烟碱酰胺合成酶基因的原核表达及多克隆抗体制备

以重组克隆质粒p0390-MF-NASHOR1为模板,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增出烟碱酰胺合成酶基因(nas)片段并将其克隆到原核表达载体pGEM-KG中,获得重组表达质粒pKG-NAS。将此重组表达载体质粒转化到大肠杆菌DH5α中,经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达。聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-poly acrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)结果显示,烟碱酰胺合成酶基因在大肠杆菌中成功表达,表达的烟碱酰胺合成酶融合蛋白分子量大约为61 kDa。将初步的纯化产物作为免疫原去免疫新西兰大白兔制备兔抗烟碱酰胺合成酶血清,用蛋白免疫印迹法(western blot-ting)对制备的兔抗血清中的多克隆抗体进行了鉴定,显示该抗体具有较好的特异性。烟碱酰胺合成酶基因多克隆抗体的成功制备为检测该基因在草坪草中的表达提供了可靠的手段和技术平台,为进一步阐明该基因的作用机理奠定了基础。     

马γ-干扰素成熟蛋白基因在大肠埃希氏茵中表达及其多克隆抗体制备

采用RT-PCR从ConA刺激的马外周血单核细胞（PBMC）中扩增获得含信号肽的马γ-干扰素（Equine interferon-γ，EIFN-γ）基因，将其克隆至载体pCR2．1-TOPO中。通过PCR方法从重组质粒（pCR-EIFN-γ）中扩增马干扰素成熟蛋白（MatureEIFN-γ，mEIFN-γ）基因，并将其亚克隆至原核表达载体pET-28a（＋）。重组子经测序鉴定正确后转化至大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导，对其产物进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定，将纯化后的表达产物免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。结果表明，mEIFN-γ基因全长为441b口，含一个开放阅读框，编码146个氨基酸的成熟蛋白；对其表达产物以可溶性和包涵体两种形式存在，重组蛋白相对分子量约为18Ku，且具有免疫反应活性。mEIFN-γ基因在大肠杆菌中高效表达并在非变性和变性条件下，采用Ni^＋亲和层析纯化方法均可获得高纯度的重组马γ-干扰素制备的多克隆抗体，为建立马γ-干扰素检测方法、监测机体免疫状态和研究机体免疫机制奠定了基础。     

马γ-干扰素成熟蛋白基因在大肠埃希氏菌中表达及其多克隆抗体制备

采用RT-PCR从ConA刺激的马外周血单核细胞(PBMC)中扩增获得含信号肽的马γ-干扰素(Equine interferon-γ,EIFN-γ)基因,将其克隆至载体pCR2.1-TOPO中。通过PCR方法从重组质粒(pCR-EIFN-γ)中扩增马干扰素成熟蛋白(Mature EIFN-γ,reEIFN-γ)基因,并将其亚克隆至原核表达载体pET-28a( )。重组子经测序鉴定正确后转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,对其产物进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,将纯化后的表达产物免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。结果表明,mEIFN-γ基因全长为441bD,含一个开放阅读框,编码146个氨基酸的成熟蛋白;对其表达产物以可溶性和包涵体两种形式存在,重组蛋白相对分子量约为18Ku,且具有免疫反应活性。mEIFN-γ基因在大肠杆菌中高效表达并在非变性和变性条件下,采用Ni~ 亲和层析纯化方法均可获得高纯度的重组马γ-干扰素制备的多克隆抗体,为建立马γ-干扰素检测方法、监测机体免疫状态和研究机体免疫机制奠定了基础。     

