钠钾泵β2亚基C末端编码区酵母双杂交载体的构建与表达

以人胎儿脑cDNA文库为模板克隆了钠钾泵β2亚基C末端编码区(N KAβ2ct),构建了表达载体pGBKT 7-NKAβ2ct,并对其进行了表达,对表达产物进行了检测。结果表明,N KAβ2ct长690 bp,pGBKT 7-NKAβ2ct酵母表达载体构建成功,在酵母中表达良好,可用于后续的酵母双杂交文库筛选工作。     

IrrE基因酵母双杂交体系诱饵载体的构建

耐辐射奇球菌中的IrrE基因能增强转IrrE基因油菜的盐胁迫耐受性。为了进一步筛选植物体内与IrrE相互作用蛋白,从而加深对盐胁迫耐受性分子调控网络的认识,根据IrrE基因的开放阅读框设计引物,从PBI121-IrrE上扩增该基因的编码区,将其克隆到酵母表达载体pGBKT7中,获得IrrE的酵母表达载体pGBKT7-IrrE,测序结果表明:pGBKT7-IrrE载体构建成功,可用于后续的酵母双杂交文库的筛选工作。     

酵母穿梭表达质粒pGBKT7-hCK2α＇的构建

目的：用人蛋白激酶CK2α’(hCK2α’)cDNA片段构建酵母双杂交体系中“诱饵”载体。方法；通过PCR扩增已构建成功的重组质粒pThCKA’获得人CK2α’亚基编码区cDNA，将PstⅠ／NdeⅠ双酶切的PCR产物连接到同样酶切的“诱饵”载体pGBKT7，转化感受态细胞DH5α获得转化子．琼脂糖凝胶电泳初步筛选转化子，将阳性克隆进行限制性内切酶酶切与DNA测序的方法鉴定。将DNA测序验证的pGBKT7-hCK2α’转染感受态酵母株AH109．Westernblot签定hCK2α’蛋白表达．检测表达产物对报道基因的激活作用及对酵母株AH109的毒性。结果：限制性酶切结果表明，插入片段和重组质粒的大小与理论值推测值相符。重组质粒pGBKT7-hCK2α’转染的酵母株AH109中能够表达hCK2α’蛋白，pGBKT7-hCK2α’无自主激活报道基因的能力及对酵母的生长无毒性。结论：pGBKT7-hCK2α’酵母双杂“诱饵”载体构建获得成功，可应用于酵母双杂交体系。     

水稻SGR酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

[目的]揭示SGR基因的作用机理。[方法]构建水稻SGR基因在酵母双杂交体系中的诱饵载体,并对其表达进行鉴定,将目的基因SGR与诱饵质粒载体pGBKT7通过双酶切定向重组构建诱饵质粒pGBKT7-SGR,将pGBKT7-SGR转入酵母菌株Y187中,利用Western印迹法检测其在酵母中的表达,通过缺陷性培养基培养进行自激活检测。[结果]将鉴定正确的重组质粒测序结果与SGR基因比较,序列完全一致,阅读框分析正确。载体pGBKT7-SGR在酵母菌株Y187中可以正确表达出融合蛋白。重组诱饵pGBKT7-SGR质粒对酵母无毒性,其表达产物不能激活酵母菌株Y187的营养缺陷型报告基因。[结论]该重组诱饵质粒可用于酵母双杂交体系,该研究为从cDNA文库筛选水稻诱饵蛋白SGR的互作蛋白奠定了基础。     

OsWAX2基因的植物表达载体构建及遗传转化

利用拟南芥的WAX2基因序列,BLAST检索出3个水稻同源基因,分别命名为OsWAX2-1,OsWAX2-2,OsWAX2-3,与拟南芥WAX2基因的同源性分别为56.0%,55.2%,52.0%;其预测的编码蛋白与WAX2蛋白的同源性分别为61.5%,60.5%,64.7%.这3个蛋白都存在4个跨膜结构和2个固醇去饱和酶的保守区,说明这3个蛋白质都属于跨膜蛋白,并可能与角质层的蜡质合成有关.从全长cDNA数据库检索获得了3个OsWAX2的全长cDNA.以pCAMBIA-1300-multi为载体,构建了CaMV35S启动子驱动的3个OsWAX2的过表达载体pOEOSW2-1,pOEOSW2-2,pOEOSW2-3及3个RNAi表达载体pCROSW2-1,pCROSW2-2,pCROSW2-3,并通过冻融法将6个表达载体转化到根癌农杆菌EHA105,LBA4404和GV3101中,采用农杆菌介导法进行水稻日本晴品种的遗传转化,得到了具有Hyg抗性的水稻转基因苗,PCR检测到阳性植株.     

