细胞冻存保护剂二甲基亚砜的细胞毒作用

二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）是目前最好的细胞冻存保护剂，但也是一种以细胞毒性很大的化学试验剂。本研究结果表明，培养液中ＤＭＳＯ浓度为１０％时，细胞生长抑制率近１００％；１‰浓度时抑制率为３５％，即使是０．０４‰的浓度，ＤＭＳＯ对细胞的生长也有不利的影响。我们认为，培养液中残存的ＤＭＳＯ是冻存细胞复苏后出现的细胞毒现象的主要原因。因此我们提出，冻存细胞时操作过程要迅速；细胞融化务必洗涤，尽量去除ＤＭＳＯ，     

番鸭胚成纤维细胞的原代分离与培养研究

为建立番鸭胚成纤维细胞(MDEF)的体外培养、传代和冻存技术,选用11胚龄番鸭胚,2.5g/L胰蛋白酶消化,原代MDEF于含100 mL/L血清的DMED培养液中培养;研究热、冷两种消化方法对MDEF消化密度及活率的影响,探讨不同血清浓度对MDEF生长、冻存活性的影响,以及离心对MDEF传代和复苏时细胞活率的影响。结果显示,胰酶消化法获得了MDEF,细胞贴壁紧密,生长良好;冷消化得到的原代MDEF密度和活率均高于热消化;血清浓度在20mL/L~100mL/L范围内,浓度越高MDEF生长速度越快;血清浓度显著影响MDEF复苏的活率;MDEF冻存液中DMSO∶血清∶培养液比例为1∶2∶7冻存效果良好;在MDEF传代和复苏过程中去除离心操作,不仅可简化操作,细胞活率也有一定提高。本研究建立了MDEF的原代分离和培养方法,为适用于番鸭相关研究的体外细胞培养体系奠定基础。     

冷冻保护剂和胎牛血清对牛成纤维细胞冷冻效果的影响

以甘油与DMSO为冷冻保护剂,添加5%-20%胎牛血清的DMEM为基础冻存液,对鲁西黄牛皮肤成纤维细胞进行冷冻保存,结果表明:①同浓度DMSO为冷冻保护剂效果优于同浓度的甘油(P<0.05),但添加50%血清时并不明显(P>0.05),可能与较高血清浓度有关,血清对冻存细胞的影响高于冷冻保护剂的作用。②血清浓度一定时,DMSO和甘油浓度在10%-15%时,冻存效果较好。③当甘油与DMSO浓度一定时,血清浓度越高冷冻保存效果越好。④甘油与DMSO浓度一定时(DMSO浓度5%除外),添加10%和20%血清效果无差异(P>0.05)。因此,在实际应用中,考虑成本等因素,血清浓度达到10%时就已经能达到一般试验要求。     

不同冻存液对奶牛乳腺上皮细胞冻存质量的影响

试验旨在探究奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)最佳的冻存液以改善乳腺上皮细胞的冻存质量.BMECs传至第5代后分别加入以下10种不同配方的冻存液.A组:85％ DMEM+10％胎牛血清+5％ DMSO;B组:80％ DMEM+ 10％胎牛血清+10％ DMSO;C组:75％ DMEM+10％胎牛血清+15％ DMSO;D组:70％ DMEM+10％胎牛血清+20％ DMSO;E组:85％ DMEM+5％胎牛血清+10％ DMSO;F组:75％ DMEM+15％胎牛血清+10％ DMSO;G组:70％DMEM+20％胎牛血清+10％DMSO;H组:80％DMEM+10％胎牛血清+10％甘油;I组:70％ DMEM+10％胎牛血清+20％甘油;J组:60％ DMEM+10％胎牛血清+30％甘油,冻存前统一调整细胞密度到1×106个/mL冻存.分别对复苏后的细胞进行台盼蓝染色计算存活率和PI/Hoechst 33258双染计算凋亡率.结果表明,BMECs经不同冻存剂冻存复苏后,细胞活力、形态学及凋亡率表现有所不同,其中B组和G组的活力和24h贴壁率较其他组高,二者的凋亡率较低,二者之间差异无显著性(P＞0.05);传代后B组细胞的生长状况最好.     

