中国美利奴羊IGFBP-5基因外显子区的PCR-SSCP多态性分析

[目的]以IGFBP-5作为候选基因,寻找与绵羊生产性能有关的SNP位点.[方法]利用PCR-SSCP和DNA测序快速筛查SNP位点;分析该位点在中国美利奴羊中的基因型和等位基因分布情况;并通过多重比较分析不同基因型与中国美利奴羊部分生产性能的关联性.[结果与结论]在绵羊IGFBP-5基因外显子1区发现一个新的SNP位点(C136G),并建立了PCR-SSCP的基因分型方法.对212只中国美利奴羊的检测结果显示有CC、CG和GG 3种基因型,基因型频率分别为0.50、0.41和0.09,C等位基因频率为0.70,G等位基因频率为0.30.不同基因型与中国美利奴羊早期生长和羊毛生产性能具有一定的影响:GG基因型个体的初生重、剪毛后体重以及剪毛量显著高于CC基因型(P<0.05);CC基因型个体的毛丛长度明显长于CG基因型个体 (P<0.05).     

绵羊X染色体59578440位点多态分析及其与尾(臀)脂性状相关性研究

[目的]检测绵羊X染色体59578440位点在尾型极端差异的阿勒泰羊、湖羊和中国美利奴细毛羊群体中的多态性,并验证该位点是否可作为一个有效的分子标记应用于低脂绵羊新品种培育.[方法]采用PCR-RFLP方法进行SNP分型,并使用卡方检验的方法验证各基因型在群体中的Hardy-Weinberg平衡性.[结果]扩增出了含绵羊X染色体59578440位点SNP的296 bp片段,经AatⅡ核酸内切酶酶切分型后鉴定出了三种基因型(CC、TT和TC).C/T等位基因的比值显示阿勒泰羊群体中C等位基因属优势等位基因.[结论]X染色体59578440位点SNP可作为阿勒泰羊选育的一个实用性分子标记.     

绵羊Fsp27基因5'-UTR区碱基突变与 尾脂沉积能力的关联性

[目的]明确绵羊脂肪特异蛋白27基因(Fsp27)5'端非编码区(5'-UTR)g.16767527位点和g.16767779-16767780位点突变与其尾脂沉积能力的关联性,为低脂肪绵羊品种选育提供理想的分子标记,提高低脂肪绵羊品种改良选育效率.[方法]以5个不同尾脂沉积能力的绵羊品种为研究对象,包括脂尾型绵羊品种阿勒泰羊,短脂尾型绵羊品种小尾寒羊和湖羊,长瘦尾型绵羊品种中国美利奴细毛羊和萨福克羊,采用PCR-SSCP结合基因测序对绵羊Fsp27基因5'-UTR区碱基突变情况进行检测,并分析相关突变与绵羊尾脂沉积能力的关联性.[结果]绵羊Fsp27基因5'-UTR区g.16767527位点为C/A突变,在所检测的绵羊群体中均存在3种基因型(CC、CA和AA),但在不同尾脂沉积能力绵羊品种群体中的基因型频率存在明显差异:阿勒泰羊群体中以CC基因型为主,基因型频率为0.869;小尾寒羊和湖羊群体中以CA基因型为主,基因型频率分别为0.698和0.628;中国美利奴细毛羊和萨福克羊群体则以AA基因型为主,基因型频率分别为0.616和0.833.g.16767527位点的基因型分布在阿勒泰羊、小尾寒羊和湖羊群体中极显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态(PHWE<0.01),在萨福克羊群体中显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态(PHWE<0.05).g.16767779-16767780位点为双碱基突变,对应为GG/GG、GG/TC和TC/TC基因型;在尾脂沉积能力强的阿勒泰羊、小尾寒羊和湖羊群体中,g.16767779-16767780位点以TC为优势等位基因,对应的等位基因频率分别为0.862、0.954和0.927;在尾脂沉积能力差的中国美利奴细毛羊和萨福克羊群体中则以GG等位基因为主,其等位基因频率分别为0.980和0.983.这2个位点的突变均对绵羊Fsp27基因5'-UTR区二级结构产生明显影响.[结论]绵羊Fsp27基因5'-UTR区g.16767527位点的C/A突变和g.16767779-16767780位点的GG/TC突变与其尾脂沉积能力密切相关,可作为分子标记应用于低脂肪绵羊品种的辅助选育.     

