江苏省西瓜花叶病毒类型的鉴定

1985年从江苏镇江农科所西瓜试验田的西瓜花叶病株上分离到二种病毒分离物,试验的代表分离物分别为W_3和W_(40)。 W_3分离物的寄主范围较窄,除葫芦科植物外,只侵染苋色藜引起褪绿黄斑;体外抗性:失毒温度为50—55℃,稀释限点为10(-4),体外存活期为21天;棉蚜(Aphis gossypii),桃蚜(Myzus persicae)以非持久性方式传毒。病毒粒体为线条形,长度为600—750nm;在病叶细胞的超薄切片内可观察到典型的风轮状内含体。与西瓜花叶病毒二号(WMV-2)抗血清呈阳性反应。W_3分离物是西瓜花叶病毒二号的一个株系。 W_(40)分离物的寄主范围广,除葫芦科植物外,还能侵染茄科、菊科、苋科、豆科等作物。失毒温度为55—60℃,稀释限点10~(-3),体外存活期为3天,棉蚜、桃蚜以非持久性方式传病。与黄瓜花叶病毒(CMV)抗血清呈阳性反应。W_(40)分离物为黄瓜花叶病毒的一个株系。 在86年调查田间西瓜花叶病中,WMV-2占病株的70％,CMV占18％,还有4％左右的混合感染病株。     

侵染大豆的黄瓜花叶病毒(CMV)

在本校育种田的大豆上得到一个病毒分离物——A-1。A-1分离物接种了7个科28个种和品种,而侵染6个科19种植物。A-1分离物很易侵染大豆、菜豆,引起深浅绿色花叶;在豇豆接种叶上产生扩散的褪绿斑,并发展成系统花叶;亦易侵染心叶烟、普通烟、克氏烟、矮牵牛和辣椒等茄科作物,表现系统花叶症状;在苋色藜和番杏上引起局部褪绿斑。但A-1分、离物与番茄上分离的CMV在豆科寄主反应上有差异。A-1分离物可以侵染几种豆科作物,而CMV不侵染大豆和菜豆,仅在蚕豆和豇豆上引起小型的红褐色斑。A-1分离物的体外抗性:失毒温度50℃,稀释限点10~(-2)—10~(-3),体外存活期1—2天。桃蚜以非持久性方式传病。A-1分离物与CMV标准抗血清作琼脂双扩散测定呈阳性反应。根据以上性状,分离物A-1应属于黄瓜花叶病毒组的黄瓜花叶病毒(CMV)。江苏省南京、徐州和山东省薛城、莱西等地采集的140个大豆病毒样本中,CMV占36％。     

侵染西瓜的烟草花叶病毒(TMV)的生物学种类鉴定

从西瓜上分离到病毒分离物XC -3 ,此分离物经人工接种可侵染茄科、葫芦科、苋科、藜科的 16种植物。钝化温度为 96℃ ,稀释限点 10 - 6 ～ 10 - 7,病毒汁液在室温下保存 5 5d以上仍有侵染活性 ,分离物粒体杆状 ,长 3 0 0nm ,宽 18nm ,提纯病毒的紫外线最高吸收峰在 2 60nm ,最小吸收峰在 2 5 0nm ,A2 80 /A2 6 0 =0 .86。经琼脂扩散反应、ELISA检测 ,分离物与TMV的抗血清均呈阳性反应 ,分离物XC -3可能为TMV的一个株系。经过ELISA检测该分离物在安徽省西瓜病样分离物中占 8.65 %。     

苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒对东方粘虫痘病毒的增效作用

苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrosisvirus,AcMNPV)能够增强粘虫痘病毒(Pseudaletia separata entomopoxvirus,PsEPV)的侵染力。将两种病毒的混合悬液滴于50mg的饲料上,接入3龄末东方粘虫(Mythimna separata)的幼虫进行生物测定。当每头幼虫接入1.0×10~4 OBs的AcMNPV和1.0×10~7 OBs的PsEPV的混合液时,幼虫的死亡率为95.00%,而单独用1.0×10~7 OBs·虫~(-1)AcMNPV处理时,则幼虫不感染;单独用1.0×10~7 OBs·头~(-1)PsEPV处理时,只获得46.33%的死亡率。将AcMNPV多角体蛋白与病毒粒子分离,进一步测定,单独用1.0×10~6 OBs·虫~(-1) PsEPV侵染3龄末幼虫时,幼虫不被感染,而用同样浓度再混以AcM- NPV多角体蛋白或病毒粒子时,则会有41.67%和36.67%的死亡率,说明多角体蛋白或是病毒粒子的包涵体蛋白是产生增效作用的重要因子。     