7日龄小鼠生精上皮单细胞冷冻保存

在DMEM中添加10％小牛血清（NBS），并分别添加不同浓度的抗冻剂二甲基亚砚（DMSO）、丙二醇（PG）、乙二醇（EG）及甘油（G），对7日龄小鼠生精上皮单细胞进行冷冻保存，复苏后台齿蓝染色测定细胞复苏率。结果：当冻存液中DMSO分别为5％、10％、15％、20％时，细胞复苏率分别为77．1％、88．2％、86．5％、73．5％、65．5％，其中10％和15％DMSO组细胞复苏率最高，与其作各组间均差异极显著（P＜0．01）。当冻存液中PG分别为5％、10％、15％、20％、25％时，细胞复苏率分别为66．2％、84．3％、72．1％、69．9％、47．5％，其中10％PG组细胞复苏率最高，与其余各组间均差异极显著（P＜0．01）。当冻存液中EG分别为5％、10％、15％、20％时，细胞复苏率分别为64．9％、81．6％、60．9％、44．7％，其中10％EG组细胞复苏率最高，与其余各组间均差异极显著（P＜0．01）。当冻存液中G分别为5％、10％、20％、25％时，细胞腹苏率均低于10％。10％DMSO组细胞复苏率与10％PG组和10％EG组之间均差异显著（P＜0．05）或极显著（P＜0．01）。结果表明，10％DMSO、10％PG及10％EG均适宜冷冻保存小鼠精原细胞，以及10％DMSO的冻存效果最好，而则不适宜冷冻保存。在含10％DMSO的冻存液中，二步慢速冷冻，液氮储存，37C水浴复苏小鼠精原细胞，是一种具有较高细胞复苏率的冷冻保存方法。     

成年小鼠雄性生殖细胞的冷冻保存

在含10％小牛血清（NBS）的DMEM培养基中，分别各添加5％，10％，15％，20％和25％的二甲基亚砜（DMSO）,丙二醇（PG），乙二醇（EG）和甘油（G），对成年小鼠睾丸生殖细胞冷冻保存；复苏后台盼蓝染色测定细胞复苏率。结果显示，5％－25％DMSO冻存液组的细胞复苏率分别为88.5%,88.0%,65.6%及51.3%;5%-25%PG冻存液组的细胞复苏率分别为87.2%,86.4%,79.0%,73.4%及40.1%.;5%-25%EG冻存液组的细胞复苏率分别为6.6%,80.9%,60.8%,51.3%及30.0%;5%-25%G冻存液组的细胞复苏率分别为86．5％，86．3％，65．3％，36．0％及31．4％。其中各抗冻剂5％和10％组的细胞复苏率最高，与15％组相比均存在显著或极显著差异。4种抗冻剂的最高细胞复苏率之间无显著差异。DMSO，PG，EG和G分别冷冻保存成年小鼠睾丸生殖细胞对的最小损失率分别为4．8％，6．1％，6．7％，6．8％。结果表明，采用慢速冷冻时，DMSO，PG，EG及G均适宜用作成年小鼠睾丸生殖细胞的抗冷冻剂，最佳使用含量均为5％－10％。成年小鼠睾丸生殖细胞分别在含5％－10％的DMSO，PG，EG和G的DMEM（含10％NBS）冻存液中，2步慢速降温，液氮储存，37℃水浴复苏，是一种具有较高复苏率的冷冻保存方法。     

鸡肝癌细胞系LMH培养特性的研究

为探索鸡肝癌细胞系LMH的生长特性,对LMH细胞复苏、冻存、传代、培养温度、培养基种类和血清含量等进行了研究.结果显示:LMH细胞系培养最佳温度为37℃,培养基为高糖DMEM或F12培养基,培养液中最佳血清含量含10％胎牛血清,细胞传代的最佳接种浓度为3.0×105个/mL,细胞连续传代后细胞形态和培养特性未发生变化....     

