伪狂犬病毒单克隆抗体的制备和鉴定

以伪狂犬病毒（PRV）作为免疫原,免疫BALB／c小鼠,融合之后经间接ELISA、IFA和IHC试验进行杂交瘤筛选,共获得2株能分泌针对PRV单克隆抗体（简称单抗）的杂交瘤细胞株。2株猪伪狂犬病毒单抗与猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒均无交叉反应,IFA结果显示单抗能与接种于猪睾丸细胞（ST）的PRV发生特异性反应,IHC结果显示单抗能用感染了PRV的猪神经组织发生反应,证实抗PRV单克隆抗体具有良好的特异性和敏感性,此结论为猪伪狂犬病毒抗原表位分析及相关抗原抗体诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

猪瘟病毒单克隆抗体的制备及其免疫组织化学研究

通过杂交瘤技术制备猪瘟病毒单克隆抗体，对酶联免疫吸附试验筛选的阳性单克隆抗体进行免疫组织化学研究，从中发现1株单克隆抗体能与感染猪瘟病毒的猪肾、肝病理组织切片及PK15细胞产生特异性染色反应，与非感染猪的肾、肝组织切片和PK15细胞无染色反应。单克隆抗体与猪瘟病毒感染的PK15细胞或猪肝、肾小血管内皮细胞中的猪瘟病毒呈现较强的特异性棕色着染，表明该单抗是针对猪瘟病毒的单克隆抗体，对研究猪瘟病毒在宿主细胞中的生命活动和繁殖定位有非常重要的意义。该单抗命名为YNF，培养上清液和腹水的抗体效价分别为1：80和1：10000。抗体蛋白属IgG类，亚类为IgG2／κ。     

检测组织石蜡切片中猪圆环病毒2型间接原位PCR方法的建立与评估

利用PCR的高灵敏度和原位杂交（ISH）的细胞定位能力,建立了一种间接原位PCR（ISPCR）方法用来检测经福尔马林固定的腹股沟淋巴结的石蜡切片中的猪圆环病毒2型（PCV2）的分布,这些腹股沟淋巴结来自于携带猪圆环病毒2型的临床健康猪及患有断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的仔猪。间接ISPCR与其他几种常规PCV2诊断方法敏感度比较结果显示：套式PCR方法最为敏感,其次是间接ISPCR、常规PCR、ISH与免疫组织化学（IHC）染色方法。尽管间接ISPCR、ISH和IHC染色方法均能显示出相似的PCV2信号分布图,但是间接ISPCR可以显示出先前用常规ISH或ICH染色方法未能显示出来的PCV2信号,尤其在携带PCV2的临床健康猪的生发中心细胞中。而且6种不同的PCV2信号表达模式与相关淋巴组织病变可被分级用来描述组织形态学变化和病毒感染。研究结果表明：间接ISPCR是一种效果较为显著的基于细胞的诊断工具,它具有在福尔马林中固定并经石蜡包埋的组织切片中诊断PCV2的特异性,它将是深入研究PCV2发病机理的有效工具。     

用单克隆抗体检测禽脑脊髓炎病毒抗原

建立了抗禽脊髓炎病毒（ＡＥＶ）的单克隆抗体（ＭＡｂ）ＶＲ９－１。接种ＡＥ鸡胚适应毒Ｖａｎ Ｒｏｃｋｃｌ株、２种疫苗株和２种野毒株的雏鸡脑冰冻切片、鸡胚成纤维细胞和鸡胚脑细胞，用间接免疫荧光和免疫过氧化物酶染色检查，结果，均可与ＭＡｂ ＶＲ９－１起反应。该ＭＡｂ也可用于石蜡包埋切片的抗生物素蛋白－生物素－过氧化物酶染色。试验结果表明，该ＭＡｂ可认别ＡＥＶ毒株的一个共同抗原决定簇，可用于ＡＥＶ检测和定     

猪流感病毒LAMP检测方法的建立

本试验针对猪流感病毒（swine influenza virus,SIV）NP基因保守区域设计并合成6条引物,建立了SIV的环介导等温扩增（LAMP）检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,该方法可特异性检测H1N1、H1N2、H3N2、类禽H1N1亚型SIV及甲型H1N1流感病毒,但不能检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、日本乙型脑炎病毒;该方法的最低检测量为100拷贝/μL质粒DNA。结果表明建立的LAMP方法具有较高的敏感性和特异性,可用于SIV的快速检测。     

猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

为制备猪δ冠状病毒（PDCoV）N蛋白的特异性单克隆抗体,并初步应用于临床样品中PDCoV抗原的免疫组织化学（IHC）检测,本研究以原核表达的PDCo V N蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,基于纯化的N蛋白建立的间接ELISA方法筛选获得稳定分泌N蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,并对单克隆抗体的免疫反应特异性、亚类进行系统鉴定。结果显示：通过3次亚克隆筛选获得8株可分泌PDCo V N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经IFA和Western blot分析,证实制备的单克隆抗体均与猪δ冠状病毒反应,且不与猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）反应,特异性良好。单克隆抗体亚类鉴定结果表明,1A11、3C6、1E7、1E12株单克隆抗体属Ig G1型,4F3、2A3株单克隆抗体为Ig G2a型,3E4单克隆抗体为Ig M型,8株单克隆抗体的轻链均为κ链。利用1A11单克隆抗体对PDCo V、PDEV、TGEV感染猪的空肠、回肠组织进行IHC检测,结果表明1A11能与感染PDCo V的组织发生特异性免疫反应,而不与感染PDEV和TGEV的组织发生...     

H9N2亚型猪源性流感病毒在小鼠肺微血管内皮细胞内最佳增殖条件的研究

试验旨在确定H9N2亚型猪源性流感病毒（SIV）在小鼠肺微血管内皮细胞（PMVEC）中增殖的最佳条件。将PMVEC解冻、复苏、培养,取长成单层的PMVEC,在不同浓度TPCK-胰蛋白酶维持液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL）、不同H9N2亚型SIV（A/swine/HeBei/012/2008/（H9N2）接种剂量（1：10、1：100、1：1 000、1：10 000、1：100 000、1：1 000 000和1：10 000 000）及不同病毒吸附时间（0.5、1.0、2.0和3.0 h）条件下观察PMVEC形态变化,并测定细胞上清液中H9N2亚型SIV的HA滴度。在未加病毒的情况下,低于0.6 μg/mL的TPCK-胰蛋白酶对PMVEC的生长未造成任何影响,但随着TPCK-胰蛋白酶浓度的增加,PMVEC开始出现肿胀、变圆,甚至脱落;采用含有0.6 μg/mL TPCK-胰蛋白酶维持液将H9N2亚型SIV稀释为不同的浓度感染PMVEC,在0.3 μg/mL TPCK-胰蛋白酶维持液、10^-2病毒稀释倍数感染条件下48和72 h HA滴度分别为4.6log2和6.4log2;病毒吸附时间为2 h且中间震荡20 s的条件下H9N2 HA滴度最佳。结果表明,当TPCK-胰蛋白酶维持液浓度为0.3 μg/mL、病毒接种浓度为10^-2、吸附时间为2 h且中间震荡20 s时,H9N2亚型SIV在PMVEC中增殖最佳,达到6.8log2。     

马立克氏病病毒囊膜糖蛋白B基因原核表达产物单抗的制备

用大肠杆菌BL21表达了马立克氏病病毒（MDV）强毒GA株的囊膜糖蛋白B（gB)基因，通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶龟泳（SDS－PAGE）分离表达蛋白条带，切下并碾碎后作为免疫原制备单克隆抗体。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和间接免疫荧光试验（IFA），得到1株GA株阳性的单克隆抗体杂交瘤细胞株7C8。该单抗腹水的ELISA效价为1：2^12，IFA效价为1：800，与MDV不同致病型毒株CVI988、GA、RB1B、MD11、648A株感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）均呈IFA阳性。1：100稀释时与GA感染的CEF在斑点酶联免疫吸附试验（dot-ELISA)中呈阳性。     

从患生殖——呼吸道综合征病猪分离出猪呼吸道冠状病毒

采集３／１５头猪生殖－－呼吸道综合征病毒患猪的扁桃体和肺脏，在猪肾细胞（ＣＰＫ）上分离出４株致细胞病变的病毒。分离毒在生化学和形态学上类似于冠状病毒。用于多克隆抗体的中和试验，分离毒与传染性胃肠炎病毒（ＴＧＥＶ）不能鉴别，而用能鉴别ＴＧＥＶ和猪呼吸道冠状病毒（ＰＲＣＶ）的单克隆抗体，则可与ＴＧＥＶ相区别。这表明此分离毒是ＰＲＣＶ。从２个猪场５０日龄猪中各采集３０份血清样品，用血清学方法检测，抗分离     

H3亚型猪流感病毒抗原捕捉ELISA检测方法的建立

为快速检测H3亚型猪流感病毒(SIV),本研究将一株H3N2亚型SIV特异性单克隆抗体(MAb)进行纯化,建立了以多抗作为包被抗体,MAb作为检测抗体的H3亚型SIV抗原捕捉ELISA (AC-ELISA)方法.并对该方法的特异性和敏感性进行了分析,其敏感性是血凝试验的4倍,与猪繁殖与综合征病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒以及H1、H5、H9亚型SIV均没有明显的交叉性反应,批间和批内重复试验变异系数均小于10％.应用建立的AC-ELISA方法对84份H3亚型SIV实验室感染样品进行检测与鸡胚滴定病毒结果符合率达90.47％.本实验建立的AC-ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,可用于H3亚型SIV的临床检测.     