Metallothionein克隆载体及表达载体的构建及转化矮牵牛的初步研究

Metallothionein基因位于文库克隆载体pTriplEx2上,活化菌液并用限制性内切酶SfiI酶切,同时酶切添加了SfiI酶切位点的环状pMD-18TM,回收目的片段和载体并连接,经过酶切和PCR验证,成功构建克隆载体;再用XbaI和SmaI分别双酶切克隆载体和表达载体pc2301,回收目的片段和表达载体并连接,经酶切和PCR验证,成功构建含有目的基因的表达载体,进而转化植物获得耐重金属的植物株系。初步验证转化后的植株具有抗击重金属的能力。     

喉癌细胞酵母双杂交cDNA文库的构建

目的构建喉癌(Hep-2)细胞的酵母双杂交cDNA文库,为筛选包涵体膜蛋白分子的作用配体提供前期工作基础.方法从Hep-2细胞中提取总RNA,应用SMARTTM技术,构建以pGADT7-Rec为载体的Hep-2细胞酵母GAL4AD融合cDNA文库.结果所构建的文库展现出良好的多态性.结论可用于酵母双杂交系统的筛选.     

新城疫病毒HN蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

【目的】应用酵母双杂交技术构建新城疫病毒的血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白线性中和表位区的诱饵载体pGBKT7-HN-neu,为筛选靶向新城疫病毒HN蛋白的中和性纳米抗体奠定基础。【方法】合成HN蛋白的线性中和表位区HN-neu,将其克隆至酵母双杂交系统诱饵载体pGBKT7中,构建诱饵载体pGBKT7-HN-neu,经酶切鉴定和测序验证正确后,将pGBKT7-HN-neu转化酵母菌Y2H Gold,检测其在酵母细胞中的毒性和自激活作用。【结果】成功合成了HN-neu,构建的pGBKT7-HN-neu在酵母细胞Y2H Gold中无毒性和自激活能力。【结论】成功构建了诱饵载体pGBKT7-HN-neu。     

H9N2禽流感病毒纳米抗体酵母双杂交文库的构建

【目的】构建H9N2禽流感病毒（AIV）纳米抗体（Nbs）酵母双杂交文库,为后期筛选H9N2 AIV Nbs奠定基础。【方法】以H9亚型禽流感疫苗（F株）免疫双峰驼,当血凝抑制（HI）抗体滴度大于1∶2⁴时,颈静脉采集血液,分离淋巴细胞并提取淋巴细胞总RNA,用反转录试剂盒合成第一链cDNA,再以此为模板,通过巢式PCR扩增Nbs基因片段。将Nbs基因与pGADT7-Rec载体共转至Y187酵母感受态细胞,转化产物涂布SD/-Leu平板,30 ℃倒置培养约4 d,收集平板上的全部菌落,构建H9N2 AIV Nbs酵母双杂交文库,并对文库库容、滴度、重组效率和多样性进行鉴定。【结果】经H9亚型禽流感疫苗连续免疫4次后,双峰驼HI抗体滴度可达1∶2⁹;通过巢式PCR成功扩增出400 bp的Nbs基因。对构建的H9N2AIV Nbs酵母双杂交文库的鉴定表明,其库容为2.4×10⁸,滴度为4.2×10⁹ CFU/mL,插入重组率为95.6%;随机挑取10个克隆测序,结果显示均符合Nbs序列特征,且为独立克隆,表明文库多样性良好。【结论】成功构建了H9N2 AIV Nbs酵母双杂交文库,且文库各项指标均达到了要求。     