甘油、DMSO细胞冻存液冻存效果的比较实验研究

目的采用两种不同的细胞冻存液对Vero细胞的冻存效果进行研究。方法本实验主要研究甘油和二甲基亚砜这两种细胞冷冻保护剂,以及他们与血清、基础培养基的不同配比与细胞冻存效果之间的关系。结果发现不同的细胞冻存液在一定的所占比例内与细胞复苏后的成活率有一定的相关性,即在一定比例的冷冻剂保护下,细胞冻存的效果才会达到最佳。结论保护剂,无论是DMSO,还是甘油,其比例只有在10%-15%之间,细胞复苏后的成活率才达到最佳状态,即有利于细胞的冻存。且冷冻解冻后的细胞呈现正常的分裂增殖生长模式。     

不同冻存保护剂对绵羊前体脂肪细胞冻存效果的影响

<正>【目的】探讨绵羊前体脂肪细胞冷冻保存的最佳冻存保护剂种类和浓度。【方法】在含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液中分别添加不同浓度的DMSO、EG、PG、G和PVP作为冻存液,对原代培养的绵羊前体脂肪细胞进行冷冻保存后,检测复苏细胞存活率、细胞增殖能力、细胞中脂肪沉积量,测量GPDH活性,并用实时荧光定量PCR检测PPARγ和LPL mRNA的表达水平,最后对复苏细胞进行染色体核型分析。【结果】各种冻存保护液中,10%DMSO和5%DMSO+5%PVP     

鸡睾丸生精上皮细胞冷冻保存研究

以广西土鸡为试验材料，利用两步酶解法从出壳后20～30日龄公鸡睾丸中获取生精上皮细胞，以含20％胎牛血清的DMEM为基础培养液，比较了不同浓度DMSO和蔗糖对生精上皮细胞冷冻保存效果的影响。结果表明：DMSO的最佳浓度为10％，添加蔗糖对冻存有害。以10％DMSO为防冻剂，复苏后生精上皮细胞原代混合培养可形成典型的精原干细胞集落，集落呈碱性磷酸酶（AKP）阳性，说明以10％DMSO为防冻剂的冷冻体系适合鸡睾丸生精上皮细胞的冷冻保存。     

小白鼠乳腺上皮细胞的体外培养及形态学变化

以无菌手术法取健康妊娠期、泌乳期昆明小白鼠的乳腺组织，用胰蛋白酶、胶原酶1分段消化法获得小鼠乳腺细胞。生长培养液为DMEM／F12，含10％胎牛血清，添加胰岛素（5μg／mL）、EGF（5ng／mL）、氢化可的松（1μg／mL）、青霉素（200IU／mL）及链霉素（0．1mg／mL）。从乳腺组织中获得的细胞直接放入-80℃冰箱中进行冻存，冻存液为DMEM／F12，含20％胎牛血清、10％DMSO。用倒置显微镜观察细胞形态，发现乳腺组织消化后即可获得呈圆饼状的上皮细胞；培养过程中，乳腺上皮细胞的形态以鹅卵石型和多角型为主，增殖可形成乳头状结构，称之为乳球体，大量增殖后形成圆顶型结构。细胞核呈圆形或椭圆形，在传代过程中，乳腺上皮细胞可形成岛屿状的闭合型细胞群，边界清晰，细胞之间结合紧密，细胞间呈拉网结构。结果表明：获得典型上皮细胞形态的小鼠乳腺细胞原代培养物，从泌乳期小鼠获得的乳腺上皮细胞传至第1代时无法长成单层；而从妊娠期小鼠获得的乳腺上皮细胞传至第3代时才无法长成单层；冻存后复苏的乳腺细胞在培养过程中仍然具有典型的上皮细胞形态，并且增殖旺盛。     

