耐寒结球甘蓝小孢子培养及其发育过程

以6份耐寒结球甘蓝杂交F1为试验材料,研究其胚胎发生过程及胚胎发生的诱导条件,为耐寒甘蓝材料的小孢子培养,以及其他芸薹属小孢子胚胎体系的建立及优化提供理论依据。采用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色方法对小孢子体内和体外的发育及胚胎发生过程、特征进行观察;NLN-13培养基中添加阿拉伯半乳聚糖(Arabinogalactan,AG)和阿拉伯半乳糖蛋白(Arabinogalactan-protein,AGP)对小孢子培养胚胎发生率的影响进行统计分析;小孢子体内正常发育方向是单核小孢子经历2次不对称核分裂后发育成三核成熟花粉,小孢子单核晚期对应的花蕾长度主要集中在3.5~4.5mm;体外培养中,热激胁迫(32.5℃)诱导小孢子从配子体发育途径向胚胎发生途径转换,只有少数胚性细胞最终发育成为胚状体;供试材料中有5份材料获得胚状体,材料间出胚量差异较大,其中‘寒玉37’出胚量最高,为每蕾22.5个;在NLN-13培养基中添加10mg/L AG或10mg/L AGP,可以促进耐寒甘蓝胚状体发生。32.5℃热激胁迫1d可有效诱导耐寒甘蓝小孢子培养中的胚胎发生,10mg/L AG或10mg/L AGP促进胚胎诱导。     

芜菁小孢子胚胎发生及其显微结构观察研究

以喀什芜菁为材料,利用显微镜技术,研究小孢子胚胎发生过程。试验结果表明,没有进行热激处理的小孢子主要是沿配子体途径发育,即从四分体,经由单核靠边期、双核期,发育成为成熟的花粉粒过程;33℃热激处理1~3 d后,小孢子改变发育途径,沿孢子体途径发育。部分小孢子出现细胞膨大,发生第一次有丝分裂分裂,形成2—细胞,2个子细胞之一发生垂直于子细胞壁方向的分裂,形成"T"型3—细胞原胚然后沿多细胞原胚、胚柄球形胚、鱼雷形胚、心形胚最终发育成子叶型胚。但随培养天数增加,大多数膨大的细胞不能分裂或分裂后停止发育。     

松花菜小孢子发育的细胞学观察

以松花菜F1代杂交种为材料,分别观察自然发育和游离培养条件下小孢子的发育过程。结果表明,自然条件下,四分体释放小孢子后,单核小孢子经历2次分裂,从双核期到三核期,最后发育为成熟花粉粒,是配子体发育途径;在游离培养条件下,小孢子经过热激(33℃)处理后,发生均等分裂或者不均等分裂,之后经过一系列的细胞增殖,最终发育成为胚状体,小孢子发育途径是从配子体向胚胎发育转换的途径。同时发现,并不是所有发生了分裂和增殖的细胞都能形成胚状体,只有极少数小孢子最终形成正常胚。     

温度胁迫对结球甘蓝游离小孢子胚胎发生的影响

以10份结球甘蓝F1为试材,探讨32.5℃热激预处理、4℃低温预处理对游离小孢子胚胎发生的影响,为建立高效、完善的结球甘蓝小孢子培养技术体系提供理论依据。结果表明：32.5℃热激预处理48 h较适于诱导所有供试基因型小孢子胚胎的产生,在10份供试基因型中,基因型G10的每蕾出胚数最高,达到34.35个;单独的4℃低温预处理对诱导结球甘蓝小孢子胚胎发生无明显促进作用;4℃预处理与32.5℃预处理48 h的组合处理方式对诱导结球甘蓝小孢子胚胎发生的作用因基因型而异。     

萝卜离体小孢子培养中的胚胎发生及发育途径（英文）

[目的]观察萝卜离体小孢子培养中的胚胎发生及发育途径。[方法]以中国萝卜品种山东花叶心里美为试材,研究其离体小孢子培养中的细胞核分裂特征及发育途径。[结果]离体小孢子培养过程中出现2种细胞核分裂特征的差异：①进行配子体发育的不均等分裂,即分裂形成2个大小不等的营养核和生殖核,该类小孢子形态与正常发育中双核期的小孢子相同;②进行孢子体发育的均等分裂,即形成2个大小相等的营养核。对小孢子发育进一步进行观察发现,均等分裂的细胞继续发育形成4细胞结构、多细胞团、球形胚、心形胚、鱼雷形胚及子叶形胚。[结论]该研究结果为萝卜游离小孢子培养技术提供细胞学依据。     

