小鹅瘟病毒荧光PCR检测方法的建立

依据GenBank小鹅瘟病毒(GPV)的NS基因保守区设计一对特异性引物,利用PCR扩增NS区片段,克隆、测序,采取Taqman探针法,构建小鹅瘟病毒的荧光PCR检测方法.结果表明,该方法检测GPV具有很高的特异性和敏感性,可以用于小鹅瘟病毒的检测.     

小鹅瘟病毒荧光RPA恒温快速检测方法的建立与应用

旨在建立一种以重组酶聚合酶扩增技术（RPA）为基础的快速检测方法,用于小鹅瘟病毒的快速检测。小鹅瘟是一种常见的水禽传染病,严重危害我国养鹅业的健康发展。为了快速准确对小鹅瘟进行诊断,减少该病的危害,本研究以小鹅瘟病毒VP3基因保守片段为靶点,利用重组酶聚合酶扩增技术（RPA）建立了一种准确高效的小鹅瘟病毒RPA恒温快速检测方法,并对检测方法的灵敏度、特异性进行评价,并与传统PCR和传统RT-PCR方法进行比较。结果表明,该检测方法具有较高的灵敏度,可检测到10 copies/μL的病毒核酸;具有良好的特异性,只特异性地扩增鹅细小病毒,而与鹅副黏病毒、鹅源鸭瘟病毒、小鹅流行性感冒病毒、鹅副伤寒病毒、大肠杆菌和曲霉菌均未发生交叉反应;同时该方法重复性检测的变异系数低于6%,具有很好的重复性。阳性符合试验表明该检测方法与荧光定量PCR符合率为99%。该方法可以很好地应用于小鹅瘟的大规模临床样本检测,为小鹅瘟病毒的高通量检测和流行病学调查提供技术手段。     

鹅细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

利用已经分离得到的小鹅瘟病毒GPVSP株,设计合成1对特异性的引物和TaqMan探针,通过特异性试验、敏感性试验建立了GPVTaqMan荧光定量PCR检测方法。同时饲养产蛋种鹅,接种小鹅瘟病毒,在不同的时间段采取病料,并且利用荧光定量PCR检测病毒的存在与含量,得到了小鹅瘟病毒在产蛋种鹅体内的定植规律。     

鹅细小病毒、番鸭细小病毒及鸭圆环病毒多重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与临床应用

为建立鉴别检测鹅细小病毒(GPV)、番鸭细小病毒(MDPV)及鸭圆环病毒(DuCV)的方法，本研究分别针对GPV、MDPV NS基因与Du CV Rep基因，设计特异性引物和Taq Man探针，经优化反应条件，建立了同一体系中同时鉴别检测GPV、MDPV及Du CV的Taq Man荧光定量PCR方法。利用该方法检测GPV、MDPV、Du CV及禽流感病毒、新城疫病毒、鸭瘟病毒、减蛋综合征病毒、鸭坦布苏病毒、番鸭呼肠孤病毒等主要水禽源病毒，结果显示，该方法仅能扩增出GPV、MDPV及Du CV，与其他主要水禽源病毒均无交叉反应，特异性强；利用该方法检测等体积混合后的GPV、MDPV及Du CV质粒标准品混合物，结果显示，该方法对3种质粒标准品的检测限均为7.5×10¹拷贝/μL，普通单一PCR对上述3种质粒标准品混合物的检测限均为7.5×10³拷贝/μL，表明本研究建立方法的敏感性高于普通PCR；该方法组内与组间重复性试验的变异系数均小于2.0%，重复性好。利用该方法与MDPV和GPV双重荧光定量PCR方法及Du CV荧光定量PCR方法同时检测...     

鹅细小病毒和番鸭细小病毒双重PCR检测方法的建立

根据GenBank上登录的鹅细小病毒(GPV)和番鸭细小病毒(MDPV)基因序列,分别设计合成针对GPV非结构蛋白(NS)和MDPV NS2-VP1基因片段的2对引物GPV U/L和MDPV U/L,将GPV和MDPV提取核酸混合后作为模板,优化PCR反应条件,建立了能同时检测这2种病毒的双重PCR。特异性试验结果显示,引物GPV U/L仅特异性扩增出GPV-GZ1和GPV-GZ2株730bp核酸片段,引物MDPVU/L仅特异性扩增出MDPV的624bp核酸片段,双重PCR扩增出长度分别为730bp和624bp的2条特异性片段,而扩增鸭瘟病毒(DPV)和鹅副黏病毒(GPMV)的核酸扩增结果均为阴性。敏感性试验结果显示,双重PCR能同时检测到14.4pg的GPV核酸和28.8pg的MDPV核酸。结果表明,建立的双重PCR可用于GPV和MDPV的鉴别诊断和联合检测。     