自然侵染豌豆的大豆花叶病毒

从南京郊区豌豆病株上分离到的 P-65分离物,汁液摩擦接种6科25种植物,能侵染8种豆科植物及藜科的苋色藜.体外抗性:失毒温度50～55℃;稀释限点10~(-2)～10~(-3);体外存活期2～3天.桃蚜非持久性传播。病毒粒体线条状,平均长度为750nm.病叶组织中有风轮状及束状内含体.大豆花叶病毒抗血清对该分离物的粒体有强的捕捉和修饰作用,SDS 双扩散试验中可见明显的沉淀线,故该分离物属大豆花叶病毒。     

蝴蝶兰病毒病的病原鉴定

鉴定结果表明,引起厦门地区蝴蝶兰(Phalaennopsis sp.)褪绿斑驳的病原为建兰花叶病毒(Cymbidium masaic virus,CyMV)的一个分离物.该分离物能通过摩擦接种侵染5科12种(或品种)植物中的3科3种;失毒温度为60～65℃,稀释终点为1×10-3～1×10-4,室温下,体外存活期超过10d.提纯病毒粒体线状,长约470～490 nm,宽为13 nm.ELISA测定结果表明,该分离物与建兰花叶病毒抗血清有密切血清学关系,而与黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草花叶病毒(TMV)及齿兰环斑病毒(ORSV)的抗血清无血清学关系。     

大豆花叶病毒株系的鉴定

从1981年10月至1982年5月,在美国伊利诺斯大学植病系温室中接种并鉴定了中国大豆花叶病毒的标样23个。根据它们在9个抗性不同的鉴别品种上的反应差异,分为10个株系群,即在原来 G_1—G_7的7群基础上增设3个群,它们是 G_8、G_9和G_10,分别以 C_(16),S_6和 C_(28)3个标样为代表。这3群6个毒株的毒力要比美国7群的都强些,一些在美国认为是高抗或免疫的品种,在感染中国毒株后表现为黄色斑或叶脉坏死的症状。用十二烷基磺酸钠(S.D.S)配制的琼脂凝胶平板进行奥氏双扩散血清学检验,大豆花叶病毒与相应的抗血清发生沉淀反应,乳白色沉淀带清晰可见。     

北疆地区辣椒上两个TMV分离物的鉴定

依据在鉴别寄主上的反应,从北疆辣椒上分离得到的90—15和90—24两个TMV类型病毒,经测定,前者致死温度为85℃,侵染普通烟表现系统坏死,苋色藜表现系统花叶,与TMV普通株系抗血清部分融合,外壳蛋白分子量为17 782Dalton,由161个氨基酸组成,没有组氨酸,但有一个蛋氨酸,后者致死温度为90℃,侵染普通烟表现系统花叶,苋色藜表现局部枯斑,与TMV普通株系抗血清完全融合,外壳蛋白分子量为16 982Dalton,由157个氨基酸组成(不包括色氨酸),含组氨酸和蛋氨酸各一个。两者在苋色藜上有交互保护作用。     

侵染西瓜的西瓜花叶病毒生物学鉴定

用生物学、血清学及电镜等技术鉴定了侵染西瓜花叶病毒宿州分离物的基本属性。研究结果证明 ,该分离物侵染西瓜、南瓜等葫芦科植物并表现花叶 ;在苋色藜、千日红表现局部褪绿斑 ;桃蚜可传毒 ,该分离物汁液的致死温度为 5 5～ 5 8℃ ,稀释限点为10 - 3～ 10 - 4,体外保毒期为 6～ 10d。病毒粒体为线状 ( 73 0nm× 16nm)。该分离物的提纯物紫外光最高吸收峰在 2 60nm处 ,最小在2 40nm处。A2 6 0 /A2 80 =1.3 2。其病毒的RNA含量约为 8%。ELISA测定该分离物与西瓜花叶病毒 2号 (WMV -2 )的抗血清学反应为阳性。初步确定该分离物隶属WMV -2的一个株系。     

