虾肝肠胞虫的检测与控制技术研究进展

虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei),又名肠道上皮细胞孢子虫,于 2003 年被 Chay-aburakul等[1]首次发现,2009 年由 Tourtip 等[2]从生长缓慢的斑节对虾(Penaeus monodon)中分离并命名,主要感染斑节对虾、凡纳滨对虾(Litopenaeu...     

虾类肝肠胞虫流行病学研究进展

虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)作为虾类养殖过程中的重要病原之一,会导致虾类生长缓慢甚至停滞,极大的影响了养殖业的经济效益。该文就虾肝肠胞虫的流行情况、致病机理、传播途径、检测方法及防治措施等方面进行了综述,以期为虾类肝肠胞虫的研究和防治提供参考。     

虾肝肠胞虫全基因组分泌蛋白的预测分析

分泌蛋白是在细胞内合成后分泌到细胞外起作用的蛋白质,其在许多原生动物寄生虫操纵宿主细胞和影响虫体的毒力中起着重要作用。虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)是一种可感染多种经济虾类的专性细胞内寄生虫,是近年来影响全球对虾养殖生产较严重的病害之一。本研究利用真核生物分泌蛋白预测流程EuSecPred2.0对EHP全基因组的分泌蛋白进行预测,并对分泌蛋白长度、信号肽长度、切割位点处氨基酸分布等信息进行分析,对分泌蛋白功能进行分析。结果显示,分泌蛋白氨基酸长度主要集中在30~400 aa之间;信号肽长度集中在9~32 aa之间;信号肽切割位点处以疏水性氨基酸为主。对信号肽进行基序分析,发现存在基序NV[VT][IK]CA[ED][SA]。对所获蛋白质进行功能注释,发现了多种与微孢子虫黏附侵染、调节细胞周期和免疫反应等相关的关键蛋白。研究结果有助于了解EHP对宿主的侵染机制,同时为进一步明确EHP的致病相关因子提供理论依据。     

警惕卤虫可携带虾肝肠孢虫

<正>虾肝肠孢虫又称肠孢虫,属于微孢子虫科,肠孢虫属,是一种可感染多种真核生物的专性细胞内寄生虫。该病原最早于2004年作为一种未知微孢子虫在泰国生长缓慢的斑节对虾肝胰腺小管上皮细胞内被发现,在2009年获得分类和命名,主要危害对虾类,目前普遍认为虾肝肠孢虫与养殖对虾的生长迟缓相关,近年来各地都有虾肝肠孢虫检出的报道,且呈上升趋势,该寄生虫正严重威胁着整个对虾养殖产业的发展。     

虾肝肠胞虫(EHP)孢子的纯化和计数

采用差速离心和密度梯度离心,从感染虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)对虾的肝胰腺中,尝试纯化出孢子,并应用透射电镜、荧光桃红染色和血球计数板计数的方法对纯化出的孢子进行了观察和计数。结果表明,从1g的EHP载量为(4.7±2.2)×104 copies/ng DNA的肝胰腺组织中经差速离心和密度梯度离心方法分离到EHP的孢子,电镜观察孢子为大小在0.7～1.2μm的椭圆形,纯化孢子悬液用血球计数板计数显示孢子浓度为5.30×103个/μL,蔗糖密度梯度中的纯化孢子区带含有的孢子总数约1.06×106个。     

3种虾肝肠胞虫PCR检测方法的应用比较分析

虾肝肠胞虫被认为是凡纳滨对虾"长不大"现象的主要病原之一,国内外学者已建立其PCR检测技术,包括18S-PCR、SSU-PCR及SWP-PCR。采集36个凡纳滨对虾苗种样本、5个卤虫样本和12个水样,应用上述3种PCR方法进行检测,并对阳性产物进行克隆测序和序列同源性分析,以比较检测灵敏度和准确性。试验结果显示,18S-PCR在第一步扩增的灵敏度最好,SSU-PCR在第二步扩增的灵敏度显著高于SWP-PCR,但存在着一定的假阳性现象。建议在对凡纳滨对虾苗种进行虾肝肠胞虫的检测时,宜采用灵敏度更高的套式SSU-PCR方法。     

