CPT-I基因荧光定量PCR检测方法的建立

CPT-ImRNA的表达对研究奶牛肝脏脂肪酸氧化代谢具有重要作用,CPT-I在肝脏中脂肪酸从细胞浆转移到线粒体过程中起关键作用。本研究应用双标准曲线方法,建立了CPT-I基因的相对荧光定量方法。结果表明,所建立的SYBRGreenI荧光定量PCR方法检测CPT-I基因具有较好的效果,为肝细胞CPT-I基因定量分析奠定了基础。     

实时荧光定量PCR法检测抗虫棉历基因拷贝数方法的建立

[目的]建立并完善Taqman实时荧光定量PCR检测转基因抗虫棉Bt基因的方法.[方法]通过Bt基因序列,利用软件Primer5.0设计引物和探针.然后利用10倍系列稀释含有目的基因的质粒pG4AB,进行实时荧光定量PCR反应,制作标准曲线.[结果j抗虫基因拷贝数与Ct值的关系为Ct=-3.549 632X 43.783 512,相关系数R2为0.997 867.[结论]实时荧光定量PCR检测转基因抗虫棉Bt基因的方法具有特异性好、灵敏度高的特点.     

实时荧光定量PCR法检测抗虫棉Bt基因拷贝数方法的建立

[目的]建立并完善Taqman实时荧光定量PCR检测转基因抗虫棉Bt基因的方法。[方法]通过Bt基因序列,利用软件Primer5.0设计引物和探针,然后利用10倍系列稀释含有目的基因的质粒pG4AB,进行实时荧光定量PCR反应,制作标准曲线。[结果]抗虫基因拷贝数与Ct值的关系为Ct=-3.549 632X+43.783 512,相关系数R2为0.997 867。[结论]实时荧光定量PCR检测转基因抗虫棉Bt基因的方法具有特异性好、灵敏度高的特点。     

小麦淀粉合成酶基因实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用

利用荧光定量PCR技术,对小麦淀粉合成酶基因(AGPase1、GBSSI、SSSIII、SBEI)进行了定量检测,分别建立了这4种淀粉合成酶基因和内参基因18s的Ct值与模板量之间的标准曲线和线性回归方程。运用所建立的方法对小麦籽粒4种淀粉合成酶基因在灌浆期间的表达变化情况进行了定量分析。     

裸大麦PKABA1基因实时荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank上小麦(M94726)、大麦(AB058924)和黑麦(DQ295068)的蛋白激酶外显子3的编码基因的同源序列比对,设计基因PKABA1的引物,建立了用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测裸大麦PKABA1基因在不同低温处理时间下mRNA表达量的方法.以样本循环数为纵坐标、以稀释倍数的对数为横坐标建立标准曲线,其相关系数(r2)达到了0.996,扩增效率99％,熔解曲线分析结果显示产物为特异的单峰,退火温度为(80.5±0.5)℃.结果表明,裸大麦PKABA1基因在不同低温处理时间下的表达量稳定,其实时荧光定量PCR法扩增效率高、特异性强、线性范围广、检测周期短,为PKABA1基因作为内参基因进行裸大麦功能基因表达的定量分析奠定了基础.     

实时荧光定量PCR检测弓形虫GRA6基因方法的建立和应用

[目的]在建立快速且准确检测牛弓形虫病的实时荧光定量PCR方法,以进一步研究该病对奶牛的感染情况,为临床诊断与防控提供依据.[方法]以已发表的牛弓形虫GRA6基因作为检测弓形虫病的目的基因,对上述基因各设计一对引物和一条Taqman探针,该探针5端用荧光基团JOE标记,3端用Eclipse标记,进行单重荧光定量PCR.[结果]经反应条件的优化,建立了能够检测牛弓形虫GRA6基因的荧光定量PCR方法.该方法具有具有较好的特异性和可重复性,对GRA6基因的检测最低限为7×100copies/反应,是普通单重PCR的灵敏度的100倍.[结论]用该方法对58份临床样品进行检测,有12份样品存在弓形虫感染,阳性检出率为20.69;,可用来对弓形虫进行快速、准确的检测.     

