ROP蛋白在植物生长发育及逆境响应中的作用研究进展

ROP(Rho-related GTPases from plants)蛋白是植物特有的一类小G蛋白,在植物信号转导方面起着重要作用,可以调控植物生长发育及逆境响应.综述了 ROP蛋白的结构,在植物花粉管、根毛生长发育中的作用,在植物抵御低温、干旱、高盐、病虫害中的作用,并对今后的研究方向进行了展望,以期为ROP蛋白在植物育种中的应用提供理论依据.     

蒺藜苜蓿小G蛋白MtROP9基因的克隆与表达分析

【目的】对蒺藜苜蓿ROP基因进行克隆与表达分析,为深入研究ROP基因在豆科植物与根瘤菌共生互作过程中的功能提供理论依据。【方法】依据拟南芥11个ROP保守序列特征和蒺藜苜蓿数据库信息,同源克隆蒺藜苜蓿的MtROP9基因,采用生物信息学方法对该基因序列进行分析,并采用半定量RT-PCR法,对MtROP9基因在蒺藜苜蓿不同组织及根瘤菌侵染后不同时间根系中的表达水平进行检测。【结果】从蒺藜苜蓿根系中克隆到了MtROP9基因的cDNA序列,全长为947 bp,编码209个氨基酸。序列分析表明,MtROP9具有ROP蛋白典型的结构特征,并与拟南芥AtROP9、水稻OsRac2、葡萄VvROP9、玉米ZmROP6和ZmROP7具有高度的相似性。MtROP9基因具有一定的时空表达特性,在根系和花中表达水平较高,在茎和根瘤中表达水平相对较低,在叶中几乎不表达。在蒺藜苜蓿与根瘤菌共生互作的早期,MtROP9基因能够被根瘤菌侵染诱导表达,在根瘤菌诱导处理不同时间的根系表达水平不同。【结论】克隆了蒺藜苜蓿小G蛋白MtROP9基因。MtROP9基因可能参与了豆科植物与根瘤菌共生互作早期信号的调控。     

不同生态型拟南芥对植物病原真菌的抗病性

拟南芥是研究植物与病原菌互作的模式植物,本试验用17种植物病原真菌测定了11个拟南芥生态型的抗病性。结果表明,在供试的11个拟南芥生态型中,生态型NAHG、SHA、WS-2、WS-0与供试的所有菌株表现为非亲和反应,而生态型COL、C24、ND-1、EST-1、KAS-1、BAY-0、LER与不同病原菌的反应表现不同。     

拟南芥AtSWEET4基因启动子序列、编码蛋白结构 分析及其在病原菌胁迫下表达特性检测

[目的]分析拟南芥糖运输载体蛋白基因(AtSWEET4)启动子序列及其编码蛋白的结构,并检测病原菌胁迫下AtSWEET4基因的表达特性,为研究AtSWEET4蛋白在拟南芥生长发育和生物胁迫中的作用机制提供理论依据.[方法]采用生物信息学方法分析AtSWEET4基因启动子序列及其编码蛋白的结构,并采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)组织染色法检测人工接种菜豆晕疫病菌(Pseudomonas syringae pv.phaseolicola,Psp)NPS3121和丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pathovar tomato,Pst)DC3000后AtSWEET4基因的表达情况.[结果]AtSWEET4蛋白由251个氨基酸组成,分子量为27.8 kD,分子式为C1300H2038N304O346S11,理论等电点(pI)为8.71,脂肪氨基酸指数为118.76,不稳定指数为38.72,平均亲水性指数为0.629,为稳定的亲水蛋白,且含有7个跨膜结构域,无信号肽,为非分泌型蛋白.AtSWEET4蛋白与芥属的亚麻荠和荠菜SWEET4蛋白亲缘关系最近,其次是十字花科的甘蓝和萝卜SWEET4蛋白,与禾本科的二穗短柄草SWEET4蛋白亲缘关系最远.AtSWEET4基因启动子序列中包含核心元件TATA-box、增强子元件CAAT-box、调控植物生长发育相关元件、激素响应相关元件、非生物胁迫响应相关元件和生物胁迫响应相关元件.Psp NPS3121和Pst DC3000均可诱导AtSWEET4基因表达,但表达模式不同:接种Psp NPS3121后6和12 h的AtSWEET4基因表达明显上调,但至接种后24 h又迅速下降;接种Pst DC3000后AtSWEET4基因表达量逐渐增加.[结论]AtSWEET4基因的启动子序列特征及其编码蛋白结构与其参与植物免疫反应密切相关.     

