛特有的单倍型。通过对已知牛属所有DRB3基因外显子2单倍型与本研究发现的单倍型进行分析发现天祝白牦牛和甘南牦牛分享普通牛和瘤牛单倍型,可能有普通黄牛和瘤牛的遗传背景,且DRB3基因外显子2的4、25、30、53、59、62、63、66、78氨基酸位点受到了正选择的影响,主要发生在天祝白牦牛群体里,这与天祝白牦牛长期选育白毛有一定的关系。