贵德黑裘皮羊耳成纤维细胞系的建立和生物学特性的研究

以贵德黑裘皮羊耳缘组织为材料，采用组织块贴壁培养法和细胞冷冻技术成功构建了成纤维细胞系，并对培养细胞进行了形态学、生长动力学观察、细胞活力测定、核型分析和微生物检测。结果表明：细胞群体倍增时间（PDT）约为36h，冻存前细胞活力为96．2％，以DMEM／F-12＋20％FBS中添加10％DMSO冻存成纤维细胞，解冻后细胞活力为93．6％，24h后的贴壁率为85％。在传代10次之前，细胞染色体中二倍体（2n=54）占主体，约为82％～90％，细菌、真菌、病毒、支原体检测为阴性。该细胞系的建立，使贵德黑裘皮羊这一国家重要种质资源在细胞水平上保存下来，也为体细胞克隆等研究提供了理想的生物材料。     

四种抗冻剂20℃时对小鼠生精上皮单细胞存活率的影响

将小鼠生精上皮单细胞置20℃含不同抗冻剂的冻存液中一定时间后，台盼蓝染色测定细胞存活率，以筛选冷冻保存小鼠生精上皮细胞的侯选抗冻剂及使用浓度。结果，20℃30min，10％浓度的二甲基亚砜（DMSO）、丙二醇（PG）及乙二醇（EG）对7日龄小鼠生精上皮单细胞存活率均无显著影响，而10％甘油（G）则使细胞存活率显著下降；20℃ 30min,10%浓度的DMSO、PG、EG及G对成年小鼠生精上皮单细胞存活率均无显著影响；20℃ 5min,25%浓度的DMSO、PG、EG及G均使7日龄及成年小鼠生精上皮单细胞存活率显著下降。实验结果表明，10％DMSO、PG及EG可作为7日龄小鼠生殖细胞慢速冷冻保存时的侯选抗冻剂，10％DMSO、PG、EG及G可作为成年小鼠生殖细胞慢速冷冻保存时的侯选抗冻剂；在高浓度抗冻剂超速冷冻保存小鼠生殖细胞时，平衡时间应短于5min，或在4℃进行。     

成年小鼠生精小管及睾丸的冷冻保存

采用含不同浓度抗冻剂二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇(EG)、丙二醇(PG)及丙三醇(G)的DMEM培养基作为冻存液,对成年小鼠生精小管及完整睾丸进行慢速冷冻,液氮保存,37 ℃水浴复苏,并测定细胞复苏率。结果表明,成年小鼠生精小管在50 mL/L、100 mL/L 及150 mL/L DMSO冻存液中的细胞复苏率分别为92.6%、93.4%及69.4%,在50 mL/L、100 mL/L及150 mL/L PG 冻存液中的细胞复苏率分别为94.2%,93.3%及66. 9%,在50 mL/L、100 mL/L 及150mL/L EG 冻存液中的细胞复苏率分别为87.2%、91. 0%及62. 6%,在50 mL/L、100mL/L及150 mL/L G冻存液中的细胞复苏率分别为90.0%、90.5%及67.1%。各种抗冻剂的最高细胞复苏率之间差异不显著(P> 0. 05 )。成鼠完整睾丸在含100 mL/LDMSO、PG、EG或G的冻存液中的细胞复苏率分别为56.0%、50.0%、50.2%及50.2%。结果显示,DMSO、PG、EG 及G 均适宜用作成年小鼠生精小管的抗冻剂,最佳使用浓度均为50 mL/L~100 mL/L。完整睾丸冷冻后的细胞复苏率低于60%,仍需进一步研究。     

犊牛前脂肪细胞的传代培养

利用新生犊牛大网膜的脂肪组织原代培养脂肪细胞,待细胞贴满培养平皿底部90%时,进行细胞传代。观察细胞的形态;绘制细胞生长曲线、脂肪含量变化曲线;对细胞进行冻存与复苏,并计算复苏后的存活率。结果显示,细胞传代培养后,仍保持脂肪细胞蓄积脂肪的特性,细胞生长曲线与原代脂肪细胞的生长曲线依然一致,细胞冻存复苏后保持87%的存活率。     