稻谷中转Bar基因水稻含量的实时荧光定量检测

本研究以转Bar基因稻谷外源基因片断(Bar,CaMV35s)为检测对象,应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)法建立稻谷中转Bar基因稻谷成分的定量检测方法.分别设计两对内参基因(SPS,RBE4)引物和外源基因(Bar,CaMV35s)引物,应用RT-PCR法对混合稻谷中不同量转Bar基因稻谷(30%、20%、10%、5%、0.9%、0.5%)进行定量检测,检测结果分别为:1、SPS与Bar基因组34.22%、22.14%、11.36%、6.21%、0.74%、0.32%;2、RBE4与Bar基因组28.68%、17.26%、11.92%、6.24%、0.75%、0.35%;3、SPS与CaMV35s基因组32.23%、21.87%、11.15%、4.35%、0.7%、0.37%;4、RBE4与CaMV35s基因组32.35%、22.54%、8.62%、4.62%、0.71%、0.36%.综合分析得出SIS与CaMV35s基因组合对转Bar基因稻谷定量检测的结果较为准确,可见RT-PCR法可以作为定量检测稻谷中转Bar基因稻谷成分的可信方法之一,但其准确性随转Bar基因成分含量的降低而降低,且与所选择的内参基因和外源基因引物有关.     

实时荧光定量PCR定量方法研究进展

实时荧光定量PCR以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点而成为了分子生物学研究中的重要工具,综述了实时荧光定量PCR技术及其定量方法的研究进展,并展望了其应用前景。     

人参实时荧光定量PCR鉴定方法的建立

根据人参和人参属其他物种的18S rRNA基因序列差异设计特异引物和探针,建立人参TaqMan实时荧光PCR鉴定方法.应用该方法测试58个样品,包括30个不同来源的人参样品、 15个其他人参属样品以及13个形态近似样品.结果表明：所有供试的人参样品均表现为阳性扩增,非人参及空白对照均未出现阳性扩增.灵敏度检测结果显示：此实时荧光PCR方法的最低检测限为0.03 pg/μL反应.此方法可快速、准确、灵敏地鉴定人参及其加工产品,适用于口岸进出口鉴定.     

鹅生长激素受体基因荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中鹅生长激素受体(GHR)基因序列设计合成了引物和探针,对荧光定量PCR的方法进行了方法学的评估,建立了TaqmanMGB荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,由pMD-18T-GHR所构建的标准曲线线性关系良好,建立的GHR基因荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强(可以检测出低于10个拷贝/μl的样品),准确可靠。籽鹅和莱茵鹅GHRmRNA出壳到90日龄生长过程中肝脏中的表达量不同,30日龄不同组织的表达量各有变化特点。     

泛素/26S蛋白酶体途径在水稻中的生物学功能研究进展

生物体内的蛋白质降解方式有两种,一种不需要能量,一种需要能量。而泛素/26S蛋白酶体途径便是目前已知的依赖ATP、高效、有高度选择性的蛋白降解途径。它介导了真核生物中80%~85%的蛋白质降解,几乎参与到植物生长发育的各个环节,是植物体内蛋白高效专一降解最重要、最精细的调控机制之一。概述了泛素蛋白酶体途径,重点阐述了泛素结合酶E2和泛素连接酶E3的蛋白结构及其在水稻生长发育、激素信号传导、生物和非生物胁迫响应中的生物学功能及机制,并对进一步研究进行了展望,将有助于揭示泛素/26S蛋白酶体途径在水稻生长发育中的精细调控过程,并为水稻抗逆育种提供了指导和借鉴。     

铁观音茶树RING型E3泛素连接酶基因克隆及其干旱胁迫下的表达分析

以铁观音茶树为试材,对其中E3泛素连接酶基因进行克隆和生物信息学分析,并采用qPCR进行不同干旱条件下的定量表达分析。研究结果表明,该序列全长为1 138bp,开放阅读框(ORF)为810bp,编码269个氨基酸(GenBank登录号KR819177)。生物信息学分析发现该铁观音茶树E3泛素连接酶基因不含跨膜结构以及信号肽,具有多个磷酸化位点,亚细胞定位于叶绿体中。经BLAST比对,该基因编码的氨基酸序列与烟草、亚麻荠、葡萄、醉蝶花、芜菁中的E3泛素连接酶基因编码的氨基酸序列分别有51%、50%、50%、50%和49%的同源性,且相关保守功能结构域翻译的蛋白质序列具有RING-finger结构,初步确定该基因为铁观音茶树的E3泛素连接酶基因。qPCR分析结果显示在不同干旱胁迫处理下铁观音茶树的E3泛素连接酶基因的表达量,与对照组相比显著增加。本研究认为铁观音茶树RING型E3泛素连接酶基因参与茶树抗旱响应机制。     

