地方株马驽巴贝斯虫Bc48截短体单克隆抗体的制备及应用

本研究旨在建立马驽巴贝斯虫抗体的快速、准确检测方法。以纯化的马驽巴贝斯虫Bc48基因片段的原核表达产物免疫6周龄雌性BALB/c小鼠制备单克隆抗体,并利用重组抗原与单克隆抗体建立间接竞争ELISA(CI-ELISA)方法检测马驽巴贝斯虫抗体。结果显示:制备出3株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为1H2、7F4、11F4,通过对CI-ELISA条件筛选得出,抗原最佳包被浓度为0.19μg·mL~(-1),单克隆抗体11F4的最佳工作浓度为1∶3.2×10~5,通过检测30份马驽巴贝斯虫阴性血清及20份阳性血清,确定该检测方法临界值为45%;特异性试验发现,该CI-ELISA方法不与感染马泰勒虫病的阳性血清发生反应,具有特异性;用所建立的CI-ELISA检测临床血清90份,与标准c-ELISA试剂盒总符合率为92.2%、阳性符合率92.1%、阴性符合率94.1%。试验结果表明,该CI-ELISA方法特异性强,敏感性高,稳定性和重复性好,操作简便。基于单克隆抗体(11F4)与重组蛋白(HIS-Bc48)所建立的CI-ELISA特异性、重复性好,可为新疆马驽巴贝斯虫的检测、监控提供有效手段。     

马驽巴贝斯虫Bc48蛋白的纯化及其应用

为了解新疆南北疆部分疫区马匹携带驽巴贝斯虫(Babesia caballi)抗体情况,运用实验室已构建保存的地方虫株重组Bc48为靶抗原,将重组原核表达质粒pGEX4T-1-Bc48转化至BL21表达系统中,诱导表达出36 KDa的重组蛋白。经KCl法切胶纯化重组蛋白后作为rELISA包被抗原,对阿克苏、伊犁、和硕等7个区域的随机采集样品(n=256)进行马驽巴贝斯虫抗体检测。结果显示,Bc48重组抗原能够精确识别马驽巴贝斯虫标准阳性和阴性血清;所检测的临床样品中,驽巴贝斯虫抗体阳性率为19.5%,其中,南疆2个地区(和硕、阿克苏)马驽巴贝斯虫病阳性率分别为30%、9%;北疆5个地区(昭苏种马场、伊犁卡拉苏、洪纳海乡、阿尕什敖包乡和富蕴县区域)马驽巴贝斯虫抗体阳性率分别为17%、12.5%、17%、5%和35%。本次调查结果为新疆驽巴贝斯虫防控措施及疫苗和驱虫药的使用提供必要的理论依据。     

南北疆部分地区马驽巴贝斯虫病血清学调查

为了解南北疆养殖马区域马匹感染驽巴贝斯虫情况,笔者采用竞争性酶联免疫吸附试验(eELISA)与血涂片镜检法相结合的试验法,对伊犁和巴州两地区马匹随机抽样(N--454),进行驽巴贝斯虫病血清学调查。经c-Elisa调查发现,驽巴贝斯虫状况(呈抗体阳性)总感染率为33.2%;其中北疆4县马驽巴贝斯虫感染率分别15.8%、7.9%、5.7%和2.6%;南疆和静县感染率为O.4%。经血液涂片检查发现极少部分抗体阳性全血发现虫体,其总阳性率6.6%。无临床症状的马匹血清抗体阳性率高说明该地区存在‘传染源'、传播蜱虫,故加以防范。     

马梨形虫病病原双重荧光PCR快速检测方法的建立与应用

在序列比对分析的基础上,设计2对引物和2条MGB探针,经体系优化建立了可快速鉴别检测两种马梨形虫病病原（马泰勒虫和驽巴贝斯虫）的双重荧光PCR检测方法。该方法可分别检出22和31基因拷贝的虫体DNA,且不与其他马病病原发生交叉反应。应用建立的荧光PCR检测方法,对采自进出口马匹的10份马全血和20份马血清进行检测,结果从马全血中检出2份马泰勒虫阳性样品。使用一对马泰勒虫EMA1全基因扩增引物,从2份阳性样品中扩增了EMA1基因。克隆测序后,对该基因全序列进行分析,证实其为马泰勒虫特异基因序列;2份样品的基因序列相似性为98.9%,存在6个氨基酸变异;2个样品中的EMA1基因不完全一致,表明2个感染样品中的虫体可能为不同的马泰勒虫虫株。     

