Cloning of Bile Salt Hydrolase Gene and Its Expression in Lactic Acid Bacteria

According to the sequence of the bile salt hydrolase (BSH) gene of Bifidobacterium and the restriction enzyme cutting sites of expression vector pNZ8148, primers were designed and the bile salt hydrolase (BSH) gene was gotten from Bacillus bifidus ATCC 29521 by PCR. BSH gene was inserted into lactic acid bacteria expression vector pNZ8148 to construct the recombinant pNZ8148-BSH. The recombinant pNZ8148-BSH was transferred into lactic acid bacteria NZ9000 with electrotransformation method. And the recombina...     

来源于苍白杆菌的甲基对硫磷水解酶基因的克隆

有机磷化合物作为一类高效广谱的杀虫剂被广泛使用,在使用的同时也造成了大面积的环境污染。本研究从被农药高度污染的土壤中筛选到了一株对甲基对硫磷农药有高效降解能力的细菌,通过16S rDNA鉴定为苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)。克隆该菌的有机磷降解酶编码基因mphxw,构建原核表达载体,其表达产物具有正常生物学活性,同时纯化了重组酶。     

藏灵菇源干酪乳杆菌KL1高产胆盐水解酶发酵条件的优化研究

利用从藏灵菇中筛选的产胆盐水解酶的干酪乳杆菌Lactobacillus cazei KL1研究影响胆盐水解酶酶活力的环境因素和超声波细胞破碎条件,探讨产酶能力的检测方法;采用四因素三水平[L9(34)]正交试验研究胆盐水解酶的优化发酵条件,利用完全交叉组合试验研究超声波细胞破碎的最适条件,并应用牛津杯试验定性检测KL1菌株产胆盐水解酶的能力;优化发酵条件:葡萄糖添加量为2%、大豆蛋白胨添加量为2%、发酵温度为37℃、接种量为2%;细胞破碎最适条件:超声波功率为700 W,3S间歇,5S工作,持续工作15min,控制温度范围0～6℃.在优化发酵条件下,胆盐水解酶的活力是优化前的7.4倍;在超声波细胞破碎最适条件下,细胞破碎率能达到80%的要求,并可检出胆盐水解酶活性;牛津杯试验结果表明Lactobacillus casei KL1菌株产生的胆盐水解酶具有降低胆固醇的功效.     

棉花木葡聚糖转移/水解酶基因克隆和分析

为研究XTH基因与棉花(Gossypium spp.)纤维伸长的关系,克隆了两个XTH基因,分别命名为Gh XTH1(Gen Bank:AY189971)和Gh XTH2(Gen Bank:JN968478)。Gh XTH1编码区全长870 bp,编码289个氨基酸,Gh XTH1全长885 bp,编码294个氨基酸。序列分析表明,Gh XTH1和Gh XTH2均存在XTH家族保守序列DEIDFEFLG。生物信息学分析表明,Gh XTH1和Gh XTH2均含有信号肽。跨膜结构预测表明,Gh XTH1和Gh XTH2均在N端存在跨膜螺旋。系统发生学分析表明,Gh XTH1与拟南芥XTH6、XTH7亲缘关系较近,Gh XTH2与拟南芥XTH9亲缘关系较近。半定量分析表明,Gh XTH1和Gh XTH2均随着棉花纤维发育表达量降低,Gh XTH2比Gh XTH1表达量高。     

牛乳中乳酸乳球菌nisRK基因的克隆与序列分析

以一株分离自牛乳中乳酸乳球菌染色体DNA为模板,采用PCR技术扩增出乳链菌肽生物合成的双组分调控元件(nisRK基因)。试剂盒回收纯化nisRK基因后将其克隆入以氨苄青霉素为选择压力的pGEM-T克隆载体中,再转化E.coliDH5α感受态细胞,筛选阳性克隆,提取重组体,进行酶切鉴定和PCR鉴定,并对nisRK基因进行序列测定,与已知序列进行同源性比较。结果表明成功地克隆出nisRK基因,全长为2 035 bp,与国外报道的nisRK基因同源性高达99.9%。     