虾肝肠胞虫感染对脊尾白虾肠道菌群的影响

为探究虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)感染对脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)肠道菌群的影响,本研究基于16S rRNA基因的测序结果,对感染EHP的脊尾白虾肠道菌群进行了分析。结果显示,感染虾与健康虾肠道菌群差异较大,且其肠道菌群结构多样性显著低于健康虾。研究发现,病虾中归属于变形菌门(Proteobacteria)的脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、弧菌科(Vibrionaceae)、未分类蓝细菌科(unidentified Cyanobacteria)、支原体科(Mycoplasmataceae)和未分类α变形菌科(unidentified Alphaproteobacteria)为优势菌,而归属于厚壁菌门(Firmicutes)的乳杆菌科(Lactobacillaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)及噬几丁质杆菌科(Chitinophagaceae)细菌在健康虾中占据优势地位。EHP侵蚀导致感染虾肠道内潜在致病菌显著增加(P<0.05),增加了其他疾病的易感性。此外,通过Tax4Fun功能预测,发现感染虾肠道菌群主要用于新陈代谢,从而抵抗EHP侵染,维持机体正常功能;健康虾肠道菌群则多用于个体生长与环境信息处理,进而保证生长与存活。本研究从虾肠道菌群结构方面入手,进一步探究了EHP感染对脊尾白虾肠道菌群的影响,以期为EHP的防治提供帮助。     

虾肝肠胞虫实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

近年来,虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)流行区域不断扩大,已经成为我国南美白对虾(Litopenaeus vannamei)养殖重要病原之一。本研究根据Gen Bank中虾肝肠胞虫18S r RNA保守区域设计一套特异性引物和荧光探针,通过优化反应条件,建立检测EHP的TaqMan探针实时荧光定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测方法。建立的方法呈良好的线性关系(R²=0.998),灵敏度是巢式PCR的10倍。特异性试验表明：检测其他常见病原均为阴性,特异性好;重复性试验显示：批内批间变异系数均小于1.5%,重复性良好;对临床样品检测,与巢式PCR的符合率为97.81%。使用该方法对中山市、江门市和珠海市珠三角部分地区南美白对虾开展EHP流行病学调查,其中虾苗检出率为10.75%,成虾检出率为54.07%,部分区域检出率较高,要防范爆发风险。本研究建立的实时荧光定量PCR灵敏度高、特异性和重复性良好,具有较好的应用前景。     

滨州地区凡纳滨对虾苗种虾肝肠胞虫病的调查和分析

为全面、系统地了解滨州市地区凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)苗种携带虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)及爆发情况,对滨州地区37家凡纳滨对虾养殖池塘随机采集对虾苗种样本,根据SC/T 7232-2020 《虾肝肠胞虫病诊断规程》采用套式PCR法进行对虾苗种虾肝肠胞虫的检测,检测结果表明滨州地区虾肝肠胞虫阳性检测率为4.84%,同时监测虾肝肠胞虫病发病池和未发病池的水质,发现发病池的水体中pH值、COD等指标并没有显著差异,说明虾肝肠胞虫病爆发并不是由于养殖池水质导致的。     

一例投喂微胶囊饲料后检出虾肝肠胞虫阳性病例

<正>虾肝肠胞虫(EHP)又称"肠胞虫",大小为0.7～1.1微米,属于微孢子虫科、肠胞虫属,是一种可感染多种真核生物的专性细胞内寄生虫。作为养殖对虾的重要病原,近年来各地都有检出的报道,且呈上升趋势,该寄生虫正严重威胁着整个对虾养殖产业的发展。目前业内普遍认为虾肝肠胞虫不引发对虾死亡,但会导致生长迟缓甚至停滞,空耗饲料,由此带来的损失比虾死亡还     

凡纳滨对虾感染虾肝肠胞虫的群体及组织间差异性分析

对来自河北黄骅(HH)、山东平度(PD)、江苏吴江(WJ)和山东日照(RZ)的4个凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)群体进行了对虾生长参数测量,用Taq Man q PCR检测了凡纳滨对虾各群体的肝胰腺组织中和RZ群体多种组织中的虾肝肠胞虫数量(Amount of Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)。结果显示,在主要生长相关参数中,RZ群体最优,该群体EHP载量也最低。不同群体的样本数EHP对数直方图的模式存在差异,HH和PD群体的EHP对数呈双峰分布,而WJ和RZ群体的EHP对数呈单峰分布,代表EHP在不同群体中可能存在不同的传播模式。EHP对数呈单峰分布的群体或从多峰分布的群体中分离出的高EHP对数子群体的对虾体长或体重与EHP对数呈显著的负相关。RZ群体中,各个体不同组织中EHP从高到低的顺序依次是肝胰腺中肠血淋巴鳃肌肉。肝胰腺、中肠和鳃3个组织中EHP对数相互间的相关性为99.9%的极显著水平(P0.001);除了中肠与血淋巴和肝胰腺与血淋巴以外,其余组织间EHP对数的相关性也达到极显著(P0.01)或显著(P0.05)水平。用DIG标记的EHP探针对肝胰腺、肌肉、鳃、肠道组织的原位杂交显示,肝胰腺是主要的EHP感染组织,其他组织中杂交信号较弱,但各组织中有少数细胞的EHP易感。     