检测伊氏锥虫循环抗原的McAb-RPHA试验

用一株抗伊氏锥虫、马媾疫锥虫和布氏锥虫共同抗原(与泰氏锥虫等抗原无交叉反应)的单克隆抗体建立了检测伊氏锥虫循环抗原(TcA)的反向间接血凝试验。用以检测人工感染兔,于感染后8～10天TcA转阴;如不治疗直至观察期结束持续阳性;治疗后一周即转阴。用以检测疫区36份虫血症阳性水牛血清,25份阳性(69.44％);16份虫血症阴性、IHA阳性水牛血清,3份阳性;25份虫血症和IHA阴性水牛血清,全部阴性。     

新疆部分焉耆马场马梨形虫病病原学检测及序列分析

为了解新疆地区焉耆马场马梨形虫病病原感染情况，促进当地马梨形虫病的综合防控和马产业的健康发展，选取5个焉耆马场作为试验点，随机采集156匹焉耆马全血进行马梨形虫病病原DNA检测，并使用SPSS Statistics 17.0、Megalign与MEGA 11.0软件分析不同采样点、不同年龄、不同性别马匹的感染情况差异，同时进行病原核酸的同源性比较和系统进化树构建。结果显示：156匹焉耆马全血样品中，检出马梨形虫病病原核酸阳性82份，其中马泰勒虫、马驽巴贝斯虫和两者混合感染阳性率分别为33.3%(52/156)、26.9%(42/156)和7.7%(12/156)。不同采样点、不同年龄、不同性别焉耆马的马梨形虫病病原阳性率均无显著差异（P> 0.05）。通过Megalign与MEGA11.0软件分析发现：测序得到的马泰勒虫18S rRNA基因序列与选取的参考虫株同源性为95.5%～100%，马驽巴贝斯虫BC-18S rRNA基因序列与选取的参考虫株同源性为98.6%～99.6%。马泰勒虫18S rRNA基因与马泰勒虫伊犁株（OL589505.1）位于同一分支上，进化关系较近，与其他...     

鼻疽固相溶血试验的研究

研究确定用1:2.5～1:3补体与1:2鼻疽血清等量混合后,滴加于含1:5鼻疽抗原致敏红细胞的琼脂糖凝胶反应盘的相应孔中,置于4℃或15～29℃下感4～12h,可以产生直径在8.1mm以上的溶血环。对健马及马传贫等6种传染病马血清做检测,则不引起溶血反应。以31匹M~+马血清的CFT结果和扑杀10匹鼻疽马血清的CFT及病理组织学变化做依据,确定了固相溶血试验(S_p—HLT)的判定标准,即溶血环直径在6.0～7.0mm的为阴性,7.1～3.0mm的为疑似,8.1mm以上的为阳性。以此标准检测了411匹马(来自鼻疽疫区的368匹.鼻疽清净区健马43匹)。结果,疫区马血清CFT阳性率为5.2％,Sp—HLT阳性率为7.6％;43匹健马血清的CFT和Sp—HLT均为阴性。Sp—HLT检测方法简便,快速,检出率较CFT略高,从病理组织学角度考虑并非假阳性。由此认为,用Sp—HLT代替CFT进行鼻疽检疫是可行的。     

广州及其周边地区马梨形虫病血清流行病学调查

为广东从化无规定马属动物疫病区建设的顺利进行和了解周边地区马属动物马梨形虫病的存在情况,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和涂片镜检的方法对广州、东莞和深圳的马属动物进行了马梨形虫病(马巴贝斯虫和驽巴贝斯虫两种虫体)的流行病学调查。结果表明,上述三个地区的马属动物均存在不同程度的马梨形虫病两种虫体的抗体,且出现同一个马场和在同一匹马同时存在两种虫体抗体的情况。对所有抗体阳性马匹进行涂片镜检未发现虫体,也未发现有马梨形虫病临床症状的马属动物。     

