Bacillus subtilis Z-3菌株纤溶酶的分离纯化研究

为获取微生物源溶栓药物,从土壤中获得产纤溶酶活性较高的1株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Z-3。从Z-3菌株的发酵液中提取纤溶酶,利用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和聚丙烯酰凝胶电泳等方法,对纤溶酶进行分离纯化。分离纯化得到1个单一组分(BSFE-1),SDS-PAGE电泳检测为单一条带,BSFE-1表观分子量为48 kDa,等电点为10.5,属丝氨酸蛋白酶类,纤维蛋白平板法检测纤溶酶活性BSFE-1的比活力为4 494.099 U/mg,BSFE-1在4~50℃和pH 4~11之间活性较稳定。     

产纤维素酶菌株B.subtilis SD-76产酶条件的优化

[目的]探讨培养基起始p H、碳源、氮源和发酵温度对高产纤维素酶菌株B.subtilis SD-76产酶的影响。[方法]通过正交分析确定菌株B.subtilis SD-76产纤维素酶(CMCase)的最佳培养条件。[结果]菌株B.subtilis SD-76产酶的最佳培养条件:培养基初始p H 6.8;培养基稻草粉浓度3.0 g/L;硫酸铵浓度3.5 g/L,发酵温度32℃。在最佳培养条件下,该菌株的CMCase活力达到462.34 U。[结论]为提高B.subtilis SD-76产纤维素活力和该菌株的工业产酶生产提供一定的参数和应用依据。     

拮抗细菌菌株 Bacillus subtilis B5423标记菌株的筛选及其突变体的遗传多态性研究

Bacillus subtilis B5423是一株对水稻纹枯病和恶苗病有较好防效的菌株。为了解该菌株在水稻体表的种群动态,先后选用抗生素萘啶酮酸(Nal)和利福平(Rif)标记该菌株。所获结果如下：①在225个Nal抗性的突变体中未能获得有效的标记菌株,测定显示7个有代表性的菌株均不能在含Nal(20～100μg／mL)的PPM培养基上回收,表明这些突变体对Nal的抗性是不能稳定遗传的;②从445个Rif抗性的突变体中,选择10个菌株进行稳定性测定,结果表明这些突变体在含100μg／mL的Rif的PPM培养基上均能有效地回收;③进一步通过对离体叶片纹枯病病斑面积的抑制、突变体生长速率的测定,筛选到一有效的标记菌株B-R-156。④应用BOX-PCR对菌株B5423及其Nal和Rif抗性的突变体作DNA指纹图谱,结果发现在TSA培养基上2个菌落形态明显改变的Nal抗性的突变体B-N-72和B-N-125均在约575bp位点处增加了一条带型,其余Nal抗性的突变体及所有Rif抗性的突变体的带型与野生型菌株相一致。     

不同培养基对Bacillus subtilis XF-1产脂肽抗生素的影响

为探索培养基对脂肽种类及产率的影响,本文考察了Bacillus subtilis XF-1在5种培养基中发酵的生物量和丰源素、表面活性素及伊枯草菌素等环脂肽化合物产率,并通过HPLC分析了发酵液中化合物种类的变化。试验结果表明,各培养基在相同条件下生物量由大到小的顺序为MOLP(2.07 g/L)、PSA(1.28 g/L)、LB(1.03 g/L)、Landy(0.326 g/L)、蔗糖取代葡萄糖的Landy培养基(LS,0.375 g/L)。经过酸沉醇提取后获得脂肽混合物,其质量由大到小的顺序为:MOLP(0.351 g/L)、PSA(0.176 g/L)、LB(0.201 g/L)、Landy(0.501 g/L)、LS(0.517 g/L)。最适合菌体生长的是MOLP培养基,脂肽产率最高的是LS,其次是Landy培养基。5种培养基发酵液中所含环脂肽类化合物色谱图基本一致。LS比Landy提高菌体生物量15%,提高脂肽类抗生素3%,因此Landy培养基和LS培养基可作为XF-1脂肽化合物合成专用培养基。     

Bacillus subtilis fmbR抗菌物质的分离和鉴定

 【目的】对Bacillus subtilis fmbR产生的抗菌物质进行分离和鉴定研究，以确定抗菌物质的组成和结构。【方法】采用HPLC和TLC层析对Bacillus subtilis fmbR抗菌物质进行分离纯化，通过ESI-MS和MALDI-MS分析对抗菌物质的组成和结构进行初步鉴定。【结果】HPLC层析表明了Bacillus subtilis fmbR抗菌物质含有保留时间与surfactin相似的成分。TLC层析和原位酸解证明了Bacillus subtilis fmbR抗菌物质含有闭合肽键类的物质，其中之一为相对迁移率Rf与标样surfactin相近的组分。采用ESI-MS分析检测到Bacillus subtilis fmbR抗菌物质含有分子量与surfactinA相同的m/z1009.1、m/z1023.2 和m/z1037.0等3种同系物；通过MALDI-MS分析获得[M+H]+为m/z 3403.95抗菌物质，该物质分子量与Bacillus subtilis 168产生的细菌素subtilosin的m/z3403.3 相同。【结论】Bacillus subtilis fmbR抗菌物质由C13～C15的3种surfactinA同系物和一种羊毛硫抗生素subtilosin组成。     

