RT-PCR技术诊断猪瘟的应用研究

应用反转录—聚合酶链反应(RT-PCR)对猪瘟进行诊断应用研究。应用RT-PCR况对来自广西不同地区的135份疑似猪瘟病料进行检测，以份诊断为阳性，阳性率62．2％。从百色、柳州地区等采集的健康猪扁桃体和淋巴结共276份，经RT-PCR检测，37份为阳性，阳性率为13．4％。其中健康猪扁桃体带毒较高，246份扁桃体中有35份阳性，占14．2％。采自柳州健康猪的26份淋巴结材料全为阴性，只有邕宁县的1份健猪淋巴结阳性。结果表明，RT-PCR技术可应用于猪瘟的临床诊断。     

RT-PCR检测健康猪扁桃体和流产死胎猪瘟病毒的应用及RFLP分析

本研究用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术对广西部分猪场的健康猪扁桃体材料以及流产胎儿和死胎中的猪瘟病毒(HCV)进行检测.70份健康猪扁桃体材料中阳性11份,阳性率达15.7%;52份流产胎儿及死胎材料中检出阳性9份,阳性率达17.3%.表明广西猪场中有比较严重的健康带毒情况.用限制性片段长度多态性分析法(RFLP)对25份阳性材料、HCLV和石门毒的引物A1/A2的PCR产物进行分析,发现HCLV、石门强毒和广西流行野毒的RT-PCR扩增产物中均有Rsa工的一个识别序列,但HCLV上的识别序列所在位置不同.本研究表明,用引物A1/A2作RT-PCR检测,并结合RFLP分析技术可把兔化弱毒和流行野毒区分开来,这将对预防猪瘟起到十分重要的作用.     

应用RT-PCR技术净化携带猪瘟病毒猪的效果

应用反转录-聚合酶链反应RT-PCR检测猪扁桃体猪瘟病毒,以清除健康猪的猪瘟隐性带毒,对规模猪场的猪瘟危害进行控制。2007年,用RT-PCR对广西某存栏350头种猪场全群活体采集扁桃体连续进行2次猪瘟病毒检测,检出并清除带毒猪,使猪群中猪瘟病毒的带毒猪比例明显下降。结果表明,RT-PCR检测猪扁桃体可应用于猪场猪瘟的控制与净化。     

RT-PCR检测宠物犬的犬瘟热病毒

为了寻找一种在早期快速准确检测宠物犬犬瘟热病毒(CDV)的方法,从临床上疑似CDV感染犬抗凝血中分离出血淋巴细胞,从中提取总RNA,引用曾在警犬上成功检测到CDV的引物序列,反复摸索RT-PCR反应条件,经凝胶电泳观察到在理论设计处(287 bp)出现了光亮条带,说明已成功地从宠物犬中检测出CDV。表明该引物序列和改良的RT-PCR反应条件适合于检测宠物犬CDV感染。     

猪流感病毒RT-PCR快速检测方法的建立

根据猪流感病毒M基因序列设计了一对扩增M基因684 bp片段的特异性引物,建立了RT-PCR快速诊断猪流感的方法,采用该方法检测出H1、H3、H5和H9 4个亚型猪流感病毒标准参考株为阳性,猪副黏病毒、圆环病毒2型和猪繁殖与呼吸综合征病毒检测结果呈阴性.RT-PCR最少可检测到1 000EID50的病毒量核酸,可直接从猪流感病毒感染小鼠的组织样品中检测到病毒.     

猪瘟病毒胶体金免疫层析检测方法的建立及应用

为建立一种猪瘟病毒的快速检测方法，采用柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金，选择15nm胶体金标记兔抗猪瘟病毒抗体，对胶体金标记抗体采用低温超速离心法进行纯化，组装免疫层析试纸条。用试纸条对猪瘟可疑病料进行检测，同时用直接荧光抗体试验和RT—PCR做平行试验。结果显示，用试纸条检测猪瘟病毒，10min左右即可显示结果，试纸条、直接猪瘟荧光抗体试验和RT—PCR的阳性检出率依次为36．36％（4／11）、45．45％（5／11）和72．72％（8／11）。表明，用胶体金免疫层析试纸条检测猪瘟病毒操作简便，需时短，可以用于猪瘟的流行病学调查。     

犬瘟热病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank上发表的犬瘟热病毒融合蛋白F基因序列,设计合成了1对寡聚核苷酸引物,扩增大小为337bp的目的片段,建立犬瘟热病毒F基因的RT-PCR检测方法。结果表明,该方法具有很强的特异性和很高的敏感性,可作为犬瘟热临床快速诊断的一种方法。     

规模化猪场非典型猪瘟的诊断和防制

应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和兔体交叉试验,对采自山东、安徽、苏北等不同地区的疑似猪瘟病料进行检测,显示出RT-PCR诊断技术快速、便捷、准确的特点,提示一些猪场非典型猪瘟感染率比较高,并就此提出加强免疫监测,加大猪瘟兔化弱毒疫苗的免疫剂量,果断淘汰感染母猪等综合性防制措施。     

CSFV的RT-PCR检测在控制与净化猪瘟中的应用

应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测健康猪扁桃体猪瘟病毒以监控与净化猪瘟.2006年用RT-PCR对广西某存栏250头种猪场的母猪扁桃体连续进行3次猪瘟病毒检测,检出并清除带毒猪,猪群中猪瘟病毒的带毒猪明显下降.结果表明,RT-PCR检测猪扁桃体可应用于猪场猪瘟的控制与净化.     