猪泛素C端水解酶L1基因的克隆与序列分析

从人泛素C端水解酶L1(UCH_L1)基因出发,在dbEST数据库中同源搜索,找到1条与人UCH_L1基因编码氨基酸同源性较高且在香猪背最长肌中表达的EST(BM194679).通过电子克隆和进一步RT-PCR试验验证,获得猪UCH_L1基因全长cDNA序列,其全长 1 105 bp,开放阅读框(ORF)位于60～728 bp,编码223个氨基酸.同源性分析结果表明,与人、鼠UCH_L1基因cDNA编码区(CDS)同源性分别为91.2%和86.5%,蛋白质序列同源性均为96.6%.对该基因编码蛋白的结构和功能预测显示含有2个典型的疏水性区域,不含有信号肽,存在1个UCH_L1(pfam01088)保守结构域和多个磷酸化位点,属UCH_L1蛋白家族,故将该基因命名为猪泛素C端水解酶L1基因(登录号AY495532).     

产胆盐水解酶植物乳杆菌降胆固醇作用的研究

采用茚三酮显色法测定了5株具有潜在益生特性的植物乳杆菌的胆盐水解酶(BSH)活性,采用邻苯二甲醛法测定了发酵上清液、菌体洗涤液和菌体破碎液中胆固醇含量,并对二者进行了相关性分析。结果表明,5株菌的BSH比活力为0.0149~0.0299U/mg总蛋白,去除胆固醇能力为37.64~47.88μg/mL。5株乳杆菌BSH活性与菌体洗涤液中胆固醇含量呈显著正相关,推断是菌株BSH水解结合胆盐生成游离胆酸,后者与胆固醇共沉淀,从而达到降胆固醇的效果。上述研究结果为利用益生菌生产具有降胆固醇功效的产品提供了理论依据。     

纳豆激酶基因的克隆及表达研究

经PCR扩增获得了纳豆激酶基因(NK).将此基因插入原核表达载体pTWIN1中,使之与几丁质结合域(CBD)一内含肽(intein)融合,获得原核表达质粒pTWIN1/NK.转化宿主菌E.coli BL21(DE3),在IPTG诱导下进行纳豆激酶的表达研究.SDS-PAGE电泳分析结果表明,重组蛋白在BL21(DE3)中获得高效表达,在低温诱导时主要以可溶性蛋白的形式存在.     

成熟砂梨果实木葡聚糖转移酶基因PpXTH1的克隆及其在夏季货架期的表达规律

木葡聚糖内糖基转移酶(XTH)通过降解细胞壁中半纤维的主要成分木葡聚糖在果实的软化过程中发挥重要作用。为探明XTH基因与砂梨品种翠冠果实软化之间的关系,本研究以翠冠果肉cDNA为模板,采用RT-PCR和RACE方法,克隆获得了编码砂梨XTH基因的全长cDNA序列(PpXTH1,1 300 bp)。序列分析表明,PpXTH1的5′端和3′端非翻译区分别为125 bp和293 bp,它的开放阅读框为882 bp,编码294个氨基酸,推导的PpXTH1蛋白序列含有XTH蛋白的催化活性部位DEIDFEFL。砂梨PpXTH1与其他植物果实中的XTH蛋白具有较高的同源性,其中与苹果MdXTH1的同源性为98.0%;与猕猴桃AdXTH5的同源性为85.0%;与番茄LeXTH4的同源性为67.6%。分子进化树分析表明,PpXTH1与MdXTH1、PcXTH1、AdXTH5、PtrXTH16A同分在一组,而这些XTH蛋白与果实成熟和细胞壁的次生结构代谢密切相关。在夏季货架期,28~32℃条件下,翠冠果肉中PpXTH1的表达量持续上升,贮藏8 d时其表达量最高,之后缓慢下降,1-MCP对PpXTH1的表达起延缓作用。以上结果说明...     