虾肝肠胞虫(EHP)现场快速高灵敏度检测试剂盒的性能评价研究

近年来,虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)流行使我国养殖对虾遭受严重经济损失,现场快速检测是EHP防控的重要技术保证。本研究对本实验室研发的EHP现场快速检测试剂盒的分析特异性(ASp)、分析灵敏度(ASe)、诊断特异性(DSp)、诊断灵敏度(DSe)、重复性和稳定性6项性能参数开展了系统评估。ASp测试显示,该试剂盒与对虾白斑综合征病毒(WSSV)、偷死野田村病毒(CMNV)、虾血细胞虹彩病毒(SHIV)、致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)等5种对虾常见病原及健康对虾无交叉反应;ASe测试显示,该试剂盒检测下限为101 copies/反应;以EHP TaqMan RT-qPCR方法为标准,比较了试剂盒对298份临床样品的测试结果,试剂盒的DSp为99.2%、DSe为91.7%;试剂盒对EHP阴性样品及强阳性样品的检测重复率为100%,弱阳性样品检测重复率为95.8%;试剂盒在–20℃和–40℃条件下分别可保存7个月和12个月以上。本研究表明,本实验室研制的EHP现场快速检测试剂盒具操作简便、快速、灵敏度高、特异性强、重复性好和稳定性强等优点,可满足对虾养殖现场对EHP的高灵敏度检测。     

8种染色方法对组织切片中虾肝肠胞虫染色效果的比较

病理检测是一种诊断病原及观察机体组织病理变化的重要方法,特殊染色是在病变组织中寻找病原体的前提手段,良好的染色有助于将病原体与组织区别,从而增加病原在组织切片中的检出率。为筛选出一种适用于虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)病理切片检测的最佳染色方法,使用苏木精-伊红(HE)染色法、Masson染色法、爱显蓝-雪夫(AB-PAS)染色法、甲苯胺蓝(TB)染色法、伟郝夫范吉森(EVG)染色法、劳克坚牢蓝(LFB)染色法、天狼猩红(Sirius red)染色和普鲁士蓝(PB)等8种染色方法对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)感染了虾肝肠胞虫的肝胰腺进行组织病理切片染色,并结合对EHP检出率的统计分析,比较了这些染色方法的优缺点。结果表明:HE染色法、AB-PAS染色法、TB染色法、EVG染色法、天狼猩红Sirius red染色法和PB染色法对孢子的染色效果较差,与背景颜色对比不明显,单个视野检出率较低; LFB染色法虽然使孢子易被识别,但是有孢子丢失现象,且组织染色效果差; Masson染色结果显示孢子呈现品红色,与组织颜色对比鲜明,孢子颗粒清晰可见,对组织细胞结构染色效果较好,且检出率也最高。综合分析染色效果及检出率,Masson染色法是一种非常适用于组织内的虾肝肠胞虫孢子染色的方法,本研究为微孢子虫病的组织病理研究提供一种有效的基础手段。     

凡纳滨对虾肝肠胞虫病的概述

正目前全球范围内凡纳滨对虾的繁殖量和养殖范围非常惊人,属于产量最高的经济虾之一。我国主要在天津、广东、浙江、福建等地比较多,而以天津最为出名。凡纳滨对虾的虾肉非常鲜美,营养丰富,壳薄,肉肥,是餐桌上的佳品,所以极大刺激了凡纳滨对虾的集约化养殖,但在养殖的过程中疾病是影响经济效益的罪魁祸首,所以在凡纳滨对虾的繁殖生长过程中如何预防各种疾病尤为重要。目前在养殖过程中凡纳滨对虾面临多种病的威胁,如黄头病、白斑综合征、滞     