小鹅瘟病毒PCR诊断方法的建立及初步应用

为了建立小鹅瘟病毒PCR诊断方法,试验根据GenBank发表的小鹅瘟病毒B株基因序列设计1对VP3基因的特异性引物进行PCR扩增。结果表明:该法能特异性地扩增出406 bp的小鹅瘟病毒VP3基因片段,而对其他病毒基因组DNA均没有扩增出条带;病料中小鹅瘟病毒基因组DNA的最小检测量为2.175 fg/μL;用该法对延边地区疑似小鹅瘟的44只病死雏鹅进行了检测,阳性检出率为91%。     

小鹅瘟套式PCR诊断方法的建立及初步应用

本试验根据GenBank发表的小鹅瘟病毒B株基因序列,设计了两对VP3基因的特异性引物,进行PCR扩增,建立了小鹅瘟病毒套式PCR诊断方法,该方法能特异性地扩增出406 bp的小鹅瘟病毒VP3基因片段而对其他病毒基因组DNA均没有扩增出条带。本方法对病料中小鹅瘟病毒基因组DNA的最小检测量为0.02175 fg/μL。通过对延边地区疑似小鹅瘟的80只病死雏鹅进行了检测,阳性检出率为95%。结果表明,本试验建立的小鹅瘟病毒套式PCR诊断方法具有极高的敏感性和特异性且检出率极高,可作为一种有效的临床诊断方法。     

鹅细小病毒TaqMan荧光定量PCR方法的建立及临床应用

为了建立一种能定量检测鹅细小病毒(GPV)的荧光定量PCR方法,根据GenBank已收录GPV-VP3基因保守区设计1对特异引物和TaqMan探针,经反应条件优化、标准曲线建立,以及敏感性、特异性和重复性试验。结果显示,该方法在10~7~10~2拷贝/μL具有良好的线性关系(R2=0.999);灵敏度是普通PCR方法的100倍;对其他3种常见禽病毒无特异性扩增,具有较好的特异性;组内与组间的变异系数均小于2%,具有良好的重复性。对临床20份疑似GPV感染鹅病料进行检测,检出率比普通PCR高10%。表明本试验建立的TaqMan荧光定量PCR方法准确、稳定、灵敏和特异,可以用于GPV临床定性与定量检测。     

基于VP1基因的小鹅瘟病毒PCR快速检测方法的建立和应用

根据Gen Bank公布的小鹅瘟病毒VP1基因保守序列设计了一对引物,建立了检测小鹅瘟病毒PCR方法,并对其特异性、敏感性进行了研究。该PCR方法对小鹅瘟病毒扩增结果为阳性,对照毒株扩增结果均为阴性;对小鹅瘟病毒检测的灵敏性为1pg总DNA量。以上结果表明,该PCR方法特异性强、敏感性高、简便、快速,可用于小鹅瘟的早期确诊和病毒鉴定。     

小鹅瘟和雏鹅新型病毒性肠炎二联PCR检测方法的建立

根据鹅细小病毒(GPV)和雏鹅新型病毒性肠炎病毒(NGVEV)保守基因序列,分别设计合成了两对引物并且进行PCR检测,分别扩增出预期的375bp条带和223bp条带。然后,对混合样品进行二联PCR反应条件的优化试验。结果得到最佳退火温度54℃,并且清晰得到与试验设计相符的375bp(GPV)和223bp(NGVEV)两条特异性条带。特异性强,敏感性好。因此,此方法可以用来诊断小鹅瘟和雏鹅新型病毒性肠炎。     

二重PCR检测鸭瘟病毒和鹅细小病毒的初步研究

根据鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)DNA聚合酶基因和鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)NS基因序列分别设计2对引物,应用这2对引物对混合样品中鸭瘟病毒和鹅细小病毒进行了二重PCR扩增。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果表明2条特异性带为563bp(DPV)和1146bp(GPV),与实验设计相符,且与常规单一PCR结果一致。二重PCR反应检测出的DPV含量相当于20个PFU;检测出的GPV含量相当于0.1个ELD50,对禽痘病毒和减蛋综合征病毒的核酸未能扩增出任何条带,特异性良好。该二重PCR能够在一次扩增反应中检测两种病毒,为两种鹅病的病原检测和诊断提供了一种简便、经济、快速的手段。     