小鼠骨桥蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

为探索骨桥蛋白(OPN)调控骨代谢及与肿瘤的关系,本试验利用DNAMAN与Mega 5.02软件分析OPN蛋白系统进化关系;采用RT-PCR与分子克隆方法制备OPN蛋白表达载体;利用SDS-PAGE电泳切胶纯化、尿素浓度梯度复性获得OPN蛋白,免疫小鼠制备OPN蛋白多克隆抗体;采用ELISA法检测抗体滴度,Western blotting检测抗血清特异性。OPN序列的同源性比对分析发现,在不同进化层次动物中均存在Arg-Gly-Asp(RGD)短肽重复序列;OPN序列系统进化分析显示,OPN在动物间具有明显的进化趋势;提取小鼠肝脏RNA,OPN重组载体双酶切、DNA测序鉴定结果及蛋白表达、纯化条带大小均与预测一致;ELISA法确认OPN抗血清滴度达1:1 600;Western blotting证实抗血清具有很好的特异性。结果表明本试验对OPN序列进行了遗传进化分析,成功克隆、表达、纯化及复性OPN蛋白,并制备、鉴定了小鼠多克隆抗体。     

猪CCL2的原核表达及其多克隆抗体的制备

CCL2作为一种典型的促炎因子,在病毒感染、各类肿瘤、自身免疫疾病等许多病症的发生、发展中都有着举足轻重的意义,然而猪的CCL2研究鲜有报道。本研究使用PCR方式扩增CCL2基因,将其克隆于大肠杆菌原核表达系统的pET-28a(+)表达载体中,成功构建重组表达质粒pET-28a(+)-CCL2,转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,再经0.1mmol/L的IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果表明猪CCL2蛋白在大肠杆菌中获得可溶性表达。将CCL2蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,4次免疫后收集血清,通过ELISA方法检测其效价达到1∶128 000。Western blot和IFA测定结果显示本研究获得的猪CCL2多克隆抗体具有较好的特异性。本研究获得的猪CCL2蛋白和针对CCL2的兔多克隆抗体为未来研究猪CCL2的在疾病中的相关作用及生物学功能提供了试验材料。     

牛白细胞介素2基因原核表达及多克隆抗体制备

根据GenBank发表的牛白细胞介素2(BoIL-2)基因序列,设计1对特异性引物,应用RT-PCR技术扩增出重组牛白细胞介素2(rBoIL-2)基因。将克隆片段与pMD18-T载体连接,并经过酶切及PCR鉴定,测序结果显示,克隆的BoIL-2基因与GenBank发表的BoIL-2基因序列同源性为98.7%。将测序正确的克隆片段与pET30a(+)载体连接,构建重组表达质粒pET30a(+)-rBoIL-2,通过双酶切及PCR鉴定阳性的重组质粒进行序列测定后在大肠杆菌的表达,分子质量约为23.49 ku;表达产物主要分布在包涵体中。Western blotting证实所得到的重组蛋白为BoIL-2重组蛋白。用镍离子亲和树脂对所得的BoIL-2重组蛋白进行纯化,并免疫新西兰兔成功制备兔抗rBoIL-2多克隆抗体,为下阶段的研究提供了重要的试验材料。     

鸭凝血因子Ⅷ的原核表达及多克隆抗体制备

为制备鸭凝血因子Ⅷ的多克隆抗体,试验根据抗原决定簇预测软件对鸭Ⅷ因子全基因序列进行分析,发现Ⅷ因子主要抗原决定簇位于C端,对鸭ⅧC端(Ⅷ-C)进行密码子优化、原核表达;免疫小鼠制备多抗,并利用ELISA测定效价.结果显示,优化后的Ⅷ-C能在Escherichia coli表达;Ⅷ-C在Escherichia coli ...     

猪伪狂犬病病毒EP0蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

为了对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)EP0蛋白进行原核表达并制备其多克隆抗体,试验以PRV HeN1毒株为模板,构建了EP0基因原核重组质粒pET28a-EP0,经测序鉴定后,将pET28a-EP0重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中以表达重组蛋白His-EP0;确认重组蛋白His-EP0表达后,用Ni-NTA柱纯化重组蛋白,并用纯化的重组蛋白免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,进行Western-blot测定,用间接ELISA法测定多克隆抗体效价,用间接免疫荧光法测定多克隆抗体的特异性。结果表明：EP0蛋白原核表达成功,His-EP0蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中以可溶性蛋白形式表达,大小在55～70 ku之间;EP0蛋白多克隆抗体制备成功,抗体效价在1∶160 000以上,且能与表达的重组蛋白His-EP0及PRV感染的细胞发生特异性反应。说明试验成功表达了EP0蛋白,并成功制备了EP0蛋白多克隆抗体,抗体效价可达到1∶160 000以上,且特异性较好。     