广西西瓜花叶病病原病毒鉴定

从广西各西瓜主产区采集到表现花叶症状的样品124份,经ELISA测定,所采样品均与西瓜花叶病毒二号(WMV-2)抗血清呈阳性反应,与黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草花叶病毒(TMV)抗血清呈阴性反应.取典型样本摩擦接种西瓜、西葫芦、南瓜、黄瓜、毛节瓜、瓠瓜、罗汉果等葫芦科植物表现花叶症状;接种苋色藜产生局部坏死斑;接种番木瓜、普通烟、心叶烟、番茄、辣椒、豇豆等无任何症状反应.该病毒还可通过棉蚜和嫁接传染.病毒初提纯液经电子显微镜观察,发现许多大小为12nm×(600～800)nm的线状病毒.ELISA测定结果显示,该病毒与莴苣花叶病毒(LMV)、大豆花叶病毒(SMV)抗血清呈阳性反应,它们之间有密切的血清学关系.据此,广西西瓜花叶病的病原病毒应为西瓜花叶病毒二号(WMV-2).     

TRV介导的大豆基因瞬时沉默体系的建立

【目的】病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技术已在植物基因功能研究领域得到广泛应用。建立以TRV为载体介导的大豆基因瞬时沉默体系,为将烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）介导的基因沉默技术在大豆与大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）互作体系中对大豆基因功能进行研究提供基础。【方法】从大豆品种冀豆7号（J7）叶片中特异性扩增八氢番茄红素脱氢酶基因（GmPDS）的部分片段,并将该基因片段插入质粒pTRV﹕RNA2中;向J7的第一位真叶注射携带有TRV或TRV﹕GmPDS的农杆菌,注射后对上部未接种病毒的叶片进行表型观察,并通过半定量RT-PCR检测GmPDS的表达量。为探讨接种TRV是否影响大豆对SMV的抗性表现,在大豆第一片真叶上预接种TRV病毒后10 d,再分别接种SMV株系N3和SC-8,以单独接种N3或SC-8作为对照。待接种SMV后第5天观察未接种的上位叶表型并检测SMV的外壳蛋白基因CP。【结果】大豆叶片注射携带有TRV﹕GmPDS的农杆菌后25 d,上部未接种病毒的叶片出现了白化现象,通过半定量RT-PCR分析,发生白化的植株中GmPDS的表达量明显降低。在此基础上,向大豆叶片预注射携带有TRV的农杆菌后再接种SMV,SMV株系N3和SC-8与J7分别组成不亲和与亲和组合。 发现J7第一片真叶上预接种TRV后再接种SMV株系N3,与单独接种N3对上位叶的影响在表型上表现一致,对未接种的上位叶片进行病毒外壳蛋白基因CP检测,发现J7单独接种N3以及预接种TRV后再接种N3的上位叶片上均未能检测到CP表达。而J7单独接种SMV株系SC-8,以及预接种TRV后再接种SC-8均在上位叶上能够检测到CP。说明在J7上预接种TRV不影响J7对SMV的抗性。在感病品种南农1138-2上也获得了相似结果。【结论】建立了以TRV为载体介导的大豆基因瞬时沉默体系,并证明在大豆上先接种TRV不改变大豆对SMV的抗性表现。     