牛环曲病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立牛环曲病毒快速检测方法,针对牛环曲病毒的保守区域S基因设计合成1对特异性引物,建立了检测牛环曲病毒的RT-PCR方法,并对其进行了敏感性、特异性和重复性检测。结果显示,仅牛环曲病毒阳性模板扩增得到698 bp大小的目的条带,测序结果与GenBank中牛环曲病毒S基因序列(登录号:MG957145.1)的同源性为97%。敏感性试验显示,该方法能检测到的最低核酸含量为1.36×10~4 copies/μL。利用该方法对采集自河南省部分地区的164份临床样品进行检测,结果显示牛环曲病毒的检出率为9.15%(15/164)。结果表明,所建立的牛环曲病毒RT-PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于牛环曲病毒的临床检查和流行病学调查。     

RT-PCR检测猪瘟病毒方法的建立与应用

建立RT PCR检测猪瘟病毒的方法。根据已发表的猪瘟病毒E2基因 (囊膜糖蛋白gP55基因 )序列 ,设计合成了一对特异性引物 ,扩增片段的大小为 50 7bp ,用RT PCR技术对石门系标准株和 1 0株分离株进行检测。结果这对引物对标准株和 1 0株分离株均能扩增出与预期大小相符 50 7bpRT PCR产物 ,而对其他 6种猪病病原核酸的扩增结果为阴性。该RT PCR可检出 1 0 0pg的猪瘟病毒RNA模板 ,对人工感染猪不同组织样品进行检测 ,结果对白细胞抽提的核酸样品检出率最高为 1 0 0 % (2 4 / 2 4 ) ,其次为扁桃体、脾、肾 ,检出率为 83 3 % (2 0 / 2 4 ) ,再者为淋巴结 ,检出率为66 7% (1 6/ 2 4 )。对送检的 1 9份疑似猪瘟的病死猪病料组织进行RT PCR检测 ,结果有 1 6份样品为猪瘟病毒阳性。兔体交叉反应试验结果RT PCR阳性的 1 6份病料中 ,有 1 4份样品被判为含有猪瘟病毒 ,其他病料兔体交叉反应试验结果全为阴性     

检测和鉴别犬瘟热病毒强、弱毒株的复合反转录-套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)的建立及初步应用

根据GenBank上登录的犬瘟热病毒（Canine distemper virus，CDV）基因组全序列，选择CDV强、弱毒株间有区别保守区设计了一对通用引物P1和P4，并在该对引物跨越区域的内部设计了CDV强毒株特异性引物P2及弱毒株特异性引物P3，用引物P1／P4进行RT—PCR，然后用引物P2／P3／P4进行复合套式PCR，建立了一种能区分CDV强、弱毒株的复合反转录-套式聚合酶链式反应（RT—nPCR）的鉴别诊断方法。应用该方法从CDV强、弱毒株的基因组中分别扩增出了大小为247bp和177bp的特异性片段，从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为247bp和177bp的两条特异性片段，与犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒、狂犬病病毒、新城疫病毒的细胞培养物以及正常细胞对照组进行复合RT—nPCR扩增时均为阴性。对从黑龙江省和吉林省采集的20份疑似CDV病料进行的检测结果表明，有15份类似CDV强毒，5份类似CDV弱毒。本研究建立的复合RT—nPCR可以有效检测CDV感染，能够将强、弱毒株区分开，可用于临床快速检测、流行病学监测以及追踪疫苗免疫效果等。     

应用PCR技术检测鹅细小病毒

根据鹅细小病毒GPVH1株结构蛋白VP1与VP3编码基因非重叠核苷酸序列设计了一对引物GPR1 /GPR2 ,用这对引物对感染器官内的GPR和接种鹅胚增殖的GPV进行PCR扩增 ,其结果引物GRP1 /GPR2能特异性地扩增GPVVP1 VP3区段核苷酸序列 ,扩增出与设计核苷酸片段大小相符的 0 6kb的序列 ,而对照的鹅副粘病毒cDNA及鸭瘟病毒 (DPR)DNA对照组均出现阴性结果。     