Molecular Cloning and Functional Characterization of a Salt Tolerance-Associated Gene IbNFU1 from Sweetpotato

Iron-sulfur cluster biosynthesis involving the nitrogen fixation(Nif) proteins has been proposed as a general mechanism acting in various organisms.NifU-like protein may play an important role in protecting plants against abiotic and biotic stresses.Based on the EST sequence selected from salt-stressed suppression subtractive hybridization(SSH) cDNA library constructed with a salt-tolerant mutant LM79,a NFU gene,termed IbNFU1,was cloned from sweetpotato(Ipomoea batatas(L.) Lam.) via rapid amplification of cDNA ends(RACE).The cDNA sequence of 1 117 bp contained an 846 bp open reading frame encoding a 281 amino acids polypeptide with a molecular weight of 30.5 kDa and an isoelectric point(pI) of 5.12.IbNFU1 gene contained a conserved Cys-X-X-Cys motif in C-terminal of the iron-sulfur cluster domain.The deduced amino acid sequence had 66.08 to 71.99% sequence identity to NFU genes reported in Arabidopsis thaliana,Eucalyptus grandis and Vitis vinifera.Real-time quantitative PCR analysis revealed that the expression level of IbNFU1 gene was significantly higher in the roots of the mutant LM79 compared to the wild-type Lizixiang.Transgenic tobacco(cv.Wisconsin 38) plants expressing IbNFU1 gene exhibited significantly higher salt tolerance compared to the untransformed control plants.It is proposed that IbNFU1 gene has an important function for salt tolerance of plants.     

陆地棉盐胁迫应答基因GhPEAMT1的克隆及功能分析

【目的】磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(phosphoethanolamine N-methyltransferse,PEAMT)是植物磷酸胆碱合成的关键酶,而磷酸胆碱是可以增强植物抗性的甘氨酸甜菜碱合成底物胆碱的前体。通过对陆地棉磷酸乙醇胺N-甲基转移酶基因(GhPEAMT1)的克隆、表达模式分析,以及功能验证,探究GhPEAMT1在陆地棉响应盐胁迫中的生物学功能,为棉花耐盐品种的选育提供基因资源。【方法】根据转录组测序数据分析,最终确定GhPEAMT1为耐盐候选基因;通过聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因;通过生物信息学分析基因结构特征、预测蛋白质相对分子质量以及进化关系;利用荧光定量PCR(qRT-PCR)分析耐盐棉花品种早熟长绒7号和感盐棉花品种南丹巴地大花在NaCl胁迫后不同时间点不同组织的表达特征;构建亚细胞定位载体,进行烟草的瞬时转化,确定蛋白质在细胞中的位置;构建基因超表达载体,通过花序浸染法转化拟南芥,分析转基因拟南芥种子在盐胁迫下的萌发率和转基因拟南芥主根长度;利用病毒诱导基因沉默技术(virus induced gene silencing,VIGS)对早熟长绒7号棉...     

羊口疮病毒B2L基因克隆及表达

为了获得羊口疮病毒囊膜蛋白。以羊口疮病毒基因组为模板,利用羊口疮病毒B2L基因特异性引物,进行PCR扩增,回收以及纯化PCR产物,连接到PMD18-T载体上,测序结果表明B2L基因全长1 137 bp,编码379个氨基酸。再将B2L基因克隆至p ET-30a,构建原核表达载体p ET30a-B2L。经菌液PCR、酶切鉴定以及SDS-PAGE等方法表明成功构建原核表达载体,这将为今后的单抗制备以及羊口疮病毒的疫苗研究打下基础。     