马梨形虫病双重PCR检测方法的建立

为了建立马梨形虫病双重PCR检测方法,试验根据Gen Bank发表的驽巴贝斯虫和马泰勒虫18S rRNA保守基因序列分别合成2对特异性引物,以核酸混合物为模板,优化反应条件建立马梨形虫病双重PCR检测方法,并检验该方法的特异性和敏感性。同时用该双重PCR检测方法对采自昭苏种马场的马疑似病例全血进行检测,并与镜检法和单重PCR法进行比较。结果表明:该双重PCR检测方法能对驽巴贝斯虫和马泰勒虫核酸扩增出大小为529 bp和789 bp特异性目的片段,而对双芽巴贝斯虫、环形泰勒虫、羊泰勒虫、牛巴贝斯虫核酸的扩增均为阴性;驽巴贝斯虫和马泰勒虫阳性DNA被稀释1×108倍时均能检出其相应目的片段;对采集的46份马疑似病例血样进行PCR诊断,其中驽巴贝斯虫感染率为30.4%(14/46),马泰勒虫感染率为41.3%(19/46);双重PCR检测方法与单重PCR方法的符合率为100%。说明建立的双重PCR检测方法具有一定的特异性和敏感性,可用于驽巴贝斯虫和马泰勒虫临床感染隐性病例的联合检测与鉴别诊断。     

牛环形泰勒虫ELISA裂殖体抗原制备和应用研究

本文报道了牛环形泰勒虫(Theileria annulata(简称环泰虫)裂殖体抗原的制备和ELISA在诊断环泰虫病、检测免疫牛抗体水平和确定虫种间血清学关系等方面的应用。应用冻融研磨法制备的抗原进行ELISA,检测25头份带虫牛血清,阳性符合率为96％,检测30头份阴性牛血清,阴性符合率为100％;一个样本重复性试验的变异系数为9.52％,多个样本重复试验的结果基本一致。表明ELISA具有较高的特异性和重复性,ELISA检测环泰虫疫区牛,阳性检出率为61.02％(镜检法为38.98％)。ELISA值的高低,与环泰虫带虫牛的红细胞染虫率呈正相关。检测49头份非疫区牛血清,结果均为阴性。用作检测免疫牛抗体水平,32头份重环泰虫裂殖体细胞胶冻苗免疫的牛血清,7个月后ELISA值仍明显高于健牛(未免疫),有62.5％在阳性范围内。检测其他种属虫体血消.不与伊氏锥虫、贝氏贝诺孢子虫和牛肉孢子虫血清发生交叉反应。检测瑟氏泰勒虫血清,有11/12的阳性反应率,初步证实环泰虫与瑟氏泰勒虫有密切的血清学关系。     

云南部分地区马、驴、骡梨形虫感染情况调查

为了解云南地区马驴骡感染马泰勒虫和驽巴贝斯虫情况,采用双抗原夹心ELISA方法对云南8个地区马、驴、骡三种动物（n=969）进行了马泰勒虫和驽巴贝斯虫抗体阳性率的检测。结果显示：梨形虫总抗体阳性率为5.47%,其中马泰勒虫抗体阳性率为4.75%,驽巴贝斯虫抗体阳性率为4.85%,两者混合感染的抗体阳性率为4.13%;通过调查分析发现云南马、驴、骡存在梨形虫感染,且不同地区的不同动物的马梨形虫感染程度不同。本研究结果为马驴骡梨形虫病的流行防控提供了数据参考。     

