禽多杀性巴氏杆菌保护性荚膜抗原基因的克隆及表达

提取禽源多杀性巴氏杆菌C48—1的染色体,用“鸟枪法”将酶解染色体DNA片段重组到pBR322质粒载体的Pst I酶切点上,再转化到大肠杆菌RRI中.经耐药表型筛选,在约5000个转化菌中,找出了887个具有重组质粒的细菌株,其一般细菌学性质与大肠杆菌RRI相同,构成了禽多杀性巴氏杆菌C48—1染色体DNA的不完全基因文库.分离提纯保护性荚膜抗原,制备抗血清,用~(125)I SPA固相放射免疫技术,从文库中选出13株阳性表达菌株,与用ELISA法复试结果吻合,其中10号和696号菌株表达较强.对10号和696号菌进行了动物试验,结果1次免疫小鼠分别获3/7、2/7的保护,2次免疫分别获6/11和5/11的保护,与之对照的阴性转化菌(119号)以及大肠杆菌(RRI)则无保护力(0/7、0/10).用快速细菌破碎法对13个阳性菌株进行了检测,其外源基因片段在0.5～5.4kb之间.对10号阳性菌免疫电镜观察,在细胞膜及细胞浆内均可见到高电子密度区,显示出外源基因表达的位置和程度.10号菌的重组质粒命名为PPM10,分子量约为5.16kb,用Pst I酶切PPM10,得到约4.3kb和0.86kb的两个片段,因此插入片段约0.86kb.进一步用内切酶分析,证明该插入片段上无Bam HI、Eco RI、Hind III和另外的Pst I酶切点.     

鹿源多杀巴氏杆菌荚膜分型及免疫原性

采用Carter荚膜群鉴定法净分离于我国鹿的38株多杀巴氏杆菌进行鉴定，结果显示：B型占68.4%（26/38）。A型占18.4%(7/38)，D型占5.3%(2/38)，3株未能确定型占7.9%(3/38)。并从26株荚膜B型巴氏杆菌中选出荧光典型的8株菌制备免疫原给健康兔注射，30d后用间接血凝法测定各株菌抗体效价，选出效价最高的2株菌D1PM和D2PM用小鼠增毒，当毒力稳定后用兔测得D1PM MLD为8个菌，D2PM MLD为17个菌，为疫苗的制造筛选出了优良的菌株。     

禽多杀性巴氏杆菌ELISA三种抗原比较研究

禽多杀性巴氏杆菌ＥＬＩＳＡ三种抗原比较研究刘云同郑星道金仁哲顾万钧黄伟（吉林省通化县家畜繁改站·１３４１００）（吉林农业大学动物科学系关于检测禽多杀性巴氏杆菌血清抗体的研究，国外学者是应用凝集反应、间接血凝、酶联免疫吸附试验检测禽多杀性巴氏杆菌弱毒免...     

天津地区禽多杀性巴氏杆菌分离株血清型鉴定

通过Ｃａｒｔｅｒ氏荚膜型鉴定方法和琼脂扩散试验,对天津地区禽多杀性巴氏杆菌血清型进行鉴定。结果１６株分离菌中１１株为Ａ：１（４）,４株为Ａ：１（３,４）,１株为－：１（４）表明引起天津地区禽霍乱的致病菌与国内报道的以Ａ：１型为主有一定的差异。     

ELISA检测3种禽多杀性巴氏杆菌抗原的比较

关于检测禽多杀性巴氏杆菌血清抗体的研究,国外学者是应用凝集反应、间接血凝、酶联免疫吸附试验。研究认为,ＥＬＩＳＡ具有敏感性和可重复性等优点,是理想的血清学检测方法。在应用ＥＬＩＳＡ检测禽多杀性巴氏杆菌抗体的时候,如同其它血清学方法一样,抗原提取及钝化...     