蒺藜苜蓿小G蛋白MtROP5对拟南芥角果及侧器官发育的影响

【目的】利用拟南芥异源表达MtROP基因并研究其功能,为蒺藜苜蓿中MtROP蛋白的功能研究,及进一步探索MtROP蛋白在蒺藜苜蓿和微生物共生互作过程中的作用提供理论依据。【方法】利用同源克隆方法获得了蒺藜苜蓿(Medicagotructula)中与拟南芥AtROP5高度同源的ROP蛋白基因MtROP5,用MtROP5表达载体转化拟南芥并严格筛选转化植株,观察T2代转化植株角果、侧枝分叉、簇毛等器官的表型,并结合启动子-GUS、GFP、RT-PCR等试验手段,研究MtROP5的组织表达特性及其对各种激素的应答反应,通过拟南芥异源表达MtROP5对其功能进行研究。【结果】与对照相比,过表达CA-MtROP5(Constitute activityMtROP5,CA-MtROP5)、MtROP5、GFP-MtROP5的拟南芥植株的角果变短,而角果数目相应增加。过表达CA-MtROP5植株角果的顶端具有较多花粉管,DN-MtROP5(Dominant negativeMtROP5,DN-MtROP5)及MtROP5转化植株的花粉管则较早凋亡。过表达CA-MtROP5、DN-MtROP5植株的侧生器官及花序的极性发生改变,转化CA-MtROP5和MtROP5的转基因拟南芥的簇毛分支数目增加。启动子-GUS及GFP-MtROP5的表达模式表明,该基因在叶脉、花药、下胚轴、气孔及簇毛等部位特异表达。RT-PCR及启动子-GUS表达分析表明,生长激素可诱导该基因的上调表达。【结论】MtROP5在果实及侧器官的极性发育中具有较为重要的作用,可能参与了生长素相关途径的调控。     

拟南芥AtNUDT2启动子的分离及其功能分析

根据已发表的拟南芥基因组序列设计合成1对引物,以拟南芥基因组DNA为模板克隆AtNUDT2上游非编码区,并将其与pBAR－GUS3相连,构建了植物表达载体pNUD12P－GUS,采用以农杆菌GV3101介导的渗透法转化野生型拟南芥,通过除草剂筛选获得了一批抗性纯合子转基因植株。然后对转基因植株（2周幼苗）进行GUS活性的组织化学染色分析,并对3．5～4周的转基因植株叶片进行病原菌诱导表达分析。结果表明,已获得AtNUDT2启动子,且该启动子为组成型表达启动子;病原菌Pst．DC3000及风t．DC3000 AvrB对该启动子没有诱导作用。     

大豆疫霉菌、水杨酸和创伤诱导的拟南芥蛋白质谱的比较研究

 【目的】系统获得抗性（system acquired resistance,SAR）是植物抵抗病原菌侵染的一种复杂机制,本研究旨在鉴定大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）诱导的拟南芥系统获得抗性相关的蛋白质。【方法】利用双向电泳分离创伤、水杨酸（Salicylic acid,SA）和大豆疫霉菌诱导的拟南芥叶片的总蛋白,并对28个差异表达的蛋白点进行了MALDI-TOF质谱鉴定。【结果】这28个蛋白点的表达模式可分为3种类型：13个点的表达随着伤口、SA和 P.sojae的诱导而上调;11个点的表达随着伤口、SA和 P.sojae的诱导而下调;4个点在伤口和P.sojae处理中的表达行为与SA处理相反。这些蛋白质涉及了物质代谢酶、调节因子或分子伴侣、氧化还原酶、防御相关蛋白、蛋白激酶、叶绿体蛋白和功能未知蛋白等复杂的生物学功能。【结论】创伤、SA和P.sojae诱导的拟南芥系统获得抗性涉及的抗性组分有很大的重叠,在信号传导网络上也存在一定的交叉。蛋白质组分析为研究复杂的植物抗性机制提供了可行的技术手段。     