猪MAVS基因原核表达载体的构建及其多克隆抗体的制备

通过RT-PCR从PK-15细胞系中扩增克隆MAVS(mitochondrial antiviral signaling protein)基因,构建原核表达载体p ET-MAVS220,转化感受态细胞Rosetta(DE3),利用IPTG诱导表达,重组MAVS经纯化后免疫4周龄昆明系小鼠制备抗线粒体抗病病毒信号蛋白(MAVS)多克隆抗体。诱导表达的最佳条件为IPTG 0.05 mmol/L,37℃诱导6 h,重组MAVS以可溶性蛋白和包涵体两种形式表达。应用该重组蛋白免疫小鼠获得的抗MAVS多克隆抗体与纯化的重组MAVS蛋白反应效价可达1∶16 000;该抗体与Poly(I∶C)刺激PK-15细胞产生的MAVS及与转染了重组MAVS基因真核表达载体pcDNA3.0-MAVS的BHK-21细胞表达的MAVS蛋白发生特异性反应,效价可达1∶1 000,特异性良好。     

山羊c-Myc原癌基因原核表达和多克隆抗体的制备

c-Myc原癌基因与胚胎干细胞(ES细胞)和诱导的多能性干细胞(iPS细胞)生物学特性密切相关,因此制备其相应的多克隆抗体尤为必要。本研究以pMD18T-Myc质粒为模版,PCR扩增c-Myc片段,然后将其亚克隆到pSE380表达载体上,获得pSE380-Myc重组质粒。该质粒转化工程菌BL21(DE3),IPTG诱导表达His-Myc融合蛋白,随后用SDS-PAGE电泳及Western blot加以验证。在变性条件下用Ni-NTA argrose介质分离纯化His-Myc融合蛋白,并以此为抗原免疫新西兰大白兔。经过4次免疫,采集血液、分离血清,用Western blot检测抗体特异性。结果表明:(1)pSE380-Myc重组质粒在工程菌BL21(DE3)得到了高效表达;(2)得到了高纯度高含量的His-Myc融合蛋白;(3)经Wstern blot检测发现,c-Myc多克隆抗体与His-Myc融合蛋白能够特异性结合。本研究获得的特异性山羊c-Myc多克隆抗体,为进一步研究山羊ES细胞和iPS细胞的自我更新机制奠定了基础。     

牦牛EPF的原核表达及多克隆抗体制备

本试验旨在制备牦牛早孕因子(early pregnancy factor,EPF)多克隆抗体,为牦牛妊娠早期高效快速诊断技术研究奠定基础.采用RT-PCR方法,从牦牛胎盘和卵巢组织中提取RNA,反转录为模板后进行EPF基因扩增,并将其克隆到改造后的载体pET28-His10-Sumo上,构建pET28-His10-Su...     

磺胺类药物广谱性多克隆抗体的制备

基于磺胺类药物(Sulfonamides,SAs)公共母环(对氨基苯磺酰胺)结构,合成了两种具有该结构的半抗原∶2-(对氨基苯磺酸氨基)-4-噻唑乙酸(TS)和对氨基苯磺酰胺基苯甲酸(SS).采用碳二亚胺法合成了免疫原和包被原,分别免疫10只新西兰大白兔,制备广谱性磺胺类药物抗体.应用间接竞争酶联免疫吸附分析(ELISA)检测血清的灵敏度和特异性,发现所有兔子对TS-BSA和SS-BSA均产生较高效价和特异性.其中SS-1号和TS-6号兔的血清灵敏度最好,效价分别为1∶80 000和1∶160 000,对10种磺胺类药物均有不同程度的识别能力.SS-BSA组IC50为257.9～6 590.9 ng/mL,而TS-BSA组IC50为12.9～586.1 ng/mL.结果表明,具有磺胺母环结构的半抗原TS和SS,可以应用于广谱性磺胺类抗体的制备.通过10只兔子免疫试验证明,应用SS获得的血清具有较高的簇特异性、相似的亲和性,优于TS.     