小鹅瘟和雏鹅新型病毒性肠炎二联PCR检测试剂盒组装和初步应用

本试验旨在研制小鹅瘟和雏鹅新型病毒性肠炎二联PCR检测试剂盒,观察临床应用效果。根据小鹅瘟和鹅病毒性肠炎基因序列,设计合成一对特异性引物,对PCR反应条件进行优化,并分别对试剂盒的特异性、敏感性、重复性和保存期进行研究,之后进行临床扩大试验。该二联PCR诊断试剂盒能扩增出预期的小鹅瘟375 bp核酸片段和鹅病毒性肠炎223 bp核酸片段,与鸭瘟病毒、鹅副黏病毒无交叉反应;最低能检测到小鹅瘟病毒10⁴ ELD₅₀/mL,雏鹅新型病毒性肠炎病毒2.5×10^-1ELD₅₀;不同批次的试剂盒对同一样品检测结果一致;常温下至少可保存5个月;临床应用效果显著。该二联PCR检测试剂盒能够对小鹅瘟和雏鹅病毒性肠炎早期诊断、流行病学调查和卫生检疫提供了检测手段。     

鸭瘟病毒SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鸭瘟病毒（DPV）快速、敏感的检测方法,本研究利用PCR技术扩增出DPV UL30基因中510bp的保守序列,并克隆到p MD18-T载体中作为标准品制作标准曲线,建立了DPV的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达5×101拷贝,与鸭细小病毒、鸭圆环病毒、小鹅瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭H9亚型流感病毒和鸭副粘病毒均不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性。结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床DPV的检测。     

稳定表达小鹅瘟病毒VP3基因的293T细胞系构建

为构建稳定表达鹅细小病毒(goose parvovirus, GPV)VP3基因的293T细胞系,利用PCR技术扩增GPV的VP3基因,构建真核表达质粒pcDNA3.1-GPV-VP3,再将其转染至293T细胞,并利用博来霉素(zeocine)进行药物压力筛选。结果表明,获得的293T细胞系能够高效表达VP3蛋白,这为小鹅瘟病毒VP3蛋白的生物学功能的深入研究以及鹅细小病毒抗体检测方法的建立提供良好的生物材料。     

火鸡疱疹病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

本研究针对火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey,HVT)FC-126毒株sorf1基因序列,设计特异性的扩增引物和探针,建立了检测HVT的TaqMan荧光定量PCR方法,并对其特异性、敏感性和重复性进行检测。结果表明,建立的荧光定量PCR方法灵敏度高,最低可检测到1×10~2 copies/μL,比普通PCR灵敏10倍;对鸭瘟病毒、传染性喉气管炎病毒、鹅细小病毒、4型禽腺病毒和8型禽腺病毒均无特异性扩增,具有较好的特异性;组间和组内变异系数均小于1%,表明该方法重复性好。用建立的荧光定量PCR方法对82份HVT样品进行检测,结果43份为阳性,普通PCR只检测出30份阳性样品。结果表明本研究建立的HVT TaqMan荧光定量PCR检测方法特异性好,灵敏度高,重要性好,为监测HVT的病毒含量提供了一种有效的手段。     

鸭瘟病毒、鹅细小病毒和番鸭细小病毒三重PCR检测方法的建立

为建立鉴别鸭瘟病毒(DPV)、鹅细小病毒(GPV)和番鸭细小病毒(MDPV)的多重PCR检测方法,参考文献合成针对DPVUL6基因、GPVNS基因和MDPVVP1基因序列的特异性引物。通过优化多重PCR反应中的引物浓度和退火温度,建立快速鉴别3种病毒的多重PCR方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行检验。结果显示,该方法对禽流感病毒、新城疫病毒、鸭肝炎病毒、鸭源巴氏杆菌、鸭疫里氏杆菌的核酸扩增结果均为阴性,表明特异性较强;DPV、GPV和MDPV的最低核酸检出量分别为237.3pg、22.45pg和204.6pg,表明敏感性良好;该方法对DPV+GPV+MDPV、DPV+GPV、DPV+MDPV、GPV+MDPV、DPV、GPV和MDPV的核酸均能扩增出与预期大小一致的目的条带,表明该多重PCR方法重复性较好。本研究方法具有特异性强、敏感性良好、重复性较好和快速简便等特点,可用于DPV、GPV和MDPV临床感染病例的联合检测与鉴别诊断。     