胡杨PePEX11基因参与调节盐胁迫下拟南芥的抗氧化能力

目的长期非生物逆境胁迫下,植物会产生过量活性氧并造成氧化损伤,过氧化物酶体能够通过清除活性氧来调节氧化还原平衡。PEX基因参与过氧化物酶体的生物发生和增殖,PEX11基因的过表达可促进过氧化物酶体增殖,对植物的抗氧化能力的提升具有重要意义。胡杨是研究木本植物中抗逆机制优良材料,本文旨在探究胡杨PEX11基因对非生物胁迫的响应。方法本研究首先以胡杨叶片cDNA为模板克隆获得PEX11基因,命名为PePEX11,并对PePEX11蛋白进行生物信息学分析,其次采用实时荧光定量PCR分析PePEX11在胡杨中的表达模式,同时构建植物表达pCAMBIA1301-35S::PePEX11转化拟南芥,最后检测盐胁迫条件下转PePEX11拟南芥的抗氧化能力。结果PePEX11基因cDNA全长543 bp,编码180个氨基酸,PePEX11蛋白具有多个跨膜结构域,在膜上发挥作用。实时荧光定量PCR分析表明,该基因在胡杨体的成熟叶中表达量最高,幼叶次之,茎中最少;胡杨PePEX11基因受盐胁迫上调表达。功能分析显示,在含有100 mmol/L NaCl的培养基上,转PePEX11基因拟南芥株系的根长均显著长于野生型;对盆土中的移栽后12 d的幼苗150 mmol/L NaCl盐处理2周,转基因株系表现为营养生长良好,耐盐性较强。超表达PePEX11基因能显著提高(P＜0.05)拟南芥多种抗氧化酶的活性。DAB组织染色结果表明,转基因株系叶片中H₂O₂的含量明显少于野生型。结论本研究从胡杨中克隆PePEX11基因,并证明PePEX11能够提高拟南芥在盐胁迫下的抗氧化能力,提升耐盐能力。      

植物病原细菌Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000致病基因比较基因组及原核表达分析

番茄细菌性叶斑病是由Pseudomonas syringae pv. tomato引起的一种世界范围内广泛发生的植物细菌性病害,其模式菌株DC3000已完成全基因组测序。试验通过比较基因组学方法将该模式菌株基因组中的致病基因与其他已完成全基因组测序的植物病原细菌的基因组序列进行比对,得到3个DC3000菌株特有的致病基因PSPTO_4707、PSPTO_4708、PSPTO_4711,并对PSPTO_4711基因进行原核表达和蛋白活力检测,发现其表达的活性蛋白对拟南芥具有很强的毒性。     

过量表达甜菜BvNHX1基因提高拟南芥的耐盐性

Na+/H+逆向转运蛋白调节细胞内的离子平衡,在植物耐盐性起重要的作用。为了研究甜菜液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白BvNHX1基因在植物耐盐中的作用,构建了植物表达载体pROKⅡ-BvNHX1转化拟南芥.在含有卡纳霉素的培养基上筛选转化子,并利用Southern和Northern杂交技术检测,进一步证实BvNHX1基因已整合到拟南芥基因组并能正常转录。选取纯合转基因株系进行耐盐性分析实验表明,过量表达BvN-HX1基因的拟南芥在种子萌发和苗期都提高了植株耐盐性,盐处理下转基因植株的鲜重、干重以及地上部分Na+、K+含量均高于野生型对照。结果表明过量表达BvNHX1基因提高了转基因拟南芥的耐盐能力。     

糖分含量对番茄叶片Pst DC3000抗性的影响及其机理

研究糖代谢对番茄叶片细菌性叶斑病(Pst DC3000)抗性的影响及其可能的生理生化机制,为抗病番茄新品种的选育提供参考.以糖代谢特征不同的早上取样叶片(早8:00取样)和晚上取样叶片(晚6:00取样)为材料,测定离体接种后不同时期(0、24、48 h)上述两种叶片在Pst DC3000抗性、细菌密度、可溶性糖和淀粉含...     