弓形虫MAPK1基因的克隆与原核表达

为获取具有生物学活性的弓形虫MAPK1蛋白,根据Gen Bank中编码MAPK1的已知序列设计并合成1对引物,用NCoⅠ和HindⅢ双酶切后,连接到同样双酶切的原核表达载体PET-28a上,构建重组表达质粒PET-28a-MAPK1并转化至E.coli BL21感受态,用IPTG诱导表达,表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化,纯化后进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果表明:表达质粒在E.coli BL21中得到表达,克隆的MAPK1基因与Gen Bank中收录的基因序列同源性为99.9%。对重组质粒进行酶切鉴定,获得1 599 bp大小的目的基因片段,与预期结果相符,成功地构建了重组质粒PET-28a-MAPK1。Ni2+螯合柱纯化后蛋白浓度为0.26 mg/m L,可用作免疫原,经SDS-PAGE电泳显示PET-28a-MAPK1融合蛋白的分子量约为58 ku。Western blotting显示融合蛋白具有良好的抗原性。     

烟曲霉植酸酶基因的克隆及在毕赤酵母的高效表达

根据文献报道的烟曲霉植酸酶序列，设计引物以烟曲霉CCTCCAF93044的总DNA为模板进行梯度PCR，扩增出了1条约1．4kh的带，将该片段进行DNA序列测定，其序列与已报道的烟曲霉植酸酶序列完全一致，但只编码完整的成熟植酸酶序列。将该片段克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K上，获得表达质粒pHBM108。该质粒转化毕赤酵母KM71所得重组子经PCR验证后进行诱导表达，其中一重组子经144h诱导，植酸酶表达量至少为1．25mg／ml，比同类报道的表达量高出60％以上，以植酸钠为底物测得酶活为11．17U／ml。     

贝西滑刃线虫糖苷水解酶16基因克隆及功能

为研究线虫寄生相关基因,基于贝西滑刃线虫转录组高通量测序数据,筛选并克隆了贝西滑刃线虫糖苷水解酶16基因,对该基因进行了功能分析;应用Mega 5.05选用WAG模型所构建的最大似然树进行分析比对;通过原位杂交,定位了糖苷水解酶16基因在线虫体内的表达部位,分析了糖苷水解酶蛋白的三维空间结构。结果表明:贝西滑刃线虫糖苷水解酶16基因与真菌亲缘关系近,是通过基因平移解说的一个重要佐证。     

蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因克隆与表达研究进展

蔗糖是植物中重要的代谢产物,它直接或间接参与多种生理生化反应,研究其含量的变化规律对提高植物生物学产量和增强植物抗逆性具有重要的指导意义。蔗糖磷酸合成酶(SPS)是蔗糖代谢的关键酶之一,它催化蔗糖代谢中的限速反应,SPS基因在分子水平编码调控SPS。研究SPS基因克隆与表达规律是从分子水平揭示蔗糖代谢的基础。本文综述了近年来SPS基因克隆和表达研究进展,并展望了SPS基因的研究前景和应用前景。     

盐穗木Hc2a1基因的克隆及与表达分析

[目的]盐胁迫能够抑制植物生长.探讨盐穗木(Halostachys caspica)盐胁迫响应基因表达变化的影响,有助于阐明盐穗木的耐盐分子机理.[方法]利用RACE方法获得盐穗木Hc2a1基因全长序列,并进行生物信息学分析和基因表达检测.[结果]Hc2a1基因开放阅读框为2 277 bp,编码758个氨基酸,蛋白质分子量为87.29 KDa,理论等电点(pI)为9.32.亚细胞定位于线粒体内膜,具有一个16个氨基酸的信号肽,含多个跨膜结构域,亲水性氨基酸残基多于疏水性氨基酸残基,二级结构多为无规则卷曲.利用荧光定量PCR检测显示,在高盐浓度600 mmol/L处理不同时间条件下,随着盐胁迫时间的延长,Hc2a1的表达量逐渐上升,12h达到最高峰,随后开始下降.[结论]盐穗木Hc2a1基因编码多个C2结构域和跨膜区的蛋白质,基因表达受盐胁迫的诱导.     