A型塞内卡病毒VP2蛋白阻断ELISA检测方法的建立

为了建立一种检测A型塞内卡病毒(SVA)VP2蛋白抗体的阻断ELISA方法,试验用SVA VP2蛋白作为抗原包被酶标板,采用棋盘法确定最佳蛋白包被浓度和单克隆抗体最佳稀释倍数。同时对阻断ELISA的其他条件(封闭液、血清稀释度、底物反应条件)进行优化,对方法的特异性和重复性进行考察。结果表明:VP2蛋白最佳包被浓度为0.5μg/mL;最佳封闭液为2%BSA,每孔200μL,37℃封闭1 h;待检血清最佳稀释度为1∶1,在37℃条件下作用1 h;单克隆抗体最佳稀释度为1∶40 000,在37℃条件下作用1 h;底物最佳反应条件为室温避光10 min。特异性试验结果显示,SVA阳性血清与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综征病毒、猪瘟病毒、猪口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应。批间、批内重复性试验结果的变异系数均小于10%。对200份猪血清样本进行荧光抗体中和试验和阻断ELISA方法检测,符合率为96.0%。说明该ELISA方法具有良好的特异性和重复性,可用于塞内卡病毒血清抗体检测和流行病学调查。     

非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

为制备非洲猪瘟病毒（ASFV）p62蛋白的特异性单克隆抗体,并初步应用于感染组织样品中ASFV抗原的免疫组化（IHC）检测,本研究以杆状病毒表达的非洲猪瘟病毒重组p62蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞。结果显示：基于纯化的p62蛋白建立的间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选和亚克隆,获得了18株可稳定分泌抗非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经IFA检测,制备的单克隆抗体均与非洲猪瘟病毒反应,且不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型等猪源常见病毒反应,特异性良好。抗体识别蛋白的鉴定结果显示,3株MAbs识别p35蛋白,15株MAbs识别p15蛋白。14株MAbs重链亚类为IgG1型,4株MAbs重链亚类为IgG2a,轻链均为κ链。利用18株MAbs对ASFV感染猪的肺、扁桃体、淋巴结等组织进行IHC检测,结果显示5株MAbs均能够与感染ASFV的组织发生特异性的免疫反应。本研究获得的非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体可为非洲猪瘟病毒免疫学检测方法的建立及p62蛋白的结构功能等基础研究提供重要的生物材料。     

检测鸡传染性鼻气管炎病毒抗体的间接ELISA方法的研究

分别用绿猴肾细胞和鸡胚成纤维细胞殖鸡传染性鼻气管炎病毒NL7784株，提纯抗原建立了检测鸡传染性鼻气管炎病毒抗体的间接酶联免疫吸附试验（ELISA），试验的最佳反应条件为：抗原最佳稀释度为1：160，酶标抗体为1：1000稀释，待检血清为1：160稀释，包被液为pH9．0的碳酸盐缓冲兴，6％犊牛血清（CS）作封闭液，稀释液用含10％CS的Tween－20磷酸盐缓冲液，洗涤液用含0．5％Tween－20的磷酸盐缓冲液，抗原与抗体的最佳反应时间为30分钟，底物的反应时间为15分钟。与中和试验进行了比较，证明所产方法具有很好的特异性、稳定性、可重复性和较高的敏感性。     

贵州省某规模化猪场SIV和PCV-2感染的诊断

为快速诊断出贵州某规模化猪场猪发病原因,对送检样品进行了流行病学及临床症状调查、解剖病理观察,初步判断该猪场发病猪疑似为猪流感病毒（SIV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）或（和）猪圆环病毒2型（PCV-2）感染。为确诊病因,对送检样品进行了血清学检查和PCR/RTPCR检测,结果 PRRSV未出现目的条带,SIV与PCV-2出现目的条带,且测序结果与预期一致,表明该猪场感染有SIV和PCV-2,因此该猪场应及时进行猪流感（SI）与猪圆环病毒病（PCVD）的免疫预防,同时应加强日常管理与治疗。     