鸡白痢沙门氏菌IPAJ蛋白的表达纯化、多克隆抗体制备及ELISA方法的建立

【目的】试验旨在建立以鸡白痢沙门氏菌的毒力相关基因所编码的IPAJ蛋白为抗原的间接ELISA方法。【方法】PCR扩增IPAJ基因并连接到pCzn1表达载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPAJ基因重组蛋白用IPTG进行诱导表达并纯化,通过Western blotting验证蛋白的反应原性。用纯化的IPAJ蛋白免疫60日龄试验兔,共免疫3次,制备其多克隆抗体,通过ELISA方法检测抗体效价。采用方阵滴定法优化以IPAJ蛋白作为诊断抗原的ELISA条件,初步建立以IPAJ蛋白为诊断抗原的间接ELISA方法,并与平板凝集试验结果进行比较。【结果】试验成功构建鸡白痢沙门氏菌IPAJ原核表达载体,并以包涵体形式纯化出重组蛋白,具有良好的反应原性。Western blotting分析结果显示,成功表达出32 ku的IPAJ蛋白,具有良好的特异性。间接ELISA检测结果显示,多克隆抗体效价为1∶25 600,表明成功制备出多克隆抗体。建立的以IPAJ蛋白为诊断抗原的间接ELISA方法的最佳优化条件为：抗原包被浓度为5μg/mL,5%脱脂奶粉封闭1.5 h,一抗最佳稀释浓度为1∶250...     

牛肠道病毒VP2基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

应用RT-PCR方法扩增牛肠道病毒(Bovine enterovirus,BEV)VP2基因,构建重组质粒pET32a(+)-VP2。转化大肠杆菌菌株BL21,IPTG诱导其表达VP2融合蛋白,Western-blot检测目的蛋白。将纯化的重组蛋白(pET32a(+)-VP2)免疫新西兰大白兔,制备VP2多克隆抗体,iELISA方法检测抗体效价,同时利用血清中和试验评估其诱导中和抗体的能力。SDS-PAGE分析结果显示,融合蛋白的相对分子质量为50 000,与预期值大小相符;iELISA检测其抗体效价为1∶25 600;血清中和试验表明,原核表达的VP2蛋白诱导产生的中和抗体效价为1∶107.4。结果表明,成功克隆和表达了具有免疫原性的VP2蛋白,其可诱导产生较高效价的多克隆抗体,为BEV血清学诊断方法的建立及亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

猪NLRP6蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

试验旨在表达、纯化猪NLRP6蛋白,并制备鼠抗NLRP6多克隆抗体。根据猪NLRP6全基因核苷酸序列（GenBank登录号：XM_003124236.4）设计特异性引物,利用PCR方法从pMD-19T-NLRP6重组载体中扩增NLRP6基因片段,将扩增产物与原核表达载体pET-32a（+）连接,获得重组质粒pET-32a-NLRP6,经抗性筛选阳性菌、双酶切鉴定、PCR及测序分析后,将其转化大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞中,并进行IPTG诱导表达及Western blotting鉴定。对获得的重组融合蛋白进行可溶性分析,经变性、镍柱亲和纯化、复性后得到纯化的融合蛋白,将其免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,试验成功克隆大小约为576 bp的NLRP6基因序列,经鉴定重组质粒pET-32a-NLRP6构建正确,通过IPTG诱导获得大小约34 ku的NLRP6重组融合蛋白,Western blotting分析表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体呈阳性反应。可溶性分析结果显示,NLRP6重组融合蛋白以包涵体形式存在,约占95%。纯化的NLRP6重组融合蛋白免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,经Western blotting分析显示出特异性反应。本试验成功制备了具有免疫原性的NLRP6蛋白及其鼠源多克隆抗体,为NLRP6蛋白生物学功能及相关疾病致病机制研究提供了基础材料。     