IGFBP-3基因多态性与中国美利奴羊(新疆型)部分毛性状的关联性分析

[目的]寻找IGFBP-3基因在中国美利奴羊(新疆型)中的SNP位点,分析基因的多态性,并分析不同基因型个体在体重、油汗、光泽、毛长度评分、毛弯曲评分、毛弯曲数、毛细度评分、体格大小、剪毛量、平均直径、变异系数等经济性状上的差异显著性,为羊毛性状的候选基因提供理论基础.[方法]通过PCR-SSCP的方法,检测分析基因的多态性,用Excel软件进行数据的初步整理,用SAS8.1软件进行方差分析.[结果]得到两种基因型:从和AB两种基因型,基因型频率分别为0.78和0.22,等位基因A和B的基因频率分别为0.89和0.11,A等位基因为优势等位基因,序列分析表明突变发生在序列片段的81碱基处且为G→C突变(g.81 G＞C).所研究绵羊群体在该位点为Hardy-Weinberg不平衡状态(0.01 ＜P＜0.05).[结论]不同基因型的个体间在毛长性状上差异极显著,从基因型要低于AB基因型(P＜0.01);在毛细度评分上差异显著(0.01＜P＜0.05);在体重、油汗、光泽、弯曲数、体格大小、剪毛置、平均直径和变异系数上差异不显著(P＞0.05).IGFBP-3基因可以作为毛长度选择的一个候选基因.     

绵羊角蛋白中间丝I型基因多态性及其与羊毛性状的关系

采用PCR-RFLP分子标记技术,检测了湖羊、哈萨克羊及中国美利奴多胎羊、"A"型羊和细型、超细型羊5个群体,共314只个体,角蛋白中间丝I型基因第1外显子的遗传多态性,并进行与绵羊羊毛性状相关性分析.结果表明:480 bp PCR产物经MspⅠ消化分析后在5个绵羊群体中均有2个等位基因突变(M占0.910 8,N占0.089 2)和3种基因型(MM占0.839 2,MN占0.141 5,NN占0.019 3),优势等位基因M基因频率比欧洲绵羊和印度绵羊品种高.序列比对发现,第1个MspⅠ酶切位点发生1个碱基C→T突变(g.160 C>T).中国美利奴羊在该位点处于Hardy-Weinberg不平衡状态(P<0.05),其中中国美利奴细型、超细型群体在该位点处于Hardy-Weinberg 极不平衡状态(P<0.01).该位点与羊毛纤维直径不相关.     

榕江小香羊GnRH基因多态性及其与繁殖性状关联性分析

为了探讨Gn RH基因SNP与榕江小香羊繁殖性状关联性,试验以榕江小香羊为研究对象,采用DNA池法及PCR-SSCP技术检测Gn RH基因单核苷酸多态性。结果表明,榕江小香羊Gn RH基因内含子3检测到1个SNP位点T-68G,该位点表现为3种基因型,分别命名为TT、TG和GG。基因型与繁殖性状关联分析显示,榕江小香羊GG基因型个体的产羔数显著高于TT和TG基因型个体(P0.05)。研究结果提示Gn RH基因可能是影响山羊产羔数的主效基因或与主效基因连锁,T-68G位点可望作为提高山羊个体繁殖性能的分子遗传标记。     

PTPN11基因多态性及与细毛羊重要经济性状的关联分析

为分析中国美利奴羊(新疆型)PTPN11基因的多态性及与细毛羊重要经济性状的相关性,寻找可用于中国美利奴羊(新疆型)选育的分子遗传标记。本研究运用PCR-SSCP技术检测PTPN11基因的多态性,用SAS 8.1软件中的最小二乘方法分析PTPN11基因与羊毛性状的关联性。结果表明,PTPN11基因共检测到了AA、AB和BB 3种基因型,其基因型频率分别为0.28、0.52和0.20;A、B等位基因频率分别为0.54和0.46,A等位基因占优势。χ~2检验显示,PTPN11基因处于哈代-温伯格平衡状态(P0.05),PTPN11基因位点的多态信息含量为0.37,PTPN11基因在该群体中处于中等程度的遗传变异。不同基因型的个体对弯曲评分有显著影响(P0.05),对其他性状均无显著影响(P0.05)。     