萝卜离体小孢子培养中的胚胎发生及发育途径

[目的]观察萝卜离体小孢子培养中的胚胎发生及发育途径。[方法]以中国萝卜品种山东花叶心里美为试材,研究其离体小孢子培养中的细胞核分裂特征及发育途径。[结果]离体小孢子培养过程中出现2种细胞核分裂特征的差异：①进行配子体发育的不均等分裂,即分裂形成2个大小不等的营养核和生殖核,该类小孢子形态与正常发育中双核期的小孢子相同;②进行孢子体发育的均等分裂,即形成2个大小相等的营养核。对小孢子发育进一步进行观察发现,均等分裂的细胞继续发育形成四细胞结构、多细胞团、球形胚、心形胚、鱼雷形胚及子叶形胚。[结论]该研究结果为萝卜游离小孢子培养技术提供细胞学依据。     

大白菜游离小孢子培养中胚胎发生及发育途径

[目的]观察大白菜离体小孢子培养中的胚胎发生及发育途径.[方法]以大白菜F1代杂交种为试材,采用光学显微镜观察游离小孢子胚胎发生和发育途径.[结果]细胞热激后膨大是胚状体诱导的关键因素.大白菜小孢子诱导成胚有3种途径,小孢子均等分裂途径、小孢子不均等分裂途径和小孢子直接萌发出胚途径.均等分裂途径是在连续的均等分裂以后形成原胚,原胚继续分裂形成球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶形胚.不均等分裂途径形成的两个细胞中较大的细胞继续分裂最终形成有极性的胚状体.[结论]该研究结果为大白菜小孢子的高频率诱导提供细胞学依据.     

结球甘蓝游离小孢子热激处理下差异表达基因分析

[目的]本文旨在探讨结球甘蓝游离小孢子培养早期体胚发生的分子机制,分析游离小孢子在热激处理下的基因表达谱。[方法]将易出胚结球甘蓝高代自交系611单核靠边期小孢子分别在体外32.5℃培养1 d(热激处理,E2)、体内正常生长1 d(对照组1,E3)及体外25℃培养1 d(对照组2,E5),利用转录组测序技术(RNA-Seq)对3个处理的小孢子文库进行差异基因表达谱分析,并鉴定热激处理下早期体胚发生的响应基因。[结果]将3个处理的小孢子Uni Gene表达量依次进行两两相比,即E2 vs E3、E2 vs E5以及E3 vs E5,分别鉴定出2 506、1 073和3 322个差异表达基因。基因本体(gene ontology,GO)聚类分析表明,热激处理下的差异表达基因显著富集到细胞组分中的细胞部件、细胞及细胞器;在分子功能中,这些基因在结合、催化活性及核酸结合转录因子活性中的比例最高;在生物过程中的细胞过程、代谢过程及刺激反应等类别中的比例也最高。京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析显示,热激处理下的差异表达基因显著富集到植物激素信号转导、植物病原互作、淀粉和糖代谢、抗坏血酸代谢、苯丙氨酸代谢以及多糖降解等途径。进一步对抗坏血酸代谢途径相关基因进行分析,抗坏血酸过氧化物酶基因APX1和APX2,半乳糖脱氢酶基因Gal DH以及乙醛脱氢酶基因AD在体外32.5℃培养1 d后均显著上调表达。[结论]通过转录组学方法揭示了结球甘蓝游离小孢子在热激处理下基因组的表达变化,鉴定了可能与早期体胚发生相关的抗坏血酸代谢途径基因,为进一步研究甘蓝小孢子体胚发生的分子机制奠定了基础。     

影响青花菜游离小孢子培养胚胎发生的因子

以13个青花菜品种为材料进行游离小孢子培养,探讨影响青花菜小孢子胚胎发生的因子。结果表明:基因型是影响青花菜小孢子培养胚状体发生的关键因子,13种基因型中有8种基因型能诱导产生胚状体,诱导率为61.5%;处于单核晚期至双核期的小孢子是诱导小孢子胚状体发生的最佳时期;在1/2 NLN培养基中添加适量的活性炭、6-BA、AgNO3和2,4-D有利于胚胎发生。4℃预处理24 h和32.5℃热激24 h有利于小孢子产生胚状体。     