棉花黄萎病拮抗细菌2-70(Bacillus subtilis)菌株定殖能力的研究

本试验通过灭菌土和非灭菌土两种土样,试验前分别对这两种土样进行三种不同的处理即：用拮抗菌芽孢液浸种、土壤全部混菌和部分混菌进行盆栽试验。本文主要通过盆栽实验,考察棉花黄萎病拮抗细菌2-70在土壤中的定植情况及在棉花根内和根际的定植情况。结果表明,在实验室条件下,拮抗细菌2-70能够在灭菌土和非灭菌土中定殖,且定殖数量达106cfu/g土左右,经过五个月后仍能保持较高的抑菌活性,并且菌株在灭菌土中的定殖数量高于非灭菌土中的数量。通过对棉苗根内细菌的回收,证实拮抗细菌2-70能在棉花根内定殖,数量达到103cfu/g。     

小麦全蚀病菌拮抗菌Bacillus methylotrophicusZ-9菌株产芽孢条件优化

甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)Z-9菌株对小麦全蚀病病原菌有显著拮抗活性,以芽孢产率和活菌数为主要指标,采用单因素试验和正交试验对Z-9菌株摇瓶产芽孢条件进行优化,为其工业生产提供试验依据。通过单因素试验确定最佳碳源、氮源和无机盐分别为玉米粉、黄豆饼粉和MnSO_4·H_2O、Mg SO_4·7H_2O。通过正交试验确定最适培养基组分为玉米粉1.0%、黄豆饼粉2.0%、MnSO_4·H_2O 0.04%、MgSO_4·7H_2O 0.04%、Na_-2HPO_4·2H_2O 0.4%、Na H_2PO_4·2H2O 0.2%;最适发酵条件为:初始p H值7.5,250 m L三角瓶装液量50 m L,37℃培养36 h。优化后发酵液的芽孢数量为1.60×109cfu/m L,较优化前提高了13.7倍,芽孢产率达到96.5%。     

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)液体发酵条件

采用单因素试验和正交试验对筛选出的1株生防拮抗菌——枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的液体发酵培养基和工艺条件进行优化。确定了最佳的培养基配方为:蔗糖20g·L-1、硫酸铵5g·L-1、麸皮50g·L-1、柠檬酸三钠2.5g·L-1、K2HPO·43H2O0.3g·L-1、MgSO4·7H2O0.5g·L-1、FeSO4·7H2O0.05g·L-1;最适发酵条件为:发酵温度30℃,初始pH值7.2,最适接种量5%;进行了100L发酵罐放大培养,20h达到生长高峰期,生长周期24h,最适放罐时间为26￣28h;此时所获得的菌体数量约为6×109个·mL-1。     

Bacillus subtilis脂肽Bacillomycin D抗黄曲霉毒素研究进展

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtills)被认为是一种有效抑制黄曲霉并降解其毒素的菌种。己从不同的枯草芽孢杆菌菌株中分离得到具有抑制黄曲霉毒素的脂肽抗生素Bacillomycin D。Bacillomycin D属于Iturin家族,是枯草芽孢杆菌抑制黄曲霉毒素最强抗生素,也是目前唯一从枯草芽孢杆菌菌株中得到并且已经鉴定的具有抗黄曲霉活性的物质。该文对枯草芽孢杆菌及其抗菌脂肽Bacillomycin D的结构、性质、抑制黄曲霉机制进行了综述,为其进一步应用提供参考。     

拮抗细菌Bacillus subtilis A30对水稻病原菌的抑制作用

由杭州郊区水稻叶围分离得到ＢａｃｉｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＡ３０菌株，平板检测表明它对Ｘａｎ－ｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚａｅ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ和Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅｇｒｉｓｅａ等多种水稻病原真菌、病原细菌均有很好的拮抗作用．以水稻白叶枯病、水稻纹枯病为代表进行小区试验，结果表明，Ａ３０菌株的防病效果分别为５８．１％和３９．０％．Ａ３０菌株的培养去菌液经７０％饱和度（ＮＨ４）２ＳＯ４处理，拮抗物可被（ＮＨ４）２ＳＯ４沉淀，其拮抗粗提液经Ｄｉｏｌ１５０及ｐｒｏＲＰＣＨＲ５／１０等色谱柱分离得到两种对Ｘ．ｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚａｅ的拮抗峰和两种对Ｒ．ｓｏｌａｎｉ的拮抗峰．     