MTNR1A基因ExonⅡ T/C突变与绵羊季节性繁殖的关联性分析

【目的】分析MTNR1A基因ExonⅡ T/C突变与绵羊季节性繁殖性状的关联性,为深入研究MTNR1A基因在绵羊繁殖活动中的作用机制打下基础。【方法】以季节性繁殖的阿勒泰羊和中国美利奴羊(军垦型)及常年繁殖的湖羊和小尾寒羊为研究对象,采用PCR-SSCP及测序技术检测MTNR1A基因ExonⅡ T/C突变在4个绵羊品种群体中的分布情况,并分析其与绵羊季节性繁殖性状的关联性。【结果】MTNR1A基因ExonⅡ T/C突变致使MTNR1A蛋白的胞内无规卷曲结构域构象发生变化。在4个绵羊品种群体MTNR1A基因ExonⅡ处均可检测到T/C突变,其中阿勒泰羊和小尾寒羊中以TT基因型为主,T等位基因频率分别为C等位基因的3.4和11.2倍;在中国美利奴羊(军垦型)中则以TC基因型为主,TC基因型频率分别为TT和CC基因型的17.6和19.6倍;在湖羊中3种基因型的分布无明显差异。在阿勒泰羊群体中MTNR1A基因ExonⅡ T/C突变位点处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05),而在中国美利奴羊(军垦型)、湖羊和小尾寒羊群体中处于极度不平衡状态(P<0.01)。【结论】在季节性繁殖的阿勒泰羊和中国美利奴羊(军垦型)及常年繁殖的湖羊和小尾寒羊群体MTNR1A基因ExonⅡ处均可检测到T/C突变,但该突变与绵羊的季节性繁殖性状无关联。     

7个绵羊品种PGR基因第4外显子多态性分析

为探索绵羊PGR基因第4外显子的多态性,采用PCR-SSCP技术,对‘德克塞尔羊’、‘无角陶赛特羊’、‘小尾寒羊’、‘蒙古羊’、‘德国美利奴羊’、‘滩羊’和‘藏羊’7个绵羊品种共计414个个体的PGR基因第4外显子进行了遗传多态性检测分析.结果表明:绵羊PGR基因第4外显子存在多态性,发现了AA、BB和AB 3种基因型.不同基因型PCR产物测序结果显示,该多态的产生是由于PGR基因第4外显子扩增序列的第227bp处发生了C→T的碱基突变.基因型和基因频率统计结果表明,‘小尾寒羊’同时存在AA、BB和AB 3种基因型,‘无角陶赛特羊’和‘德国美利奴羊’只存在AA基因型,而其他品种存在AA和AB 2种基因型;在所检测的品种中,AA基因型为优势基因型,A等位基因均为优势等位基因.χ2适合性检验结果表明,7个绵羊品种在该基因座位都处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05).不同基因型在7个绵羊品种间分布的独立性检验结果表明,在该位点,‘无角陶赛特羊’与‘藏羊’之间表现为差异极显著(P<0.01);‘无角陶赛特羊’与‘蒙古羊’和‘滩羊’之间,‘德国美利奴羊’与‘滩羊’和‘藏羊’之间均表现为差异显著(P<0.05);‘无角陶赛特羊’与‘德国美利奴羊’只发现同一种基因型,不存在差异;其他绵羊品种之间均表现为差异不显著(P>0.05).多态信息含量(PIC)分析结果表明,‘无角陶赛特羊’和‘德国美利奴羊’在该位点没有多态,其他属低度多态.     