进境大豆种子上菜豆荚斑驳病毒和大豆花叶病毒的多重RT-PCR检测

【目的】针对进境大豆种子上症状相似的菜豆荚斑驳病毒（Bean pod mottle virus,BPMV）和大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）,建立同时快速检测2种病毒的多重RT-PCR技术。【方法】根据GenBank公布的BPMV、SMV外壳蛋白基因序列,设计2对特异性引物,以复合感染BPMV、SMV的大豆种子为材料,提取dsRNA作为模板进行多重RT-PCR的引物浓度、退火温度和循环数的优化。利用优化建立的多重RT-PCR方法分别对健康大豆种子、BPMV、SMV及2种病毒复合感染的大豆种子进行检测,测定该方法的特异性。利用健康大豆种子提取的dsRNA,将从复合侵染BPMV、SMV大豆种子中提取的dsRNA按10倍梯度稀释,依次稀释为原液的10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6倍作为模板,分别进行多重RT-PCR和单一RT-PCR扩增,测定灵敏度。多重RT-PCR扩增产物回收纯化后,连接于pMD18-T载体,进行克隆测序和序列比对,进一步验证该方法的可靠性。应用建立的多重RT-PCR方法对来自于美国、阿根廷、中国和巴西的疑似带病大豆种子进行检测,同时以单一RT-PCR检测进行验证。以BPMV、SMV抗体等体积混合液包被PCR管后再加入样品提取液或直接以样品提取液包被PCR管,将免疫捕获、试管捕捉和多重RT-PCR相结合,建立同时检测BPMV、SMV的多重一步IC-RT-PCR、多重一步TC-RT-PCR方法。【结果】多重RT-PCR的优化结果显示,最佳引物浓度为BPMV 0.4μmol·L^-1、SMV 0.4 μmol·L^-1,最佳退火温度为52℃,最佳循环数为35。特异性测定结果表明,多重RT-PCR能够从复合感染BPMV、SMV的大豆种子上同时扩增到大小约542、221 bp特异性目的条带,从单一感染BPMV的大豆种子上扩增到大小约542 bp特异性目的条带,从单一感染SMV的大豆种子上扩增到大小约221 bp特异性目的条带,而从健康大豆种子材料上未扩增出任何特异性条带。灵敏度测定结果表明,当dsRNA原液稀释至10^-3倍时,无论是多重RT-PCR,还是单一RT-PCR均未扩增出特异性目的条带,多重RT-PCR与单一RT-PCR的灵敏度相当,为10^-2倍dsRNA原液。多重RT-PCR扩增产物克隆测序和序列比对结果显示,BPMV、SMV所测的序列全长分别为542和221 bp,与预期大小完全相符,且与已报道的各病毒基因序列高度同源,证实了多重RT-PCR结果的可靠性。应用建立的多重RT-PCR方法分别对来自于4个国家的大豆种子样品进行检测,结果从3份美国大豆种子样品检出BPMV,1份美国大豆种子检出SMV,1份阿根廷大豆种子检出SMV,2份中国大豆种子检出SMV,该结果与单一RT-PCR验证结果一致,阳性符合率达100% 。建立的多重一步IC-RT-PCR、多重一步TC-RT-PCR方法能够从复合感染BPMV、SMV的大豆种子中成功扩增出2条特异性目的条带,而从健康大豆种子中未扩增出特异性目的条带。【结论】建立的多重RT-PCR检测方法为进境大豆种子上BPMV、SMV的快速检测提供了参考。     

感染SMV后大豆种皮超氧物歧化酶过氧化物酶和多酚氧化酶的变化

大豆花叶病毒（ＳＭＶ）是世界性病害,使种粒产生斑驳。廖林~［１］、庄炳昌~［２］等研究了感染ＳＭＶ后大豆叶片ＰＯＤ、ＳＯＤ的变化。本文分析了抗、感斑驳大豆品种感染ＳＭＶ后种皮ＰＯＤ、ＰＰＯ、ＳＯＤ的变化及其与种粒抗性的关系。１材料与方法１．１供试材料感斑驳大豆品种：合丰２５、丰收１２,抗斑驳大豆品种：东农８１－４３、铁６９１５。１．２毒源与接种方法ＳＭＶ－９２－１７为１号株系（弱毒株系,当地优势株系）,ＳＭＶ－８７－４４为３号株系（强毒株系）。将供试大豆品种脱毒种子在隔离网室内进行盆栽试验,在对生…     

大豆花叶病毒抗血清制备和应用方法研究

用差速离心法提纯6个大豆花叶病毒株,提纯液用紫外分光光度计扫描,以260mm的OD值计算病毒汁液浓度.影响提纯病毒浓度的因素有:(1)不同毒株同一提纯方法得率差异很大;(2)采病叶的时间:症状最明显时采叶提纯得率最高;(3)PEG处理时间以3.5小时较好. 将提纯病毒免疫兔子(以6号兔为例),共注射8.34mg,心脏采血,取得抗血清,通过微量凝聚、微量沉淀反应及琼脂扩散试验,在方法上进行了研究.     