拮抗细菌Bacillus subtilis A30对水稻病原菌的抑制作用

由杭州郊区水稻叶围分离得到Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ａ３０菌株，平板检测表明它对Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ． ｏｒｙｚａｅ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ和Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ等多种水稻病原真菌、病原细菌均有很好的拮抗作用。以水稻白叶枯病、水稻纹枯病为代表进行小区试验，结果表明，Ａ３０菌株的防病效果分别为５８     

内生拮抗菌Bacillus subtilis QZ-7抗茄子黄萎病研究

从开花期茄子的根内分离到对茄子黄萎病菌具有强烈抑制活性的拮抗菌株Bacillus subtilis QZ-7,其抑菌带宽达26.60mm。定殖试验表明,QZ-7菌株能有效定殖于茄子根内,并能在茄子根际存活并保持较高菌量。对茄子种子萌发和幼苗生长影响试验表明,该菌株可促进种子萌发,并具有明显促进茎伸长生长的作用。室内盆栽试验表明,单个菌株对茄子黄萎病的防效可达86%,且持效期较长。这些结果表明,QZ-7具有进一步研究开发的价值。     

乙草胺降解菌Bacillus subtilis L3的土壤修复效果研究

应用微生物技术可以对乙草胺污染土壤进行修复,经前期分离筛选及鉴定,已获得高效乙草胺降解菌株Bacillus subtilus L3,为进一步明确其对乙草胺的实际降解效果及对污染土壤的修复作用,对L3开展盆栽效果研究。试验考察了不同降解菌浓度和施用时间对乙草胺降解率的影响,以及降解菌的施用对土壤中可培养的常见微生物数量、酶活、营养元素及敏感作物小麦生长的影响等。结果表明,终浓度为5×108CFU/g土的菌液对乙草胺的降解率最高,50 d后对乙草胺的降解率为92.65%;施用L3菌液后,污染土壤微生物的数量有较大程度的恢复;蔗糖酶、脲酶、蛋白酶、过氧化氢酶活力分别提高100%、260%、56%与6%;土壤的全氮、速效磷、有效钾、有机质分别提高77%、159%、698%和274%;小麦地上部分较对照组增高117%,总鲜重增重56%,根长增长27%。该结果证实菌株L3具有良好的乙草胺降解效果和土壤修复能力,为该菌株在土壤污染治理及修复中的实际应用奠定了理论基础。     

高效解磷菌Bacillus subtilis P-1的N离子束诱变育种

通过N离子束注入对枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis P-1进行诱变,筛选得到一株解磷能力提高48 %的突变菌株B.subtilis P-1-5.对B.subtilis P-1和B.subtilis P-1-5发酵过程中碱性磷酸酶活性(AKP)和可溶性磷含量进行了定量分析,结果表明两者的碱性磷酸酶活性和可溶性磷含量变化趋势基本一致,但B.subtilis P-1-5均比同期B.subtilis P-1值高,说明突变菌株B.subtilis P-1-5比原始菌株B.subtilis P-1解磷性状优良.     

催吐萝芙木内生菌Bacillus subtilis LYM3的抑菌活性产物

为了研究分离自催吐萝芙木的内生细菌Bacillus subtilis LYM3的抑菌谱及其产生的抑菌活性产物,利用对峙生长法测试了菌株LYM3对10种植物病原真菌的拮抗活性,利用Sephadex LH-20凝胶柱对其产生的抑菌活性产物进行了分离,并利用LCMS-IT-TOF进行了初步鉴定。结果显示:菌株LYM3对10种植物病原真菌均有较强的拮抗作用,抑制率均在60%以上,其中对香蕉炭疽病菌的抑菌活性最强,抑制率为83.5%;LYM3产生的抑菌物质主要为胞外产物,具有较好的热稳定性,在p H 6~12活性稳定;经分离发酵液获得3种抑菌活性组分A、B和C,经初步鉴定推测A属于伊枯草菌素,B和C属于表面活性素。可见,菌株LYM3具有广谱抗菌性,其产生的抑菌活性产物主要为脂肽类物质。     

豆豉溶栓酶产生菌Bacillus subtilis LD-8547的诱变选育

为了通过诱变筛选获得豆豉溶栓酶高酶活菌株.研究以豆豉溶栓酶产生菌株Bacillus subtilis LD-8547为出发菌株,分别通过紫外线诱变和硫酸二乙酯的复合诱变,根据奶粉平板和血粉平板上菌落透明圈的大小进行初筛和复筛.并采用四肽底物测定法进行了溶栓酶的酶活力测定.结果表明,通过实验获得了产豆豉溶栓酶酶活力达18 228 U/mL的LD-8547-25菌株,比诱变出发菌株的酶活力提高了107％.为豆豉溶栓酶高酶活菌株的诱变筛选提供了有益的试验数据.     