H1亚型猪流感病毒微滴数字RT-PCR定量检测方法的建立

本研究针对H1亚型猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)HA基因保守序列设计引物和探针,通过反应条件优化,建立了一种快速、准确检测H1亚型SIV的微滴数字RT-PCR定量方法。该方法特异性强,除H1亚型SIV外,H3、H5、H7亚型SIV以及猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等检测均为阴性;敏感性高,最低可检测4.7拷贝/μL;重复性好,对5个不同稀释度的H1亚型SIV RNA进行3次重复试验,每个稀释度的变异系数均小于5%。利用该方法对湖南省规模化养殖场收集的30份猪鼻拭子样品进行检测,发现与荧光RT-PCR检测结果一致。试验表明,该方法快速、准确、灵敏,可为H1亚型SIV的快速筛查及流行病学研究提供可靠的技术保障。     

猪传染性胃肠炎病毒的血凝位点的定位研究

通过转瓶培养ＩＢＲＳ２细胞，选择最佳接毒剂量、接毒时间和收毒时间生产出凝集价（ＨＡ）达２１２的猪传染性胃肠炎病毒（ＴＧＥＶ）血凝抗原。用抗ＴＧＥＶＳ蛋白和 Ｍ蛋白的单克隆抗体与不同稀释度的ＴＧＥＶ血凝抗原等量混合，在 ３７℃作用 ３０分钟后接种ＩＢＲＳ２细胞和做中和试验（ＮＴ）和血凝抑制（ＨＩ）试验。结果表明ＴＧＥＶ血凝位点与中和位点一致，血凝素位于Ｓ蛋白Ａ位点或其附近。     

抗H3N2亚型猪流感病毒单克隆抗体的制备与鉴定

采用纯化的H3N2亚型猪流感病毒(SIV)尿囊液作为免疫原免疫6～8周龄Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,用间接ELISA方法筛选分泌抗SIV-H3N2的阳性细胞株,经克隆获得7株亲和力较高的杂交瘤细胞株,分别命名为1C9、2C5、2F10、3D3、4E8、5C7、5D12,用其制备的腹水ELISA效价可达1×106。通过抗体亚型测定,间接免疫荧光试验及免疫印迹试验分析鉴定,该7株单抗均为抗H3N2亚型SIV的特异性单克隆抗体,而且与其他亚型猪流感病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒和猪瘟病毒等均无交叉反应,为H3N2亚型SIV的鉴别诊断奠定了基础。     

三种检测雏番鸭细小病毒抗原方法的比较

我们应用番鸭细小病毒单克隆抗体建立检测MPV抗原酶联免疫吸附试验（ELISA）方法，并和胶乳凝聚试验（LPA）、免疫荧光抗体试验（FA）的检测结果相比较：１材料方法１．１病毒和单克隆抗体雏番鸭细小病毒强毒株（MPV－F），雏番鸭细小病毒单克隆抗体（MPV－McAb１５），由本所单克隆研究室制备提供犤１、２犦。１．２样品处理２日龄雏番鸭２０羽，每羽腿部肌肉注射０．２mlMPV－F番鸭胚悬液。待雏番鸭发病后扑杀，取肝脏和脾脏组织。一部分组织用蒸馏水制成１∶１匀浆液后，加等体积氯仿振荡３min，５０００rpm／min离心５min，…     

马立克氏病病毒囊膜粘蛋白B基因原核细胞表达产物单克隆抗体的制备

用大肠杆菌BL21表达了马立克氏病病毒（MDV）强毒GA株的囊膜糖蛋白B（gB）基因，通过SDS－PAGE电泳分离表达蛋白条带，切下并碾碎后作为免疫原制备单克隆抗体。通过ELISA和间接免疫荧光试验（IFA），得到1株阳性单克隆抗体杂交瘤细胞株7C8。该单抗腹水的ELISA效价为1：2^12，IFA效价为1：800，与MDV不同致病型毒株CVI988、GA、RB1B、MD11、648A株感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）均呈IFA阳性。1：100稀释时与GA株感染的CEF在斑点酶联免疫吸附试验（dot-ELISA)中呈阳性。     

数字RT-PCR技术检测H3N2亚型猪流感病毒方法的建立

试验旨在利用新型荧光探针--分子信标,建立一种检测猪流感病毒的新方法。根据H3N2亚型猪流感病毒（swine influenza virus,SIV）的H3和N2基因的保守基因序列,分别设计并合成了特异性引物和分子信标探针,利用数字RT-PCR技术检测H3N2亚型SIV。结果显示,该数字RT-PCR检测方法与其他主要相关病毒均不发生交叉反应,重复性良好;对猪H3N2流感病毒而言,最低可检测到10⁶倍稀释的病毒株。数字RT-PCR方法能够对RNA模板定量分析。在H3N2 SIV的鉴定上,数字RT-PCR方法较实时荧光定量PCR方法更灵敏、准确。