拟南芥T1N6_22在抵抗Pst DC3000侵染过程中的功能分析

【目的】明确拟南芥抗灰霉病基因T1N6_22在抗Pst DC3000过程中的功能,分析T1N6_22影响拟南芥对Pst DC3000的抗性原因。【方法】对t1n6_22突变体和转基因回复突变体（t1n6_22/T1N6_22）接种Pst DC3000,检测其症状;采用间苯胺蓝染色法检测接种突变体中胼胝质的积累情况;测定接种叶片中Pst DC3000的生长量,明确T1N6_22在拟南芥抗Pst DC3000过程中的功能。利用RT-PCR技术,检测SA、JA和ET对T1N6_22表达的影响及T1N6_22对抗病防御相关基因表达的影响;利用quantitative real-time PCR技术,检测Pst DC3000对T1N6_22及抗病相关基因表达的影响,分析T1N6_22影响拟南芥对Pst DC3000的抗性原因。【结果】t1n6_22突变体接种Pst DC3000后表现明显的抗病症状,而回复突变体t1n6_22/T1N6_22和拟南芥野生型表现明显的感病症状。SA处理拟南芥野生型,T1N6_22的表达量明显增强,经JA和ACC处理,该基因的表达量无显著变化。t1n6_22突变体中,PAL、PR4、PPO、SOD和CAT的表达水平均明显高于野生型Col-0和转基因回复植株。接种Pst DC3000后,拟南芥野生型中T1N6_22及抗病相关基因PR1、PR3、PR5和PDF1.2的表达量明显增强。【结论】T1N6_22在拟南芥抗Pst DC3000过程中起负调控作用,T1N6_22的表达受SA诱导,可能主要通过调节植物的次生代谢产物的分泌影响拟南芥对Pst DC3000的抗性。     

番茄糖转运蛋白SlSTP2在防御细菌性叶斑病中的功能

【背景】近年来,我国番茄生产中面临的不良气候环境导致露地和设施栽培中番茄病害日益严重。由丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv. tomato,Pst）所引发的番茄细菌性叶斑病频发,严重影响了番茄的产量、品质。糖是植物体内重要的信号分子与营养物质,在植物遭受病原菌侵染时,糖既可以作为信号参与调控植物抗病性,也可以作为主要碳源为免疫反应提供能量。STP（sugar transport protein）家族是一类糖转运蛋白家族,在植物生长发育过程与病原防御中起着重要作用。【目的】明确番茄中STP家族是否参与调控植株对细菌性叶斑病的抗性。【方法】以番茄CR品种（Solanum lycopersicum cv. Condine Red）为材料,通过接种Pst DC3000,明确STP基因家族对Pst DC3000的响应。构建SlSTP2的突变材料与过表达材料,并进行鉴定、繁种。在野生型和SlSTP2基因突变体、过表达植株上接种Pst DC3000,观察比较叶片发病情况、台盼蓝染色显示的死细胞数量,检测叶片菌落数（colony-forming units,CFU）和光系统II实际光化学效率,明确SlSTP2在植株防御细菌性叶斑病中的作用。为探究SlSTP2防御Pst DC3000的内在分子机制,通过双分子荧光互补（bimolecular fluorescent complimentary,BiFC）试验筛选互作蛋白,构建编码该蛋白的基因突变与过表达材料,并接种Pst DC3000明确其在植株防御细菌性叶斑病中的作用。【结果】在番茄植株上接种Pst DC3000后,SlSTP1和SlSTP2表达上调,选取上调最显著的SlSTP2作为后续研究对象,构建其突变材料与过表达材料。在番茄野生型和Slstp2突变植株、OE:SlSTP2过表达植株上接种Pst DC3000,相比野生型植株,Slstp2植株细菌性叶斑病的发病情况更严重,叶片CFU与台盼蓝染色显示出的死细胞数均更多,光系统II实际光化学效率下降,OE:SlSTP2植株则相反。通过BiFC试验发现,SlSTP2与G蛋白β亚基SlAGB1互作。接种Pst DC3000后,Slagb1突变体发病较野生型重,呈现与Slstp2突变体一致的发病表型;OE:SlAGB1则与OE:SlSTP2植株同样表现出更强的抗性。【结论】SlSTP2受Pst DC3000诱导,并正调控番茄对细菌性叶斑病的抗性,且SlSTP2与正调控因子SlAGB1互作,推测SlSTP2调控番茄细菌性叶斑病抗性与SlAGB1有关。     