猪成纤维细胞冻存方法的研究

试验以猪的成纤维细胞为研究对象，认为在-70℃情况下冻存至少7d不会影响其存活率(可达80％以上)，且生长形态正常。同时利用血清饥饿法使成纤维细胞周期同步化，在-70℃冻存2d、4d和7d，细胞存涪率可达92．3％、87．2％和83．6％，甚至在该务件下冻存15d，细胞也能恢复正常的生长。     

恩诺沙星联合用药对MRC-5细胞生长抑制的研究

本研究旨在评价恩诺沙星分别与3种抗菌药（环丙沙星、氟苯尼考和磺胺二甲嘧啶）的联合毒性。选用MRC-5细胞作为细胞模型模拟抗菌药的混合污染对肺细胞的损害，设置多个浓度梯度和混合比例，采用CCK-8方法检测4种抗菌药单药对细胞生长的抑制率及恩诺沙星分别与3种抗菌药混合后对细胞生长的抑制率，而后使用Chou-Talalay方法拟合中值效应曲线，计算出联合指数（combination index，CI）。结果显示，在检测浓度范围内，4种单药对MCR-5细胞的生长抑制率随药物浓度增加均呈阶梯状上升，其中氟苯尼考对MCR-5细胞的生长抑制率较低（<4.5%）。3种二元药物组合的混合毒性均表现出了浓度依赖性和混合比例的依赖性，联合使用恩诺沙星与环丙沙星在高、中剂量组下对MRC-5细胞表现协同毒性（CI<1），极低剂量组下表现为抑制毒性（CI>1）；联合使用恩诺沙星与氟苯尼考对MRC-5细胞的毒性主要是相互抑制的（CI>1）；联合使用恩诺沙星与磺胺二甲嘧啶对MRC-5细胞的毒性可能表现相互促进（CI<1），也可能表现相互抑制（CI>1），具体表现与给药剂量和浓度比值有关。本研究表明，在抗菌药的毒性评价中，评估抗菌药的联合毒性是有必要的，使用Chou-Talalay方法可快速高效地完成细胞水平上对抗菌药联合毒性的评估。     

小鼠肾细胞冻存过程中甘油浓度的优化

目的:探讨在冻存小鼠肾细胞过程中,通过优化冷冻保护剂中甘油浓度的加入量,以达到小鼠肾细胞的最佳冻存效果。方法:将小鼠肾细胞制备成单细胞悬液,然后加入不同浓度的冷冻保护剂甘油,冻存细胞,比较细胞冻存效果,计算细胞成活率。四个组的甘油加入量分别为5%、10%、15%、20%。结果:在小鼠肾细胞冻存过程中,当冷冻保护剂中甘油的浓度达到10%时,冻存效果最佳,细胞成活率达到89.57%。     

栝楼根提取物抗肿瘤作用初探

为探究栝楼根提取物的药理作用,通过体外细胞毒性试验和动物试验观察栝楼根提取物对肿瘤的影响。细胞毒性试验表明栝楼根提取物在0．5mg／mL以上浓度时明显抑制小鼠骨髓瘤细胞（SP2／0）的生长;动物试验表明栝楼根提取物在0．1mg／mL注射剂量时肿瘤抑制效果最佳,抑制率可达40．9％。     

几种冷冻保存伊氏锥虫方法的比较试验研究

本文用液氮冷冻法比较了不同保护剂和不同冻存途径对伊氏锥虫云南株进行保存后，虫株在存活率、活力、感染力、致病力和药敏性方面的变化。我们发现在以二甲基亚砜为主要保存剂时，二甲基亚砜浓度低对保存效果不利，而浓度为５％时，保存７１２天后，虫体成活率仍达９６％；当以甘油为保存剂时，若其浓度低虫体成活率低，当浓度为２０％时，保存３６５天后虫体存活率有９１．４％。在不同冻存途径试验中发现，先在液氮气相中距液氮面４ｃｍ以上处放置１ｈ，再降到距液氮面４ｃｍ处放置１ｈ，然后进入液氮效果最好。用此种保存方法和冻存途径后，虫体活力强，其感染力、致病性和药敏性都没有发生明显变化。