鸭黄病毒多克隆抗体的制备及鉴定

本试验旨在建立鸭黄病毒多克隆抗体.将鸭黄病毒在鸡胚中增殖,收集尿囊液,检测尿囊液中增殖的鸭黄病毒EID50为1.8×105/mL.制备免疫原.制定免疫程序,用此免疫原免疫家兔.免疫程序实施完毕后,收集兔抗鸭黄病毒血清,用间接ELISA的方法测定兔抗鸭黄病毒多克隆抗体的量显示,多克隆抗体的量随免疫天数的增加而增多.用饱和硫酸铵盐析其中的IgG,检测其含量为20.3mg/mL.该研究为进一步建立鸭黄病毒病的ELISA检测方法奠定了实验基础.     

鸡γ-干扰素基因的克隆及原核表达

参照Digby发表的鸡γ-干扰素的核苷酸序列，设计一对引物，应用RT—PCR技术，从ConA诱导过的鸡脾淋巴细胞中特异性地扩增出大小约为500bp的基因片段。将该扩增基因进行克隆测序，结果表明其序列与Digby报道的CHIFN-γ基因序列的同源性达100％。将该基因插入原核表达载体pGEX-4T-γ中构建成重组表达载体pGEX—CHIFN-γ，并将其导入大肠杆菌BL21中，诱导表达的重组蛋白经SDS—PAGE分析，分子量约为43ku，表明所克隆的CHIFN-γ基因在原核细胞中得到了表达。     

牛γ干扰素基因的表达及其多克隆抗体的制备

为了获得牛γ干扰素表达产物及其多克隆抗体,利用分子生物学软件分析GenBank公布的牛γ干扰素的氨基酸序列,针对这一基因序列设计了一对特异性引物,并从牛脾脏淋巴细胞提取基因组总RNA,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增出IFN-γ基因,与pMD18-T载体连接后进行酶切、PCR扩增以及序列测定和分析,并将...     

鸡γ-干扰素基因的克隆及原核表达

参照Digby 发表的鸡γ-干扰素的核苷酸序列,设计1对引物,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从Con A诱导过的鸡脾淋巴细胞中特异性的扩增出大小约为 500 bp的基因片段。将该扩增基因进行克隆测序,结果表明其序列与Digby报道的CHIFN-γ基因序列的同源性达100%。将该基因插入原核表达载体pGEX-4T-1中构建成重组表达载体pGEX-CHIFN-γ,并将其导入大肠杆菌BL21中,诱导表达的重组蛋白经 SDS-PAGE 分析分子质量约为 43 ku,表明所克隆的CHIFN-γ 基因在原核细胞中得到表达。     

犬冠状病毒N蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

本研究旨在克隆犬冠状病毒（canine coronavirus,CCV）N基因,体外表达N蛋白,并制备抗该蛋白质的多克隆抗体,用于CCV的诊断及其抗原的检测。参考GenBank中CCV的N基因序列（登录号：KY063618.2）,选择CCV流行毒株的N基因,通过对该基因密码子进行优化和基因合成,最后选择一段有效基因构建重组表达质粒pET-B2M-N,将成功构建的重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆提取质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,通过0.5 mmol/L IPTG 30 ℃进行诱导表达。结果表明,优化诱导条件后成功表达出大小约为49 ku的重组蛋白。将重组蛋白与弗氏佐剂按一定比例混合,每隔2周免疫G767、G768两只日本大耳白兔数次,用间接ELISA检测G768抗体效价可达1∶512 000,选用G768抗体进行抗体纯化,纯化后浓度可达10 mg/mL,用间接ELISA、Western blotting和间接免疫荧光试验对N蛋白纯化后制备的兔多克隆抗体进行检测分析,表明表达的重组N蛋白免疫原性良好,制备的多克隆抗体具有良好的反应原性。本研究为犬冠状病毒抗原抗体检测以及靶标CCV诊断试剂盒的建立奠定了一定的基础。