新疆昭苏地区马梨形虫病病原及抗体检测

马梨形虫病是由马驽巴贝斯虫和马泰勒虫寄生于马属动物的红细胞内所引起的一类血液原虫病,呈全球性分布,尤其在新疆发病率更高,处于逐年上升趋势,对区域性马产业的发展影响极大。为了解2018年新疆昭苏养马区域马梨形虫的感染情况,随机采集昭苏县18个乡镇的马全血及血清各858份,采用PCR和间接ELISA分别进行检测,对两种方法检测的18个地区、不同年龄阶段的马驽巴贝斯虫、马泰勒虫及混合感染情况进行统计学分析。结果显示,PCR检测马驽巴贝斯虫、马泰勒虫及混合感染的阳性率分别为12.12%、13.87%和2.80%;间接ELISA检测马驽巴贝斯虫、马泰勒虫及混合感染的抗体阳性率分别为15.50%、10.14%和2.56%;不同年龄阶段筛查结果显示,在6岁以下的马匹感染马驽巴贝斯虫、马泰勒虫及混合感染的阳性率较高,并且不同地区的不同年龄阶段马匹的马梨形虫感染率存在不同程度的差异。此次获得的昭苏县马梨形虫感染情况的一线数据,可为当地养马区域马梨形虫病的综合防控提供技术支撑。     

阿勒泰部分地区放牧马梨形虫病的流行病学调查

为了解阿勒泰部分地区放牧马梨形虫病的流行情况,笔者运用前期所建立的Taq Man探针实时荧光定量PCR方法结合传统血涂片镜检方法,对吐尔洪乡、克孜勒希勒克牧场及铁买克乡等3个地区的134匹放牧马进行了马梨形虫病的流行病学调查;经FQ-PCR检测得出,以上3个地区的感染率分别为36.96%,45.76%和31.03%,以克孜勒希勒克牧场最为严重;3个地区均以感染驽巴贝斯虫为主;根据年龄段分析,幼驹的感染率高于成年马匹。应用SPSS软件分析得知,不同地区和不同年龄阶段的马匹感染梨形虫病差异不显著(P0.05)。结果表明,阿勒泰地区是马梨形虫病的流行地区。     

新疆部分地区马驽巴贝斯虫病感染PCR检测调查

为了解新疆部分地区马匹感染马驽巴贝斯虫病的流行情况,通过PCR方法对不同地区所采集的样品进行检测,并对不同地区和不同年龄段马驽巴贝斯虫感染情况进行单因素方差分析。结果显示,所检测的504份马血样中,54份血样为阳性,阳性率为10.71%。其中北疆昭苏种马场、阿勒泰、吐鲁番托克逊马驽巴贝斯虫阳性率分别为20.61%、5.17%、0;巴音布鲁克牧场、和静地区马驽巴贝斯虫阳性率分别为0和8.59%。从阳性样品中都检测到了驽巴贝斯虫BC48基因片段,与已知序列的同源性为99%。X≤3,3X≤6,6X≤9,X9四个年龄段马驽巴贝斯虫感染率分别为9.76%、10.53%、11.21%和11.65%。单因素方差分析结果表明,昭苏种马场与阿勒泰、巴音布克牧场分别存在极显著性差异(P0.01);巴音布鲁克牧场与和静也存在极显著性差异(P0.01);昭苏种马场与吐鲁番托克逊存在显著性差异(P0.05),其余各地方差异不显著。各个年龄段马驽巴贝斯虫感染无显著性差异。本试验的研究数据可为研究新疆马驽巴贝斯虫分布特点提供数据支撑。     

阿勒泰富蕴县放牧马驽巴贝斯虫和马泰勒虫抗体的检测初报

马梨形虫病按病程可分为急性、亚急性及慢性,尤其是慢性病例长期携带病原-带虫状态。为了解阿勒泰富蕴县放牧马携带马驽巴贝斯虫和马泰勒虫状况,采用血清学-竞争ELISA方法 (以血液涂片为辅),对放牧马(n=233)进行了马泰勒虫和驽巴贝斯虫2种虫血液循环抗体的检测试验。结果表明:富蕴县放牧马泰勒虫抗体阳性率为13.30%,驽巴贝斯虫抗体阳性率为17.58%,两者混合感染的抗体阳性率为2.15%,说明该县放牧马感染不同程度的马梨形虫病,且出现同一个马场和在同一匹马同时存在2种虫体抗体的情况;在试验抽样病例中几乎未发现有马梨形虫病临床症状,均呈隐性感染状态。因此带虫的放牧马随时有被蜱虫叮咬散播病原的危险,要加强防范。     