RT-PCR检测猪繁殖障碍与呼吸道综合征病毒方法的建立与应用

作者参考国内外已发表猪繁殖障碍与呼吸道综合征病毒(PRRSV)的基因序列和PRRSV相关的RT—PCR检测方法报道，根据PRRSV高度保守、高特异性的NP蛋白基因设计了一对引物，通过对疫苗毒株、细胞分离株的检测，建立了PRRSVRT—PCR检测方法。进一步对40份临床样品进行了检测应用，结果有17份阳性样品，与临床症状和血清学结果相符。     

Effect of sampling site on the diagnosis of canine parvovirus infection in dogs using polymerase chain reaction

BackgroundAccurate diagnosis is imperative in dogs with clinical signs of parvovirus infection (CPV‐2).ObjectivesTo assess quantitative real‐time PCR (qRT‐PCR) for the diagnosis of CPV‐2 infection, and determine the optimal sampling site. Secondarily, to compare qRT‐PCR with a point‐of‐care PCR kit (PCRun), and to assess sensitivity of serology for CPV diagnosis.AnimalsSixty dogs with naturally acquired parvovirus infection, 44 unvaccinated puppies, of which 16 were followed after first and second vaccination, 15 adult dogs, of which 10 were followed also after a booster vaccine, and 9 dogs with distemper virus infection.MethodsProspective study. Samples from the rectum, blood, and pharynx were obtained for PCR.ResultsAll dogs with a clinical diagnosis of parvovirus infection were positive by qRT‐PCR in at least 1 sampling site (ie, rectum, blood, pharynx), and 50 (83%) of 60 were positive in all sites. qRT‐PCR was negative in 67 (99%) of 68 healthy puppies (before‐vaccination), puppies with distemper, and healthy adult dogs. Ten days after initial vaccination of puppies, 62% (fecal), 31% (blood), and 12% (pharyngeal) of samples were positive for CPV‐2 on qRT‐PCR. The proportion of positive pharyngeal samples decreased 20 days after vaccination and all sites were negative 12‐28 days after second vaccination. Vaccinated adults were negative before and after booster vaccination.Conclusions and Clinical ImportanceMolecular detection of CPV is sensitive, but specificity is hampered temporarily during the vaccination period. Blood, feces, and pharynx are suitable sampling sites. Fecal samples had the lowest sensitivity in sick dogs and highest positivity in puppies after vaccination.     

Application of the polymerase chain reaction (PCR) in veterinary diagnostic virology

The polymerase chain reaction has become an important diagnostic tool for the veterinary virologist. Conventional methods for detecting viral diseases can be laborious or ineffective. In many cases PCR can provide a rapid and accurate test. In this article we explain the basic principles of PCR and supply a reference list of its uses in diagnostic veterinary virology.Abbreviations BLV bovine leukaemia virus - BVDV bovine viral diarrhoea virus - DNA deoxyribonucleic acid - ds double-stranded - ELISA enzyme-linked immunosorbent assay - PCR polymerase chain reaction - RNA ribonucleic acid - ss single-stranded - TK thymidine kinase     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异野毒株与JXA1-R疫苗毒株快速鉴别方法的建立

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）变异野毒JXA1的基因变异序列和疫苗株JXA1-R的基因遗传标志设计合成了2对特异性引物,结合快速RNA抽提试剂和一步法RT-PCR,建立了JXA1变异野毒与JXA1-R疫苗毒的快速鉴别体系,其目的片段大小分别为400、290 bp,该方法对猪瘟病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒的PCR检测结果均为阴性;对JXA1变异野毒与JXA1-R疫苗毒RNA的最低检测量分别为103、104拷贝/μL。该方法敏感、特异,适用于临床样品的检测。     

应用FA及PPA-ELISA技术对猪瘟的检测

用免疫荧光抗体诊断技术及单克隆抗体纯化酶联免疫吸附试验诊断技术对疑为猪瘟病毒感染猪进行了检测 ,重点阐述了 2种方法的技术原理和操作过程。通过用免疫荧光抗体诊断技术检测了 5份病料 ,其中有 2份为阳性 ,阳性率为 40 % ;用单克隆抗体纯化酶联免疫吸附试验诊断技术检测了猪瘟血清抗体 ,在 40头母猪血清样品中 ,猪瘟弱毒抗体效价 OD值较高 ,有 1 0 0 %的保护率 ,但是发现母猪群中有 1 0 %隐性猪瘟感染 ,其强毒抗体效价 OD值大于 0 .5,体内带有猪瘟病毒。结果及过程表明此两种诊断方法检测快速、鉴别准确、分辨率高     

PCR技术检测饲料中沙门氏菌的应用研究

用聚合酶链反应(PCR)技术检测饲料中沙门氏菌,对已知被沙门氏菌污染的动物饲料培养物均能检出阳性,说明本方法对检测饲料中沙门氏菌具有特异性高、灵敏、快速等特点,适用于快速、准确地检测饲料中沙门氏菌的需要。