Bacillus subtilis LC-9产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶学性质与催化特性研究

[目的]系统研究Bacillus subtilis LC-9所产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶学性质,探讨其在催化应用上的可行性。[方法]采用两步阴离子交换层析法对B.subtilis LC-9发酵液中的β-1,3-1,4-葡聚糖酶进行纯化,用SDS-PAGE检测其纯度,研究纯酶的酶学性质及该酶对β-葡聚糖和地衣多糖的降解特性,并采用TLC法检测其水解液中糖的成分。[结果]从自行筛选的糖苷酶产生菌B.subtilis LC-9的发酵液中经两步纯化,得到电泳纯的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,其比活力达3 502 U/mg,表观分子量为28 kDa;酶的最适反应pH和温度分别为6.5和45℃,且在45℃下稳定;该酶催化地衣多糖的Km值和Vmax分别为4.13 mg/ml和1 238μmol/min/mg,催化大麦β-葡聚糖的Km值和Vmax分别为3.84 mg/ml和1 427μmol/min/mg;该酶降解大麦β-葡聚糖产生寡聚糖,最终产物主要为三糖和四糖,而降解地衣多糖终产物主要为三糖。[结论]从Bacillus subtilis LC-9发酵液中纯化获得了电泳纯的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,性质研究表明该酶是专一性的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,有望用于啤酒、饲料等领域。     

Bacillus subtilis Czk1挥发性化合物对橡胶树红根病菌的抑制作用

由橡胶灵芝菌（Ganoderma pseudoferreum）引起的红根病是橡胶树生产上毁灭性病害之一。为明确枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Czk1产生的挥发性物质对橡胶灵芝菌的抑制作用，以橡胶灵芝菌为靶标菌，通过平板对峙法检测Czk1所产12种挥发性化合物纯品的抑菌活性；采用生长速率法对挥发性活性组分进行毒力测定；检测挥发性混合组分对橡胶灵芝菌细胞的形态及细胞膜通透性的影响。结果表明，12种挥发性化合物纯品对橡胶灵芝菌均具有不同程度的抑菌活性，其抑菌率在15.20%～100%之间，其中，苯甲醛对橡胶灵芝菌抑菌活性最强，抑菌率达到100%。9种化合物纯品对病菌的毒力测定中，苯甲醛、3,5-二甲氧基苯乙酮、2,6-二叔丁基对甲酚EC₅₀分别为20.30、30.62、40.96 μg·mL^-1。该三种混合组分浓度为25 μg·mL^-1，其对橡胶灵芝菌的抑制率为67.00%。经三种混合活性组分处理后的病菌菌丝缠绕成一团，细胞壁变薄，部分膜结构不完整。混合活性组分影响病菌细胞通透性。Czk1产生的挥发性物质具良好的抑菌活性是由这些挥发性物质协同作用的结果，这些挥发性物质应用前景巨大，可作为化学农药替代品防治橡胶树红根病。     

Bacillus subtilis Czk1挥发性化合物对橡胶树红根病菌的抑制作用

由橡胶灵芝菌（Ganoderma pseudoferreum）引起的红根病是橡胶树生产上毁灭性病害之一。为明确枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Czk1产生的挥发性物质对橡胶灵芝菌的抑制作用,以橡胶灵芝菌为靶标菌,通过平板对峙法检测Czk1所产12种挥发性化合物纯品的抑菌活性;采用生长速率法对挥发性活性组分进行毒力测定;检测挥发性混合组分对橡胶灵芝菌细胞的形态及细胞膜通透性的影响。结果表明,12种挥发性化合物纯品对橡胶灵芝菌均具有不同程度的抑菌活性,其抑菌率在15.20%～100%之间,其中,苯甲醛对橡胶灵芝菌抑菌活性最强,抑菌率达到100%。9种化合物纯品对病菌的毒力测定中,苯甲醛、3,5-二甲氧基苯乙酮、2,6-二叔丁基对甲酚EC₅₀分别为20.30、30.62、40.96 μg·mL^-1。该三种混合组分浓度为25 μg·mL^-1,其对橡胶灵芝菌的抑制率为67.00%。经三种混合活性组分处理后的病菌菌丝缠绕成一团,细胞壁变薄,部分膜结构不完整。混合活性组分影响病菌细胞通透性。Czk1产生的挥发性物质具良好的抑菌活性是由这些挥发性物质协同作用的结果,这些挥发性物质应用前景巨大,可作为化学农药替代品防治橡胶树红根病。