牛源多杀性巴氏杆菌荚膜血清型及毒力基因检测

为了确定12株牛源多杀性巴氏杆菌的血清型及毒力基因的携带情况,本研究采用PCR技术对12株牛源多杀性巴氏杆菌(pasteurella maltocida,Pm)进行荚膜血清型鉴定和6种毒力基因(tbp A、hgb A、hgb B、ptf A、pfh A、tox A)的检测,并对其序列进行比对分析。结果显示:12株多杀性巴氏杆菌均为荚膜血清A型;100%的荚膜血清A型Pm携带hgb A毒力基因和pfh A毒力基因;41.67%的荚膜血清A型Pm携带nan H毒力基因;58.33%的荚膜血清A型Pm携带ptf A毒力基因;而对于tbp A与tox A两种毒力基因在12株牛源荚膜血清A型Pm中均未检测到。     

猪多杀性巴氏杆菌皮肤坏死毒素亚单位蛋白的制备及免疫原性研究

为获得针对猪萎缩性鼻炎主要病原体——多杀性巴氏杆菌皮肤坏死毒素的高免疫原性抗原,本试验构建、表达并验证该毒素的亚单位蛋白抗原,将猪多杀性巴氏杆菌毒素PMT基因与pMD19-T载体进行连接、转化,经序列分析鉴定后,分别使用BamH Ⅰ、Hind Ⅲ与Blp Ⅰ限制性内切酶将其酶切为3个基因片段。将片段1（Tox1）、片段2（Tox2）和片段3（Tox3）分别亚克隆至原核表达载体pET32-b、pET32-a和pET32-b中,构建3个重组表达载体。将重组表达载体转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导后,分别进行SDS-PAGE与Western blotting检测,并使用小鼠与豚鼠初步研究其免疫原性。结果显示,构建的3个基因片段长度分别为776、409与410 bp,与GenBank中相关序列具有高度同源性;3个蛋白片段表达正常,表达量分别达到379.95、447.62与459.82 μg/mL,SDS-PAGE验证条带分别为75、77与53 ku;因3个片段位置不同,仅Tox3有Western blotting检测条带,与理论预测相符;使用3种表达蛋白免疫小鼠与豚鼠后,二免后14 d,血清经试剂盒检测阳性率达到100%,对二免后14 d小鼠攻毒保护率达到93%。本研究成功构建了PMT的3个亚单位活性片段,且具有较好的免疫原性。     

鹅感染多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌的分离鉴定

某地一鹅群发生一种以败血、高死亡率为特征的急性传染病其临床表现为沉郁、不食、下痢等病变特征以内脏器官充血、出血和坏死为主。本文从鹅体内分离到16株细菌经鉴定为多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌混合感染;并进行了毒力试验和药敏试验结果表明多杀性巴氏杆菌致病性较强大肠杆菌致病性稍弱两菌混合感染致病性最强。恩诺沙星、单诺沙星和头孢氨苄西林对两种菌均为高敏。其余药物为中敏或不敏感。     

水泡性口炎病毒G蛋白抗原决定区片段基因在大肠杆菌中的表达

用RT-PCR的方法扩增水泡性口炎病毒G蛋白抗原决定基部分基因片段，构建克隆质粒pMD18-T-G660和表达质粒pET-28a-G660，转化宿主菌BL21（DE3），经IPTG诱导后，得到高效表达，表达蛋白质的相对分子质量为30000，占总蛋白的20．745％。     

牛多杀性巴氏杆菌znuA基因的原核表达及其免疫保护作用的研究

为研究牛多杀性巴氏杆菌(P.multocida)高亲和力锌吸收蛋白znuA的免疫学活性及其免疫保护作用,本研究利用PCR方法扩增了P.multocida znuA基因,构建表达载体pET-28a-znuA,将其转化E.coli BL21后经诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和western blot分析显示,重组蛋白约40 ku;以重组znuA蛋白免疫小鼠后用P.multocida菌株Y-1攻毒,结果显示重组znuA蛋白对免疫组小鼠保护率为60%,表明其具有免疫保护作用。本研究首次在原核系统中表达了P.multocida znuA蛋白,且验证了其免疫保护力,为深入探究znuA基因在P.multocida致病过程中的作用及其亚单位疫苗的开发奠定了基础。     