寒地水稻种质资源稻瘟病抗性研究

为了筛选出优异的水稻稻瘟病抗性材料,收集并整理我国黑龙江省、吉林省、辽宁省以及日本、韩国共203份水稻种质资源,按照不同的育成时期、来源进行分类,利用2a的抗病鉴定结果进行资源评价。结果表明:旱育稀植时期育成的品种稻瘟病抗性有很大的提高,韩国的水稻资源有更好的稻瘟病抗性。资源的年际间抗性有差异,应对材料进行多年、多点的鉴定。因此,在利用自然条件对育种材料抗稻瘟病筛选后,用接菌的方式对自然感病筛选出的未发病材料进行接菌鉴定能提高抗病鉴定的准确性。     

Highly Sensitive and Specific Monoclonal Antibody-Based Serological Methods for Rice Ragged Stunt Virus Detection in Rice Plants and Rice Brown Planthopper Vectors

Rice ragged stunt virus（RRSV） is a serious rice disease in Asia, causing serious yield losses on rice. The capsid protein（CP） gene of the major outer capsid protein of RRSV was expressed in Escherichia coli BL21（DE3） using the pMAL-C2 X expression vector. The recombinant protein was used as the immunogen to immunize BALB/c mice. A hybridoma cell line 8A12 secreting monoclonal antibody（MAb） against RRSV was obtained by fusing mouse myeloma cells（Sp 2/0） with spleen cells from the immunized BALB/c mice. Western blot analysis showed that the MAb 8A12 can specifically react with RRSV CP. Using the MAb, an antigen-coated-plate enzyme-linked immunosorbent assay（ACP-ELISA）, a dot enzyme-linked immunosorbent assay（dot-ELISA）, and immunocapture-RT-PCR（IC-RT-PCR） assay were developed to detect RRSV. The established ACP-ELISA, dot-blot ELISA and IC-RT-PCR methods could detect RRSV in infected rice tissue crude extracts with dilutions of 1：40 960, 1：1 280 and 1：655 360（w/v, g mL-1）, respectively. The ACP-ELISA and dot-blot ELISA methods could detect RRSV in infected insect vector crude extracts with dilutions of 1：12 800 and 1：1 600（an individual planthopper μL-1）, respectively. The field survey revealed that Rice ragged stunt disease occurs on rice in Hainan, Yunnan, Guangxi, Sichuan, Guizhou, Fujian, Hunan, Jiangxi and Zhejiang in China.     

Development of Insect-Resistant Hybrid Rice by Introgressing the Bt Gene from Bt Rice Huahui 1 into 11-32A/B,a Widely Used Cytogenic Male Sterile System

Huahui 1 is an elite transgenic male sterile restorer line of wild rice abortive-type that expresses a Bacillus thuringiensis （Bt） δ-endotoxin and provides effective and economic control oflepidopteran insects. To exploit Huahui 1 to develop a new Bt rice, the insertion site of the Bt gene was determined by thermal asymmetric interlaced PCR （TAIL-PCR）. Bt was located in the promoter region ofLOC. Os10g10360, approximately 5.35 Mb from the telomere of the short arm of chromosome 10. For the first time, a Bt cytoplasmic male sterile （CMS） system was developed by introgressing Bt from Huahui 1. The recipient CMS system used consisted of Indonesia paddy rice-type II-32B （maintainer line） and II-32A （male sterile line）. Marker-assisted selection was used to increase selection efficiency in the backcrossing program. In BC5F1, the Bt plant 85015-8 was selected for further analyses, as it had the highest SSR marker homozygosity. In addition, the linkage drag of the foreign Bt gene in 85015-8 was minimized to 8.01-11.46 Mb. The foreign Bt gene was then delivered from 85015-8 into II-32A. The resultant Bt II-32A and Bt II-32B lines were both resistant to lepidopteran in field trials, and agronomic traits were not disturbed. The maintainability of II-32B, and the male sterility and general combining ability of II-32A, were not affected by the Bt introgression. This study demonstrates a simple and fast approach to develop Bt hybrid rice.     