绵羊KAP6.1基因的遗传多态性分析

KAP6.1基因属于角蛋白家族,羊毛纤维的复杂结构主要由角蛋白组成,这些蛋白对于羊毛纤维的机械性能和主要构造起主要作用。本研究以693只中国美利奴羊(新疆军垦型)为实验材料,采用PCR技术、SSCP技术和克隆测序的方法分析KAP6.1基因的多态性。结果表明:KAP6.1基因存在C159T碱基突变和57 bp的插入/缺失,其中,C159T位点存在3种基因型,分别为AA,BB和AB型,基因型频率依次为0.3694,0.4574,0.1732,等位基因A频率为0.4560,等位基因B频率为0.5440。57 bp的插入/缺失位点存在2种基因型AA型(303 bp)和AB型(303 bp/246 bp),基因型型频率依次为0.9292和0.0707,等位基因A频率为0.9646,等位基因B频率为0.0354,实验证明KAP6.1基因能够作为优质细毛羊毛性状的候选基因进行研究。     

中国美利奴羊羊毛弯曲相关microRNA的筛选

[目的]研究miRNA在不同羊毛弯曲中国美利奴羊皮肤组织中的表达差异及其可能参与的调控通路,筛选出与中国美利奴羊羊毛弯曲相关的miRNA,为进一步探究细毛羊羊毛弯曲性状的调控机理提供理论依据.[方法]运用高通量测序技术对羊毛弯曲频率有极端差异表型值(大弯曲组与小弯曲组)细毛羊个体皮肤的miRNA组进行测序与比较分析.[...     

绵羊miR-1基因前体序列的多态性分析

为了检测不同产肉性能的绵羊群体中miR-1基因前体序列的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP),并与绵羊骨骼肌发育进行相关性分析,采用不对称聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术对萨福克羊和湖羊2种产肉性能不同绵羊的miR-1基因前体序列进行SNP检测,并预测该SNP位点对miR-1前体序列二级结构稳定性所造成的影响。结果表明,在绵羊miR-1基因前体成熟序列的下游115 bp处检测到1个A→G突变,并且该SNP位点与绵羊的产肉性能有一定的相关性;由国外引进的优良肉羊品种萨福克羊,GG基因型为其优势基因型,G等位基因频率为0. 76;通过miR-1基因前体序列二级结构预测发现,该SNP位点能够使其发生变化,使ΔG降低1. 5 kJ/mol。综上所述,绵羊miR-1基因前体序列的SNP位点可能对miR-1前体的加工成熟产生重要影响,最终影响绵羊的产肉性能。     

绵羊肌肉生长抑制素基因外显子Ⅰ单核苷酸多态性分析

利用PCR-SSCP和DNA测序法,检测了德国肉用美利奴、特克塞尔、多浪羊和陶塞特等4个绵羊品种肌肉生长抑制素基因外显子Ⅰ的单核苷酸多态性。研究结果表明:在德国肉用美利奴肌肉生长抑制素基因外显子Ⅰ第 84位(相对翻译起始位点ATG)发现G→A的突变,但仅存在两种基因型,即GG和GA,基因型频率分别为0.6944和0.3056。该突变位点编码的氨基酸序列不发生改变,在其余样品均未检测到多态。     

中国美利奴羊TLR4基因多态性的PCR-SSCP鉴定

为了研究中国美利奴羊TOLL样受体(TLR4)基因第3外显子上的单核苷酸多态性(SNPS)和单氨基酸多态性(SAPS)。利用生物信息学方法对NCBI上公布的有关绵羊的TLR4序列进行下载并用Seq Man对下载的绵羊TLR4基因外显子进行多态性比对分析,然后采用PCR-SSCP并结合测序的方法对119只中国美利奴羊TLR4基因的外显子3的扩增片段进行分析。通过分析发现,在中国美利奴羊第3外显子1 180 bp处有1个突变位点,由G突变成T,氨基酸由天冬氨酸(D)变成酪氨酸(Y),即该位点为有义突变。在1 537 bp处也有1个突变位点,即由G突变成了A,氨基酸由丙氨酸(A)变成苏氨酸(T),在TLR4第3外显子的其他位点并没有SNPS位点,说明中国美利奴羊TLR4基因上的第3外显子区域有2个多态位点。     