间接荧光抗体试验诊断马骡伊氏锥虫病的研究

以人工感染伊氏锥虫的小鼠血液涂片为抗原,建立了IFA试验检测马骡伊氏锥虫抗体的方法,并对伊氏锥虫病马、同群马、健康马、非伊氏锥虫病马血清作了检测。伊氏锥虫病马和无症状同群马的抗体阳性率分别为97％(33/34)和12％(18/150);25匹健康马血清伊氏锥虫抗体均为阴性;84份非伊氏锥虫病马血清的IFA试验均为阴性,未出现交叉反应。多数病马发病一周内的血清IFA试验即为阳性。3匹病马血清抗体消长动态观察结果表明,病马于治疗后110天,血清IFA试验仍为阳性。本试验表明,IFA试验检测马骡伊氏锥虫抗体,敏感性高、特异性强,对无症状的感染马也能检出,可用于本病的早期诊断和血清流行病学调查。     

新疆昌吉部分地区马梨形虫病检测初报

为了解昌吉养殖马区域马匹感染梨形虫病情况,本文采用聚合酶链反应试验(polymerase chain reaction,PCR)与血液涂片镜检法相结合,对昌吉马匹随机抽样(n=78),进行马梨形虫病感染情况调查。血液涂片结果显示,马泰勒虫阳性率6.4%,驽巴贝斯虫阳性率为2.5%;PCR结果显示,马泰勒感染率为28.2%(22/78),驽巴贝斯虫感染率为10.2%(8/78),混合感染率为10.2%(8/78)。通过对采自马的蜱进行了形态学鉴定,共鉴定出4种蜱。该次对昌吉部分地区马梨形虫感染情况的调查结果,为该地区马的健康发展提供了科学依据。     

甘肃省天祝县岔口驿马产区马梨形虫病流行病学调查

岔口驿马是我国优良的地方走马品种，产于甘肃省武威市天祝藏族自治县，为了解岔口驿马产区马梨形虫病(Equine piroplasmosis, EP)感染情况，保护优质种质资源，本课题组开展了EP调查。在16个乡镇采集马血清510份，用ELISA方法进行马巴贝斯虫(Babesia equi,B.equi)和驽巴贝斯虫(Babesia caballi,B.caballi)抗体检测，并对3个乡镇的马匹进行血推片虫体检查。结果显示，510份马血清中B.equi抗体阳性数为34份，阳性率为6.67%;B.caballi抗体阳性数为38份，阳性率为7.45%;120份血样推片镜检，B.equi虫体检出率为4.17%,B.caballi虫体检出率为3.33%。调查结果表明，岔口驿马产区马群中存在EP感染现象。     

驽巴贝斯虫TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速检测驽巴贝斯虫Bc-48基因的方法,本研究根据Bc-48保守基因序列设计合成特异性引物和MGB荧光探针,以构建的重组质粒作为阳性标准品,经条件优化后建立了检测Bc-48基因的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。结果显示,该方法能够特异性检测驽巴贝斯虫,而对其它病原检测均为阴性;该方法最小检出量为5.17×10~1拷贝/μL的标准质粒,敏感性是常规PCR的100倍;组内与组间重复性试验的变异系数均小于1%,重复性好;采用所建立的方法和常规PCR分别对90份临床样品进行检测,结果显示本研究建立的驽巴贝斯虫TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可以用于驽巴贝斯虫病临床样品诊断、流行病学调查。本研究为蜱传马梨形虫病的防控提供新的方法。     

以GST-BC_(48)重组蛋白作诊断抗原对延边地区驽巴贝斯虫病血清流行病学调查

驽巴贝斯虫病是由驽巴贝斯虫 (Bcaballi)引起的一种以高热、贫血、黄疸、出血、呼吸困难等症状为特征的具有一定的地区性和季节性的血液原虫病 ,严重危害养马业的健康发展[1] 。目前在寄生虫病的血清学诊断中常用的虫体抗原有纯化难、制备有限、部分交叉反应等缺点[2 ] ,而重组抗原作为诊断抗原具有敏感性高、特异性强、制备简单、易纯化等优点[3 ,4] 。本试验以重组蛋白作为诊断抗原 ,用ELISA法对延边地区驽巴贝斯虫病进行了血清流行病学调查 ,旨在为制定驽巴贝斯虫病的有效防制措施提供较为系统的流行病学资料。1　材料与方法诊断抗原 …