来源于枯草芽孢杆菌的漆酶cotA基因克隆与表达及其酶学性质研究

漆酶作为一种含铜离子的多酚氧化酶,在环境保护、生物能源、食品工业和纸浆漂白等工业中有重要的应用价值。从枯草芽孢杆菌168菌株中克隆漆酶cotA基因,全长1 542 bp,编码513个氨基酸,外加一个终止密码子。将该基因在大肠杆菌Transetta（DE3）菌株中通过微好氧发酵法进行异源表达和纯化,获得的重组酶蛋白CotA的最适反应温度为60℃,最适pH为4.5。该酶在60℃具有较好的热稳定性,保温90 min后仍有71.70%的剩余酶活。最适反应条件下,重组酶对ABTS的Km为63.9±5 μmol/L,kcat为39.1±1/s,最大反应速率为0.005 μmol/L·min·mg,且在最适反应条件下,微好氧发酵法获得的重组酶蛋白CotA的比活（557.8 U/mg）是低温诱导法（0.2 U/mg）的2 655.4倍。因此,通过微好氧发酵法可以显著提高重组漆酶CotA的比活力。     

绿盲蝽超气门蛋白ALUSP的克隆、原核表达及纯化

【目的】克隆绿盲蝽超气门蛋白基因（ALUSP）,获得原核表达的重组蛋白,为ALUSP的功能研究奠定基础,也为进一步解析绿盲蝽蜕皮及变态发育的机制提供理论依据。【方法】根据已知昆虫的USP基因序列设计简并引物,获得ALUSP的保守序列;再通过设计特异性引物,利用RACE方法,分别克隆ALUSP 5′及3′段序列,然后通过拼接获得ALUSP全长序列;应用生物信息学方法,对ALUSP基因序列特征及其所编码蛋白的特性进行分析,建立系统进化树;将含有ALUSP的T载体经EcoR I及Xho I双酶切,构建ALUSP原核表达载体pEGX6P1-ALUSP,将该表达载体分别在15、25、30和37℃条件下进行诱导表达,再通过GST琼脂糖亲和层析和分子筛层析后获得ALUSP功能区纯化蛋白。【结果】ALUSP开放阅读框长1 005 bp,编码334个氨基酸,预测分子量56.63 kD,理论等电点8.42;序列特征分析表明,该基因翻译后的蛋白质具有超气门蛋白的典型特征,由A/B域（249 bp）、C域（198 bp）、D域（69 bp）和E域（489 bp）组成,其中C域高度保守,包含2个锌脂结构并含有1个P-盒和1个D-盒,且含有由8个氨基酸构成的核定位信号,D域含有1个识别DNA元件的T-盒,E域含有1个由8个α螺旋和1个β折叠形成袋状结构;氨基酸比对结果表明,ALUSP的氨基酸序列与稻绿蝽USP序列一致性最高（57.82%）,与其他昆虫的USP序列一致性较低,如膜翅目的Melipona scutellaris（46.05%）、Scaptotrigona depilis（45.94%）;系统进化树分析结果显示,半翅目与膜翅目、直翅目等昆虫的USP较为分化,位于不同分支,ALUSP与稻绿蝽USP进化关系最近,可能来源于共同的祖先。EcoR I和Xho I双酶切的重组克隆载体可成功亚克隆到pEGX-6P-1载体上,命名为pEGX6P1-ALUSP;经37℃、1.0 mmol•L-1的IPTG诱导的pEGX6P1-ALUSP重组质粒可特异性表达1个约65 kD的蛋白,并且该重组ALUSP蛋白主要以包涵体形式存在;收集含有目的基因的菌株进行GST琼脂糖亲和层析和分子筛层析,最后进行复性和纯化后在65 kD附近仅出现1条清晰的特异性条带,表明已得到纯化的靶蛋白。【结论】克隆了ALUSP全长,其具有昆虫超气门蛋白的典型特征,并获得了原核表达的重组蛋白。