威宁黄牛SOCS4基因多态性及其与生长性状的关联分析

[目的]了解威宁黄牛SOCS4基因多态性及其与生长性状的关联性,为深入研究SOCS4基因遗传效应及其功能和调控机制奠定基础.[方法]随机抽取106头威宁黄牛,采集血样后提取总DNA,利用PCR-SSCP检测SNP位点及基因型,并分析SOCS4基因SNP位点与不同个体生长性状的相关性.[结果]在SOCS4基因中共发现两个SNP位点,分别是第1内含子的T+435C和3+UTR的G+13700C,均有3种基因型.在威宁黄牛群体中,T+435C位点是以T为优势等位基因,G+13700C位点则以C为优势等位基因,但只有T+435C位点与威宁黄牛的生长性状存在显著关联(P＜0.05,下同),且在公牛和母牛中呈不同关联性特征.在公牛中,T+435C位点与胸围显著相关,TT型个体胸围均值显著高于CC型个体;而在母牛中,T+435C位点与管围、胸深、腰高和坐骨端宽等生长性状显著关联,且均以CC型个体值高于其他基因型个体.[结论]威宁黄牛SOCS4基因多态性不丰富,且只有内含子区的T+435C位点与其生长性状存在明显关联,即T+435C位点可作为威宁黄牛生长性能的辅助选择分子标记.     

绵羊Izumo1基因多态性及其与产羔数关联分析

为研究Izumo1基因多态性及与产羔数关系,本研究利用PCR和直接测序法对小尾寒羊和苏尼特羊的Izumo1基因DNA序列进行扩增、测序和BLAST分析,并和本课题组前期绵羊重测序数据进行比对,筛选出Izumo1基因SNP位点。同时,采用Sequenom MassARRAY~?技术进行基因分型,并对其SNP位点的基因型和等位基因频率在各群体中的分布进行研究。结果表明:小尾寒羊Izumo1基因DNA全长序列3 385 bp,苏尼特羊Izumo1基因DNA全长序列3 382 bp;筛选出8个Izumo1基因SNP位点,经过初步筛选,将在小尾寒羊、苏尼特羊、滩羊、萨福克羊、杜泊羊、草原藏羊这6个绵羊品种中位点分布没有差异的SNP位点排除,最终筛选获得的g.54412135AG和g.54412107CA 2个位点。Izumo1基因g.54412135AG位点在多羔和单羔绵羊品种中存在GG、GA和AA 3种基因型,G基因为优势等位基因;g.54412107CA在多羔品种中存在CC和CA 2种基因型,而在单羔品种中存在CC、CA和AA 3种基因型,C基因为优势等位基因,其基因型频率和基因频率在单、多羔绵羊群体间的分布差异均极显著(P0.01);群体遗传学分析得出g.54412135AG多态位点在6个品种中的多态信息含量(PIC)都属于低度多态(PIC0.25);g.54412107CA多态位点在杜泊羊中属于中度多态(0.25PIC0.5),在其他5个品种中都属于低度多态(PIC0.25),然而,关联分析发现Izumo1基因g.54412135AG和g.54412107CA位点的不同基因型与小尾寒羊不同胎次产羔数之间不存在显著关联(P0.05)。     

X染色体60149273位点在脂尾（臀）和瘦尾绵羊品种中的多态性及其基因定位

【目的】研究绵羊X染色体60149273位点在不同沉脂尾型绵羊品种中的多态性,为解析绵羊尾脂沉积性状的遗传机制提供基础数据。【方法】首先,采用PCR-SSCP分型方法检测X染色体60149273位点在不同脂尾类型绵羊品种的多态性,并借助PCR产物直接测序的方法确认各基因型相应序列,利用卡方检验的方法检测各基因型分布在不同品种中的平衡性。其次,利用生物信息方法将该SNP定位与绵羊androgen receptor（AR）,并使用电子克隆的方法克隆出绵羊AR全长编码序列。同时以阿勒泰羊臀部脂肪RNA为材料,采用RT-PCR的方克隆绵羊AR第3—8外显子序列,利用生物信息学方法分析序列同源性以及序列的物种进化保守性。【结果】①PCR-SSCP结果显示,在脂尾（臀）型绵羊品种阿勒泰羊和湖羊群体中X染色体60149273位点未检出多态性,GG基因型占100%;而瘦尾（臀）型绵羊品种中国美利奴和萨福克羊群体中则出现了多态性,GG基因型分别下降至10%和21%。②利用比较基因组学首次电子克隆出该SNP所属基因AR的全长编码区,并从阿勒泰羊臀脂mRNA中成功扩增羊源AR第3—8外显子片段,测序结果与电子克隆序列完全一致。③物种同源性比对进一步显示,AR在哺乳类动物中高度保守,哺乳动物各物种间同源性高达90%;进化树分析结果显示,牛、绵羊、海豚和猪等哺乳动物亲缘较近。【结论】首次发现绵羊AR第3内含子一处SNP在脂尾（臀）与瘦尾绵羊品种中存在较大差异,该SNP将可作为一个分子标记运用于低脂绵羊新品种的培育,同时该SNP所属AR也可作为一个重要候选功能基因应用于绵羊尾（臀）脂沉积分子机制的相关研究。     