影响青花菜游离小孢子培养的若干因素

10个青花菜杂种游离小孢子培养有 6个诱导出胚状体,诱导率达 60%,其中绿洲 808产胚量可达 13. 6个·蕾 -1;小孢子处于单核晚期到双核期适宜小孢子培养;在 1 /2NLN培养基中添加适量的蔗糖、活性炭、6 BA、AgNO3、2, 4 D有利于胚胎发生; 32℃热激处理 1d有利于小孢子产生胚状体;采蕾前 2-5d的温度在 15-25℃适合小孢子发育.     

不结球白菜小孢子胚胎发生过程及发育途径研究

采用FDA荧光染色法对小孢子游离培养的发育过程进行了观察。结果表明:不结球白菜花粉母细胞减数分裂释放出的小孢子发育到单核靠边期及稍后时期染色最深、活力最强。多数游离小孢子培养经历的发育过程与合子胚相似,并且胚胎发育迅速,6～9 d产生大量球型胚,13 d开始出现子叶型胚胎。小孢子胚胎发育途径既有对称分裂并产生胚胎的途径(B途径),也有第1次不对称有丝分裂的方式;第1次不对称分裂后,既有营养细胞单独发育成胚的现象(A途径),也有营养细胞和生殖细胞共同发育成胚的现象(E途径),但未发现生殖细胞单独发育成胚的现象。     

影响甘蓝小孢子胚状体发生的因素研究

以6个甘蓝杂交种为试材,采用游离小孢子培养方法,研究影响胚状体发生的因素。结果表明:花蕾长度为3.00~4.00 mm时,有利于获得胚状体;1 500 r/min离心、32.5℃热激24 h,最有利于胚状体的诱导;花蕾经低温4℃预处理24 h,可提高胚诱导率;低速振荡培养能够促进胚状体发生;基因型在小孢子胚状体诱导中起着主导作用。     

花椰菜游离小孢子培养及影响因子

以80份早中熟花椰菜栽培种为试材进行游离小孢子培养,研究了影响胚胎诱导的主要因子。结果表明,有20份材料诱导出胚状体,诱导率为25％；16％蔗糖培养液能较好地保持小孢子活性；13％蔗糖是小孢子发育的最适浓度；加液培养可显著提高产胚量；取材前6d内气温在10～20℃、取盛花前期至盛花中期的花蕾、选择单核靠边期至双核期的小孢子、经33℃热激处理48h后暗静止培养的产胚量最高。     

甘蓝游离小孢子培养中影响胚状体形成的主要因素

以甘蓝的19个基因型为试材,对影响甘蓝游离小孢子培养诱导胚状体形成的3个主要因素进行了研究。结果表明:供体植株基因型是影响小孢子发生胚状体的关键因素,不同材料之间的诱导频率差异显著;两种激素以不添加6-BA和NAA或只添加6-BA 0.05 mg/L为甘蓝游离小孢子培养的最适激素浓度;高温处理能显著提高小孢子培养的出胚率,供试材料经33℃热激处理后出胚率最高,出胚率高达6.10胚/蕾。     

白菜和芜菁杂种小孢子培养研究

对白菜和芜菁的6个杂种F1代进行游离小孢子培养，结果表明，不同组合间小孢子胚胎发生频率存在很大差异，胚产量最高的两个组合“矮脚黄×气死孩”和“苏州青×气死孩”平均每蕾分别产生21.1和17.2个胚。诱导杂种胚状体发生的最佳时期是单核中期至单核靠边期。33℃、24h热激处理可明显提高杂种小孢子胚的诱导率，培养基中加入活性炭也可改善胚的分化。     

预处理对不结球白菜游离小孢子胚胎发生的影响

研究了低温预处理、热激处理和高糖浓度处理对不结球白菜游离小孢子胚胎发生的影响。结果显示：对供体花蕾进行1～3d的低温预处理能显著提高出胚率,超过5d则明显降低,并且不同基因型对低温预处理的反应不同;热激处理对小孢子胚胎发生起关键作用,不同基因型所要求的最佳热激温度和时间不同;以17％的高糖浓度培养基对游离小孢子进行1～4d预处理能显著提高出胚率,随处理时间的延长效果降低,但在1～4d范围内胚诱导率均高于对照。     