南美白对虾肝肠胞虫的分离及形态学观察

为了研究江苏地区感染南美白对虾(Penaeus vannamei)的肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)的形态学特点,分析与国外报道的差异性,本研究以江苏地区感染肝肠胞虫的南美白对虾肝胰腺组织为研究材料,通过蔗糖密度梯度离心等方法进行肝肠胞虫初步分离纯化,构建一种肝肠胞虫荧光染色检测方法,显微观察肝肠胞虫的孢子形态结构。结果发现感染江苏地区南美白对虾的肝肠胞虫孢子主要分布在35%~40%浓度的蔗糖层面,可推算其密度为1.15~1.17 g/m L。荧光显微镜下可见孢子椭圆或圆形,呈亮蓝色,孢子微小但可计数,显微观察可见肝肠胞虫孢子大小约为1.7μm×0.9μm,外壁上有大量白色瘤状物,疑似胞壁蛋白,孢子表面布满细小褶皱,孢子具有一个细胞核,极丝4~6圈,细胞壁由一相对薄的电子透亮的孢子内壁和电子致密的孢子外壁组成。结论认为江苏地区南美白对虾肝肠胞虫的形态结构与国外报道的吻合,本研究建立的肝肠胞虫分离纯化、荧光染色方法以及取得的肝肠胞虫形态学资料可为其检测和研究提供参考。     

虾肝肠胞虫4个孢壁蛋白基因的鉴定、序列特征及表达分析

对上海某养殖场凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)开展了虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)检测,发现部分对虾存在EHP感染.随后对EHP感染阳性对虾肝胰腺组织进行转录组测序和数据分析,从中筛选到4个孢壁蛋白基因,分别命名为EhEnP1、EhSWP7、EhSWP...     

基于TaqMan qPCR检测凡纳滨对虾样品中虾肝肠胞虫并样检测方法的评价

对山东海阳和潍坊的2个养殖凡纳滨对虾群体取样,采用TaqMan qPCR逐尾检测肝胰腺中的虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)载量,再将提取的DNA样品按5并1(5∶1)、25并1(25∶1)、50并1(50∶1)、100并1(100∶1)和150并1(150∶1)进行并样,检测并样的EHP载量。设定不同临界循环数为假定灵敏度,定性判断各单尾检测阳性及并样组阳性,比较不同并样模式与检测阳性率、诊断灵敏度、诊断特异性等之间的关系以及定量的准确性。结果表明,检测灵敏度过低,会降低高并样率检测的准确性;阳性率在30%以上时,高并样率的检测结果与单样品检测相符性很好;高载量感染的阳性率不低于6.7%时,50∶1以内的并样能准确得出检测结果;低载量感染的阳性率不低于16%时,25∶1以内的并样能得出较好结果;高载量感染的1.3%阳性率和低载量感染的8%阳性率可能导致所有并样出现假阴性结果;各种并样模式均有很好的诊断特异性,50∶1并样的诊断灵敏度与OIE标准推荐的5∶1并样的接近;各并样检测的EHP载量与单样品检测平均值之比在0.27~2.83范围,二者存在极显著相关性,各种并样模式的定量检测结果在数量级水平能大致反映样品的平均EHP载量。本研究为水生动物疫病诊断和流行病学调查的样品检测提供了参考依据。     

2021—2022年我国沿海养殖虾类中虾肝肠胞虫(EHP)流行病学调查

2013年以来,我国沿海各省市养殖对虾中先后出现虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)感染且感染率居高不下,使我国虾类养殖产业遭受了严重经济损失。为查明2021—2022年沿海省市养殖虾类中EHP的流行情况,本研究在沿海地区开展了养殖虾类EHP流行情况调查,共采集样品936份,并采用TaqMan实时荧光定量PCR (TaqMan qPCR)和组织病理检测对样品进行分析。TaqMan qPCR检测结果表明,2021和2022年所采集的虾类样品中,EHP的阳性检出率分别为10.67% (54/506)和13.72% (59/430);2021和2022年主要在凡纳对虾(Penaeus vannamei)中检出EHP阳性,阳性检出率分别为14.10% (54/383)和16.71% (58/347),且检出EHP阳性的凡纳对虾主要来自山东、辽宁、广东、河北和天津等省市;1份脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)样品中检出EHP阳性,罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)、克氏原螯虾(Protocrayfish cruzi)、斑节对虾(P. monodon)、日本对虾(P. japonicus)和中国对虾(P. chinensis)等虾类样品中未检出EHP阳性。对TaqMan qPCR检测呈阳性的凡纳对虾进行组织病理检测,在其肝胰腺上皮细胞中观测到分散或成簇的EHP孢子以及处于生长阶段的EHP原质团。本研究表明,2021—2022年EHP仍在我国沿海地区养殖的凡纳对虾中流行,尽管其流行率较前几年呈下降趋势,但其对凡纳对虾养殖产业的危害仍不容忽视。