鹿源坏死梭杆菌毒力菌株FN(AB)94抗原的免疫原性

将坏死梭杆菌分离株 FN(AB) 94厌氧培养后 ,裂解制备抗原 ,在抗原悬液中加入等量福氏完全佐剂 ,配制成乳化抗原 ,以此分别接种 3组 9只家兔 ,并设立对照组。初次免疫后 7d进行第 2次免疫 ,每隔 1周采血 ,检测免疫兔血清中抗体滴度 ,2 8d后免疫兔分别用 2 m L 的 10 8个菌 /m L(2个 ML D)坏死梭杆菌分离株 FN(AB) 94感染 ,3只对照家兔同时感染相同剂量 ;逐日观察攻毒家兔的变化。结果 ,3只对照家兔于感染后的 12～ 2 1d死亡 ;而 9只免疫兔完全能抵抗毒力菌株的感染 ,6个月后仍存活。试验表明 ,坏死梭杆菌分离株 FN(AB) 94裂解抗原加佐剂后 ,具有良好的免疫原性。     

牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌强菌株rpoE蛋白的原核表达及其免疫保护效力研究

为研究牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌(PM)强菌株rpoE蛋白的免疫保护性,本研究利用PCR方法扩增牛荚膜A型PM的rpoE基因,构建pET-28a-rpoE重组表达质粒,经诱导表达后SDS-PAGE检测结果显示,表达的rpoE蛋白相对分子量约为20 ku,与理论值一致;western blot结果显示该蛋白具有很好的特异性和反应原性;纯化的rpoE蛋白经皮下免疫BALB/c小鼠,间接ELISA检测融合蛋白的免疫原性,结果显示rpoE蛋白可以诱导小鼠产生较高水平的特异性抗体;PM攻毒后,免疫组保护率为70%。本研究获得的牛荚膜A型PM重组rpoE蛋白具有良好的免疫原性,免疫小鼠后能够提供一定的保护,可以作为研发PM亚单位疫苗的候选抗原。     

Isolation,Identification and Genotyping of Pasteurella multocida from Fowl Cholera

In order to determine the suspected avian cholera pathogen and geneotypes, bacteria isolation technology was used to isolate and culture pathogenic bacteria, the isolated bacteria were identified by traditional methods and molecular biological methods. Geneotyping of the isolated bacteria were determined using PCR technology and gene sequence analysis. The results demonstrated that the isolated bacteria had typical culture characteristics of Pasteurella multocida (Pm),and the morphology of the colony, the characteristics of cell staining, the physiological and biochemical characteristics were consist with Pm; 457 bp fragment was amplified by PCR. Geneotyping results showed that only A primer amplified the target gene fragment of 1 050 bp, sequence analysis also showed that the isolated bacteria shared 97.6% to 100.0% sequence homology with reference strains, and phylogenetic tree analysis showed that the isolated bacteria and A type Pm were in a branch.The experimental results indicated that the isolated bacteria was identified as capsular serotype A of Pm, the results provided reference for the prevention and control of fowl cholera.     

禽霍乱病原菌的鉴定与主要特性分析

从河北某养鸡场80日龄左右鸡群所发生的禽霍乱病死鸡中，分离到了相应病原菌多杀巴斯德氏菌（pasteurella multocida）。对分离获得的16株菌（HPs-1至HPs-16）进行了形态特征、培养特性、理化特性等方面的鉴定，同时选取代表菌株（HPs-1）进行了16SrRNA基因的分子鉴定，测定了16SrRNA序列，构建了系统发育树。结果表明分离鉴定的16株细菌均为多杀巴斯德氏菌败血亚种（P．multocida subsp．septica），所测代表菌株的16SrRNA基因长度142bp，在GenBank登录号为AY999017，该菌株与检索出的22株巴斯德氏菌属（Pasteurella Trevisan，1887）细菌16SrRNA基因序列同源性均在98％～100％。另外，药敏试验结果显示分离株对供试的青霉素G等33种抗菌药物高敏、对克林霉素敏感、对苯唑青霉素等3种耐药。