番茄SlβCA3在防御丁香假单胞菌番茄致病变种中的功能

【背景】在全球气候变化的背景下,大气CO₂浓度的升高会影响植物病害的发生,进而影响农业生产。β型碳酸酐酶（β- carbonic anhydrase,βCA）是植物CO₂感应和浓缩系统中的重要组成元件,参与拟南芥和烟草的植物免疫过程,但在番茄（Solanum lycopersicum）等园艺作物中的研究较少。【目的】通过探究番茄SlβCA3在抵御植物病害中的作用及机制,为番茄生产中的抗性调控提供科学依据。【方法】以拟南芥AtβCA氨基酸系列为参考序列,在番茄Sol genomics network 数据库中鉴定到4个SlβCA。进一步以野生型（wild-type,WT）番茄‘Ailsa Craig’（AC）为材料接种丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000,Pst DC3000）,利用qRT-PCR技术测定叶片中SlβCA的表达量,筛选出受Pst DC3000诱导表达的基因SlβCA3。在此基础上,以AC为背景,利用农杆菌介导法进行番茄遗传转化,构建SlβCA3稳定过表达植株（OE-SlβCA3）。通过观察OE-SlβCA3植株接种Pst DC3000后的抗性表型,明确SlβCA3在番茄抵御Pst DC3000过程中的作用。为了研究SlβCA3调控植物抗病性的内在机制,比较WT和OE-SlβCA3植株接种Pst DC3000与对照条件下转录组的变化,并利用KEGG数据库对差异基因进行功能分析,推测糖代谢与SlβCA3介导的免疫反应有关。最后,通过测定WT和OE-SlβCA3植株糖代谢及其信号途径相关基因表达量以及葡萄糖、果糖和蔗糖含量,对转录组结果进行验证及分析。【结果】OE-SlβCA3植株对Pst DC3000的抗性增强,接种Pst DC3000后,叶片中的细菌生长量、病斑数以及死细胞积累量明显减少。转录组测序结果显示,正常条件下,OE-SlβCA3植株转录谱没有发生明显变化;接种Pst DC3000后,在WT和OE-SlβCA3植株中检测到2 100个Pst DC3000诱导基因,其中有63.3%的基因在OE-SlβCA3植株中表达量更高。KEGG分析结果显示,依赖于SlβCA3过表达的Pst DC3000诱导基因富集在糖代谢相关路径中,包括淀粉和蔗糖代谢,内质网中的蛋白质加工（糖基化）,氨基糖和核苷酸糖代谢,真核生物中的核糖体生物合成以及光合作用等路径。糖代谢与糖信号密不可分,qRT-PCR及糖含量测定结果显示,接种Pst DC3000后,OE-SlβCA3植株叶片中糖代谢及其信号传导途径相关基因表达量与葡萄糖、果糖和蔗糖的含量较WT更高。【结论】番茄SlβCA3的过表达增强了植株对Pst DC3000的抗性,该过程可能与糖代谢及其信号通路在植物免疫中的作用有关。     

Natural Variation of Pto and Fen Genes and Marker-Assisted Selection for Resistance to Bacterial Speck in Tomato