冀中南主要西瓜病毒病症状类型与病毒种类

对冀中南西瓜主产区西瓜病毒病进行了调查和毒原检测,发现西瓜病毒病普遍发生,复合侵染现象普遍,症状类型复杂繁多。发病程度与气候、地理位置和田间管理有关。用血清学SPA-ELISA方法检测主要西瓜病毒病毒原种类为WMV-2,ZYMV,PRSV,SgMV。     

蚕豆萎蔫病毒两个分离物的比较研究

作者对蚕豆萎蔫病毒的两个分离物Ｂ９３５和Ｐ１５８的部分特征作了比较研究；从病毒粒子形态、血清学关系、病毒衣壳蛋白组分和分子量以及病毒核酸组分和分子量这些特征看，Ｂ９３５和Ｐ１５８基本相似。 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ结果表明，Ｂ９３５和Ｐ１５８基因组具有同源性，但其同源性不高，这意味着蚕豆萎蔫病毒种内基因组上可能存在着较大的差异。     

大豆花叶病毒对产量及产量性状的影响

采用相关分析的方法，研究ＳＭＶ不同株系对大豆植株产量及产量性状的影响。结果表明，感病植株株高、株英数、株粒数、株粒重、百粒重等性状均变劣，产量降低。ＳＭＶ不同株系间以及不同抗性品种间，单株产量及产量性状的变化存在明显的差异。     

大豆叶片及种子内大豆花叶病毒(SMV)的生物与免疫测定方法的比較

用生物测定(局部枯斑反应)、免疫吸附电镜(ISEM)、酶联免疫吸附试验(ELISA)三种方法对大豆叶片及种子内的SMV进行了定性定量测定。结果表明,三种方法均可用来检测叶片及种胚和子叶内的SMV,并可对其定量,结果高度吻合,相关系数达0.97以上。ELISA能测出稀释2430—7290倍病叶中的SMV,测提纯病毒的下限为70ng—20ng/ml,生物测定可测出稀释640—1280倍病叶中的SMV。种皮内含有非侵染性SMV,不能用生物方法测出,而需用免疫方法检测。     

过表达酵母PAC1增强转基因大豆对大豆花叶病毒的抗性

【目的】大豆花叶病毒（soybean mosaic virus,SMV)病是中国大豆产区最主要的病害之一,严重影响大豆产量和籽粒品质。核糖核酸酶PAC1能够识别和降解植物RNA病毒或类病毒复制过程中产生的dsRNAs,从而有效抑制病毒在寄主中的复制与积累。PAC1的这一特点为广谱抗RNA病毒及类病毒转基因作物的创制和培育提供了有效的靶标基因。本研究利用转基因技术,将来源于粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)的PAC1导入栽培大豆,研究过表达PAC1对大豆SMV抗性的影响,为抗SMV转基因大豆新品种选育提供依据。【方法】采用酶切连接技术,将PAC1连接到双元表达载体pCAMBIA3300中,构建植物表达载体pCAMBIA3300-PAC1。目的基因启动子为组成型强启动子CaMV 35S,终止子为NOS,筛选标记为草铵膦抗性基因BAR。采用农杆菌介导转化法,将PAC1导入栽培大豆品种Williams82。在利用PAT/BAR试纸、PCR及除草剂（500 mg·L^-1 Basta）喷施检测基础上,通过Southern杂交技术进一步分析外源基因在转基因大豆中的整合情况和拷贝数。采用人工摩擦接种法,对T₂和T₃代转基因大豆株系进行田间抗SMV鉴定农艺性状调查,分析转基因大豆对SMV抗性及遗传稳定性。并利用qRT-PCR技术分析接种SMV 28 d后转基因大豆中SMV积累水平。【结果】共转化2 600多个外植体,获得耐草铵膦（5 mg·L^-1）大豆再生植株76株。PCR检测结果表明,其中65株能够扩增出目的条带,大豆遗传转化效率为2.48%。对T₁-T₃代转基因大豆株系喷施除草剂表明,在500 mg·L^-1 Basta处理7 d后,转基因植株表型没有明显变化,而对照（非转基因大豆）植株叶片则黄化枯死。Southern杂交结果表明,外源基因以低拷贝的方式(1-2个)整合至大豆基因组中。摩擦接种SMV SC-3鉴定表明,在接种35 d后,对照出现严重花叶、皱缩等典型SMV发病症状,而转基因大豆仅部分叶片表现出轻微的花叶症状,其病情指数降低至11.11-22.22,较对照（病情指数36.81-46.24）显著降低,且SMV抗性在转基因大豆不同代际间能够稳定遗传。qRT-PCR分析表明,在接种SMV SC-3株系28 d后,转基因大豆中SMV CP表达水平较对照极显著下降。农艺性状调查表明,在未接种SMV条件下,转基因大豆在叶形、花色、种皮色、种脐色、株高、节数、结荚高度、生育期及百粒重等方面与对照没有显著差异。【结论】PAC1过表达显著抑制了SMV的积累及症状发展,增强了转基因大豆对SMV的抗性水平。