大菱鲆抗菌肽基因酵母表达载体的构建及表达

将大菱鲆（Scophthalmus maxinus）hepcidin基因成熟肽序列经过部分改造后采用PCR方法克隆到毕赤酵母胞内表达载体pGAPZB中,构建了重组胞内表达载体pGAPZB—tbhep6his。用BlnI线性化重组质粒后,电击转化毕赤酵母SMD1168。经过Zeocin筛选和PCR扩增转化子基因组筛选,得到了数株基因工程酵母菌。通过SDS—PAGE和Western blot鉴定,发现目的蛋白与预期蛋白的分子量相吻合,并能与特异抗体antihis特异性结合,表明大菱鲆抗菌肽hepcidin基因在酵母菌中进行了表达。大菱鲆抗菌肽酵母表达载体的构建和表达为进一步研究该抗菌肽的功能并开发新型鱼类饵料奠定了理论基础。     

酵母双杂交技术研究与应用进展

酵母双杂交是利用遗传学方法在酵母真核细胞体内研究蛋白质之间相互作用的非常有效的一种分子生物学技术,被广泛应用于蛋白质组学、细胞信号转导和功能基因组学等领域,已成为分子生物学研究领域的重要实验手段之一,获得了许多有价值的重要发现。随着分子生物学的发展,在酵母双杂交的基础上又建立起了酵母单杂、反向双杂交、三杂交及核外双杂交等多项技术,并已经成功地运用于蛋白质之间、蛋白质与DNA、RNA和配体之间相互作用的研究。对酵母双杂交及其相关技术与应用研究进展进行了综述。可以预见,在人类、水稻和拟南芥等模式生物基因组测序完成后,酵母双杂交及其衍生技术将在功能基因组学和蛋白质组学的研究中发挥越来越重要的作用。     

极细链格孢菌蛋白激发子PeaTl在酵母双杂交系统中转录激活活性的检测

2000年笔者从植物病原真菌中提取获得一类新型蛋白激发子,它能提高植物自身免疫力,促进植物生长,提高作物产量和产品品质。并在研究该类蛋白的过程中,从极细链格孢菌中分离纯化到1种能诱导植物产生系统抗性、促进植物生长的蛋白,并进一步克隆了编码该蛋白的基因peaTl（Genbank登录号CH445335）。为进一步阐明PeaTl的分子作用机理,拟采用酵母双杂交技术,     

酵母双杂交技术及其在植物与病原物互作中的应用

介绍了酵母双杂交系统的基本原理及其优缺点,以及十几年来此项技术在植物与病原物互作中的应用情况和此项技术的发展前景。     

通过酵母双杂交筛选水稻类受体激酶CR4的胞外结合蛋白

[目的]寻找CR4的胞外结合蛋白。[方法]采用OsCR4的胞外域作为诱饵蛋白,酵母双杂交筛选14 d的小苗cDNA文库。[结果]得到了许多蛋白,包括一个过氧化物B（D26484）、甲硫氨酸硫氧还原酶（ABF96078）和一个未知功能的蛋白。[结论]为研究CR4的信号转导机制提供了理论依据。     

通过酵母双杂交筛选水稻类受体激酶CR4的胞外结合蛋白（英文）

[目的]寻找CR4的胞外结合蛋白。[方法]采用OsCR4的胞外域作为诱饵蛋白,酵母双杂交筛选14d的小苗cDNA文库。[结果]得到了许多蛋白,包括1个过氧化物B（D26484）、甲硫氨酸硫氧还原酶（ABF96078）和1个未知功能的蛋白。[结论]为研究CR4的信号转导机制提供了理论依据。     

Cry1 Ac基因组织特异表达载体构建及水稻遗传转化

为了提高转基因抗虫水稻的生物安全性,构建了由组织特异性启动子序列RSP1、RSP2及组成型启动子35S带动Bt基因Cry1Ac的双元载体pCAM RSP1 Cry1A(c)、pCAM RSP2 Cry1A(c)及pCAM 35S Cry1A(c),并通过农杆菌EHA105介导对两个水稻品种"秀水11"和"秀水63"进行了遗传转化。"秀水11"和"秀水63"的平均转化率分别为72 9%和83 2%,经抗性愈伤组织的分化培养两个品种分别获得346和448株再生植株,其中PCR检测阳性株数分别为295和414。     

猪脂肪组织酵母双杂交文库的构建及质量鉴定

为了研究猪脂肪细胞分化的蛋白质之间的相互作用,采用LR重组反应的方法,构建猪脂肪组织酵母双杂交文库。结果显示,酵母双杂交文库的库容量为5.28×106CFU。随机挑取的24个克隆均带有插入片段,重组率100%,片段大小多数为1~2 kb,表明构建的文库质量较高。