The resistance in tomato plants to bacterial speck caused by Pseudomonas syringae pv. tomato is triggered by the interactions between the plant resistance protein Pto and the pathogen avirulence proteins AvrPto or AvrPtoB. Fen is a gene encoding closely related functional protein kinases as the Pto gene. To investigate the status of resistance to the pathogen and natural variation of Pto and Fen genes in tomato, 67 lines including 29 growing in China were subject to disease resistance evaluation and fenthion-sensitivity test. Alleles of Pto and Fen were amplified from genomic DNA of 25 tomato lines using polymerase chain reaction (PCR) and sequences were determined by sequencing the PCR products. The results indicated that none of the 29 cultivars/hybrids growing in China were resistant to bacterial speck race 0 strain DC3000. Seven of eight tomato lines resistant to DC3000 were also fenthion-sensitive. Analysis of deduced amino acid sequences identified three novel residue substitutions between Pto and pto, and one new substitution identified between Fen and fen. A PCR-based marker was developed and successfully used to select plants with resistance to DC3000.     

模拟酸雨对番茄光合作用和病害发生的影响及油菜素内酯对其缓解效应

[目的]在全球气候变化大背景下,酸雨沉降日益加剧,严重影响蔬菜等农作物的产量、品质和抗性.油菜素内酯(brassinosteroid,BR)是一类植物体中广泛存在的植物激素,具有广谱调控植物抗性的作用.研究外源油菜素内酯对模拟酸雨环境下蔬菜作物光合作用和病害发生的影响,明确其对酸雨条件下蔬菜危害的缓解效应,对蔬菜作物安...     

番茄SlWRKY23基因的克隆及其抗病性和耐盐性分析

WRKY转录因子是普遍存在于植物界中的一类转录因子,参与了植物在生物和非生物逆境胁迫中的多种应答。前期研究表明,在PstDC3000侵染及盐胁迫下番茄SlWRKY23基因的表达水平提高。为了研究番茄SlWRKY23转录因子对PstDC3000的抗病性及在盐胁迫逆境中的功能,通过农杆菌介导的遗传转化方法获得转SlWRKY23基因植株,并对3个独立的转基因株系（WRKY23\|1、WRKY23\|5和WRKY23\|7）进行了抗逆性分析。结果表明接种PstDC3000后,转基因植株表现明显的抗病表型,抗病防御相关基因SlPR1和SlPR1a1的表达量显著高于野生型;盐胁迫处理后,转基因植株表现出明显的抗盐表型,逆性相关基因SlRD22和SlDREB2A的表达量显著高于野生型。该结果表明SlWRKY23基因在番茄抗PstDC3000和盐胁迫过程中具有正调控作用,通过上调逆性相关基因的表达量增强抗逆性。     

转录因子CsWRKY61对柑橘溃疡病抗性的影响

【背景】柑橘溃疡病(citrus bacterial canker,CBC)是世界柑橘产业上危害最严重的病害之一,由柑橘黄单胞杆菌柑橘亚种(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)引起,在国内外被列为检疫对象。由于柑橘分子病理研究相对滞后,导致可供利用的抗性基因资源相对匮乏。WRKY转录因子参与植物抵御生物和非生物胁迫反应,前期研究发现柑橘WRKY转录因子可能在调控寄主抗病反应中起着重要作用。【目的】通过对超量表达CsWRKY50、CsWRKY61和CsWRKY72转基因晚锦橙(Citrus sinensis)的溃疡病抗性进行评价,明确这些基因在柑橘响应溃疡病菌侵染中的生物学功能和抗病育种价值。进一步利用RNA-Seq解析CsWRKY61调控的信号通路。【方法】利用农杆菌介导法进行柑橘遗传转化,获得超量表达CsWRKY50、CsWRKY61和CsWRKY72的晚锦橙;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析转基因植株中目的基因的表达水平以及拷贝数;以非转基因植株为对照,采用离体针刺接种评价转基因植株对溃疡病的抗性;通过比较超量表达CsWRKY61和野生...