中国美利奴羊(新疆型)羊毛长度与产毛量的全基因组关联分析

【目的】对中国美利奴羊(新疆型)羊毛长度和产毛量性状进行全基因组关联分析（GWAS）,挖掘影响这2个性状的遗传标记,揭示这些性状产生的遗传机制。【方法】以366只中国美利奴羊(新疆型)为对象,对其周岁羊（16月龄）和成年羊（30月龄）个体的羊毛长度和产毛量(污毛质量)性状进行描述性统计。提取试验羊DNA,采用Illumina OvineSNP50 BeadChip中密度芯片(包括54 241个SNP位点),对周岁羊和成年羊的羊毛长度和产毛量进行GWAS。基于single-locus回归方法、permutation方法、Ovisaries Annotation Release 100和绵羊数量性状位点数据库（Sheep QTLdb）进行统计分析、基因注释和SNP验证。【结果】试验羊群体羊毛性状的平均值均在正常范围内,最大值和最小值均符合正态分析要求,可进行GWAS。从试验羊群体中共筛选出44 798个SNP,每条染色体上的SNP数量为672～5 150个,SNP间的距离为49.97～65.59 kb。挖掘出21个与羊毛性状相关的SNP,其中s65179.1、OAR25_10510703.1、OAR3_112640501.1和s56106.1 4个SNP分别位于KIF16B、RYR2、ANAPC1和DPP6基因内,并且这4个SNP位置均位于基因的编码区;其他SNP注释在FIBIN、HSD17B11、PIAS1基因附近。QTL分析结果表明,OAR25_10510703.1定位到2个与纤维长度相关的QTL和1个与污毛质量相关的QTL,OAR7_15117952.1定位到1个与纤维长度相关的QTL和1个与初级纤维直径变异系数相关的QTL,可见这2个位点对中国美利奴羊（新疆型）羊毛长度和产毛量具有显著性作用。【结论】在周岁和成年中国美利奴羊（新疆型）鉴定出了21个与羊毛长度与产毛量显著相关的SNP,揭示了中国美利奴羊纤维长度和产毛量性状的遗传结构。     

中国美利奴(新疆型)羊毛弯曲频率性状的全基因组关联分析

[目的]鉴别影响细羊毛弯曲频率性状的基因组区域.[方法]利用OvineSNP50 BeadChip芯片对235只中国美利奴(新疆型)个体基因分型,基于Case/Control设计对弯曲频率性状进行全基因组关联分析.[结果]通过基因组水平的Permutations校正,检测到18个与细羊毛弯曲频率性状显著关联的SNPs.5个SNPs定位于已知基因内(内含子),13个SNPs分别邻近已知基因(距离1.8 kb～841.39 kb).多数候选基因/SNP均为首次检测到与羊毛性状相关,其中基因PML、LAMC2、PDGF、CDC42SE2及DiRas3参与了人、小鼠毛发生长、发育相关的生物学过程.[结论]鉴别出了与羊毛弯曲频率性状关联的新的候选基因/SNP,对这些目标区域的进一步研究有助于揭示细毛羊羊毛弯曲性状的遗传机理.     

贵州黑山羊FSHR基因与繁殖性状相关性研究

本研究通过探讨FSHR基因SNP与贵州黑山羊繁殖性状关联性。试验采用PCR-SSCP技术检测FSHR基因单核苷酸多态性。结果发现,贵州黑山羊FSHR基因外显子1检测到1个SNP位点C1412A。基因型与繁殖性状关联分析显示,贵州黑山羊FSHR基因AA基因型个体产羔数显著高于与AC和CC基因型个体(P0.05)。研究结果提示:FSHR基因可能是影响山羊产羔数的主效基因。