鹅细小病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为探讨鹅细小病毒(Goose parvovirus, GPV)在鹅胚上皮细胞(goose embryo epithelial cells, GEEC)中的增殖规律，研究采用荧光染料SYBR GreenⅠ渗入法，建立了检测GPV的荧光定量PCR方法，并用该方法分析了GPV在GEEC中的生长情况，绘制了生长曲线。结果显示，鹅细小病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法建立的标准曲线具有良好的重复性和特异性，与模板浓度呈现良好的线性关系。在线性浓度范围内，随着模板量的减少，其对应的Ct值相应增大，得到的标准曲线方程为y=-3.341 2x+38.494,相关系数R²为0.998。特异性试验结果显示检测新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)、鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus, DHAV)、禽腺病毒(Avian adenovirus, FAdV)均为阴性。敏感性试验结果显示最低检测限为100拷贝/反应，而普通PCR的最低检测限为1 000拷贝/反应，熔解曲线为单一特征峰型，熔解温度为80℃±0.5℃。病毒生...     

应用胶乳凝集技术诊断番鸭小鹅瘟病

为建立番鸭源小鹅瘟病毒(GPV)快速检测方法,本研究采用GPV单克隆抗体(MAb)标记聚苯乙烯胶乳,建立了检测GPV抗原的胶乳凝集试验(LPA)。结果显示:LPA具有较好的敏感性,可以检出GPV最低毒价为1 000 TCI50/10μL;特异性强,仅与GPV产生特异性凝集反应,与其他相关鸭源病毒均无交叉反应;重复性和稳定性好,在4℃保存期达11个月;对人工感染病例的LPA检测结果与PCR符合率为93.3%;对临床18份疑似GPV病例进行检测,LPA和PCR符合率为94.5%。表明LPA具有简便、快速、特异、准确等优点,适用于基层快速诊断番鸭小鹅瘟病。     

常武地区小鹅瘟病毒的分离与鉴定

从本地区动物门诊采集10份疑似小鹅瘟(GP)病例的小肠、肝脏、脾脏等病料,无菌处理后接种无GPV抗体的易感鹅胚。有4株病毒能致死鹅胚,分别命名为GPV/2010/01、GPV/2012/01、GPV/2012/02、GPV/2012/03,死亡鹅胚绒毛膜增厚,胚体充血、出血。经血凝试验(HA)、聚合酶链式反应(PCR)、琼脂扩散试验(AGP)及抗小鹅瘟病毒(GPV)特异性单克隆抗体建立的夹心ELISA方法鉴定,确定分离的病毒为GPV。对GPV/2010/01株的病毒粒子进行透射电镜观察,可见球形的、直径约为20nm的病毒粒子。     

免疫雏鹅发生小鹅瘟的原因分析

2018年6月,安徽某鹅场接种过小鹅瘟蛋黄抗体的2批雏鹅发生小鹅瘟,再次用小鹅瘟蛋黄抗体产品进行紧急接种,有一定的控制效果,但仍有雏鹅死亡。为分析其原因,采集了8只9-12日龄病死鹅的肝脏和脾脏,用PCR扩增检测水禽细小病毒的VP3基因,选8份阳性样品测定了鹅细小病毒(GPV)VP1部分序列并进行了序列分析。结果显示,16份组织样品均为阳性。在443 nt VP1区,所测8株病毒之间的序列同源性为100%,与GPV亚洲强毒分支之间的序列同源性为99%。随后,用琼脂扩散沉淀试验分析了2株待检毒株与GPV参考毒株的抗原相关性,并测定了2种小鹅瘟蛋黄抗体产品的效价。结果显示,待检毒株与参考毒株具有相同的沉淀抗原,2种小鹅瘟蛋黄抗体产品的效价分别为1∶2和1∶16。表明免疫雏鹅仍发生小鹅瘟的原因并非源自GPV变异,而是与某些蛋黄抗体产品的抗体效价较低有关。