粳稻三系亲本的杂种优势研究

本研究收集具有代表性的BT型粳稻不育系、保持系及恢复系各16个,共配制229个杂交粳稻组合,就粳稻的杂种优势问题进行了较系统的研究,结果：杂交粳稻普遍存在较强的中亲优势,但多数性状的超亲优势不强,在生长势上则表现非常明显的竞争优势。杂交粳稻大穗优势突出,但结实率多表现为负向优势,是目前制约杂交粳稻产量优势发挥的主要限制因素。     

寒地水稻种质资源产量构成因素与产量的关系研究

为选育优质高产水稻品种,将寒地水稻种质资源按照不同的栽培方式,分为直播时期水稻品种、育苗移栽时期水稻品种和旱育稀植时期水稻品种三个群体,并对其产量构成因素与产量的关系进行研究。结果表明:三个时期的寒地水稻种质资源中,旱育稀植时期的水稻品种的各产量构成因素均在合适的数值范围,对其产量均有贡献。同时研究提出在旱育稀植的栽培条件下,水稻新品种的育种目标是适高抗倒,少蘖、大穗、密穗,抗病虫,耐冷,出米率高,优质,根系活力强,叶片上举,活秆成熟等。     

基于空间分析的黑龙江稻瘟病重点发生区域识别

黑龙江是北方重要稻作区,稻瘟病是影响水稻产量的主要病害之一。依据稻瘟病测报调查规范,基于近5年黑龙江稻瘟病乡村监测点调查数据,利用空间分析技术的方法,分析黑龙江稻瘟病重点发生区县和核心发生区域,提取稻瘟病重点发生乡村监测点。结果表明,近5年黑龙江稻瘟病发病面积占调查面积的7.3%,发病等级以1级为主,整体发生较轻,稻瘟病重点发生区域主要分布在松花江上游地区哈尔滨市的阿城、尚志、方正、延寿、通河、依兰沿线和松花江下游三江平原地区佳木斯市的富锦、同江一带,以及嫩江流域大庆市的肇源县和齐齐哈尔市的讷河市以及呼兰河流域绥化市北林区,并提取了98个叶瘟和47个穗颈瘟重点监测点。上述结果为黑龙江稻瘟病调查监测区域和监测点的布局优化提供了重要依据,为稻瘟病测报防控工作提供重要的支撑。     

水稻C端结合蛋白家族基因OsCtBP-A的克隆及表达分析

利用5′-RACE方法克隆了在水稻与白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,简称Xoo)互作过程中下调表达的水稻C端结合蛋白家族基因OsCtBP-A的全长序列。通过生物信息学方法分析了该基因及编码蛋白质的结构特征,OsCtBP-A由424氨基酸组成,N端具有2-Hacid_dh_C保守结构域,C端具有植物CtBPs家族特有的NLS和PEST基序,氨基酸序列与拟南芥和牵牛花CtBPs同源物的同源性为63%;基因启动子区推测具有ABA和SA应答调控元件。OsCtBP-A基因对不同信号分子应答的RTQ-PCR分析表明,水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、乙烯(ETH)和脱落酸(ABA)处理水稻后均能诱导该基因的转录表达,但诱导能力有所差异,其中ABA诱导活性最强。     

我国双季稻全要素生产率的时空分析及对策建议

提高双季稻生产率对于当前我国粮食稳产保供具有重要意义。基于加总数量全要素生产率测算方法,利用2004—2018年全国9个双季稻主产省份数据,分析我国双季稻全要素生产率及其分解指数变动情况。结果表明：2004—2018年我国早籼稻、晚籼稻的全要素生产率分别为1.081、0.931;双季稻全要素生产率在2004—2008、2014—2018年小幅上升,在2009—2013年波动下降;全要素生产率的增长主要来自技术进步和规模扩张的贡献;在双季稻优势产区中,长江流域的全要素生产率指数高于东南沿海,其中规模的扩大起决定性作用。因此,建议发挥主产区优势,把适度恢复双季稻生产作为粮食稳面积、保产量的有效途径,进一步提高良种采用率及机械化水平,加大政策支持力度,保障种稻基本收益,激励农户重拾种植积极性。