甘蓝类蔬菜游离小孢子培养研究回顾与展望

回顾了甘蓝类蔬菜游离小孢子培养研究的发展历史及现状,总结了影响甘蓝类蔬菜游离小孢子胚胎发生的因素,指出内因是小孢子成胚的决定性因素,外因是小孢子成胚的关键。同时,展望了甘蓝类蔬菜游离小孢子培养技术的应用前景。     

2个甘蓝F1小孢子培养中高出胚率的诱导技术研究

以2个优良的F1甘蓝为试材,探讨了高温热激、蔗糖浓度、添加和更换培养液培养、激素种类与浓度配比等因素对提高甘蓝小孢子诱导胚产量的影响.结果表明,2个F1甘蓝材料经24 h 、33℃高温热激处理对小孢子胚胎发生是必要的;小孢子在13%蔗糖浓度培养基(NLN-13)中培养胚产量最高,为1.89胚/蕾;高浓度蔗糖的培养基(NLN-17)培养3 d后添加低浓度蔗糖培养基(NLN-10)培养能大幅度提高胚产量,比一直在13%蔗糖的培养基(NLN-13)培养的胚状体增加255.2%;NLN-13培养基中添加0.1 mg/L 6-BA和0.05 mg/L NAA能够诱导出高胚产量.     

热激处理对花椰菜小孢子培养的影响

以花椰菜作为试验材料进行游离小孢子培养研究,结果表明:32.5℃、24 h的热激处理是胚状体发生的最适高温处理;游离小孢子培养15～20 d后可以观察到胚状体,然后转移到固体MS培养基中进行植株再生。     

羽衣甘蓝小孢子胚胎细胞结构变化及其植株再生

[目的]研究组织培养过程中羽衣甘蓝小孢子胚胎细胞结构变化及其植株再生,为小孢子培养技术在羽衣甘蓝中的应用提供理论依据.[方法]以12个羽衣甘蓝品种为材料,采用LEICA倒置荧光显微镜研究小孢子热激后的胚胎细胞结构变化、胚胎发育过程及出胚率差异,运用透射显微镜观察胚性小孢子细胞核的融合过程,并分析不同培养基(B5分化培养基和MS分化培养基)及其琼脂浓度(0.8%、1.0%和1.2%)对胚状体成苗率的影响.采用遮盖方式驯化组培苗后移栽大田,统计其成活率.[结果]在12个羽衣甘蓝品种中,除Y4花蕾的小孢子未发育成胚状体外,其他品种花蕾的小孢子均发育成不同数目的胚状体.其中,Y1和Y2平均每个花蕾的出胚数较高,分别为11.84和10.36个;Y3、Y7和Y8平均每个花蕾的出胚数较少,分别为1.55、1.45和0.94个.对于出胚数多的品种,对称分裂是其小孢子细胞分裂的主要方式,小孢子发育形成子叶形胚状体的比例也较高;而出胚数少的品种易发生小孢子不对称分裂,最终形成较多的畸形胚,子叶形胚数量较少.32.5℃热激1 d即可启动小孢子细胞胚胎发育进程,经原胚、球形胚、心形胚、鱼雷形胚,最终形成子叶形胚.热激处理后培养2d小孢子进行第一次对称分裂形成两个大小、形状相似的细胞;培养5~7d后两个细胞(胚性小孢子)逐渐靠近并融合在一起,细胞核核膜紧靠在一起,随后聚结融合,核酸物质混合,融合早期形成类似花生形的细胞核结构.含不同浓度琼脂的B5分化培养基和MS分化培养基中胚状体成苗率排序均表现为0.8%琼脂<1.0%琼脂<1.2%琼脂,且同一琼脂浓度下,B5分化培养基的胚状体成苗率均较MS分化培养基的高.组培苗驯化后移栽大田,成活率可达100%.[结论]通过小孢子培养可快速有效获得羽衣甘蓝小孢子单、双倍体再生植株.在培养过程中,胚性小孢子细胞核融合可能是导致单倍体小孢子自发加倍成为多倍体的重要方式,且含1.2%琼脂的B5分化培养基更适合用于羽衣甘蓝胚状体增殖分化成苗.