鸡卵巢组织SSH cDNA文库构建及差异表达基因筛选与初步鉴定

为分离与鸡产蛋性能密切相关的重要基因或调控因子，利用抑制性消减杂交技术，以高产蛋鸡品种海兰褐商品代蛋鸡和产蛋量相对较低的地方鸡品种大骨鸡20周龄时的卵巢组织为试验材料，构建消减cDNA文库。文库的插入片段集中在500bp左右，挑取720个克隆进行PCR筛选，获得657个阳性克隆，经过点杂交筛选后选择了536个阳性克隆，...     

分离差异mRNA技术及其应用

从介绍分离差异mRNA技术的发展过程入手,重点概述了SSH、DDRT-PCR和cDNA-AFLP技术的程序和优缺点, 及其在分离目的基因、研究发育调控和杂种优势的分子机理等领域的应用。     

应用抑制性差减杂交技术筛选锦橙CTV应答基因

【目的】探讨易感柑橘衰退病病毒（Citrus tristeza virus,CTV）品种锦橙CTV应答分子机理,筛选和分析CTV应答基因。【方法】以嫁接CTV强毒株TRL514的锦橙阳性材料叶片为试验方（Tester）,用嫁接无毒枝条的CTV阴性锦橙叶片为驱动方（Driver）,构建CTV侵染的锦橙的正向差减文库。【结果】随机挑选850个阳性克隆测序,其中742条测序成功,去除载体片段和接头序列后得到有效EST 692条。将所有EST序列对应到柑橘的预测基因组转录物,共涉及137个柑橘基因。应用BLAST2GO对这些特异性表达的基因进行功能归类和KEGG分析。结果表明,受CTV侵染的影响,锦橙能量代谢相关基因上调明显,与光合器官碳固定、氮代谢、淀粉和蔗糖代谢等途径相关的EST出现频率较高。另外,与抗逆防御以及苯基丙氨酸合成、类苯基丙烷代谢、类胡萝卜素合成等与植物防御素类物质合成密切相关的代谢途径相关基因较多。【结论】由于CTV的侵染,CTV易感品种锦橙基础代谢改变明显,须通过增强能量代谢和提高自身防御能力来维持自身生长和发育。     

枯萎病菌诱导的节瓜抑制差减cDNA文库的构建

以抗枯萎病节瓜品种杂交20号为材料,利用抑制差减杂交(Suppression subtractive hybridization,SSH)技术,构建了枯萎菌(Fusarium oxysporum f.sp.beniacasa)诱导的节瓜SSH-cDNA文库。文库质量检测表明,差减杂交效率较高,质量较好。得到正向差减文库的滴度为3.64×105 CFU/mL,反向差减文库滴度为6.80×105 CFU/mL;正向和反向差减文库的重组率均大于90%,插入片段在400～800bp之间。     

紫外线照射辣椒叶片cDNA文库构建及部分防御信号基因cDNA的检测

对抗病的朝天椒地方品种,以紫外线(UV)处理叶片并提取叶片总RNA,采用SMARTTMcDNA文库构建试剂盒构建了一个cDNA文库.该文库含有2.6×106个独立的噬菌斑克隆,扩增后滴度达到1.5×109pfu.μL-1,随机挑取的噬菌斑PCR检测发现重组率达90.0%.在搜索、拼接与植物WRKY、bZIP、AP2和E2等重要调节基因同源的辣椒表达序列标签(ESTs),获得重叠群的基础上,分别设计上述基因ESTs重叠群特异性引物,以cDNA文库为模板进行PCR扩增.结果表明,部分上述基因cDNA存在于文库中.因此,本研究所构建的文库可用于进一步分离响应UV的重要调节基因cDNA的分离.     

油菜矮化突变体茎段伸长初期茎尖差异表达基因的初步分析

采用抑制性消减杂交技术,以甘蓝型油菜矮化突变体"NDF-1" 及野生型"3529"为材料构建与植株高矮性状关系最为密切的茎尖差异表达抑制消减cDNA文库.所建cDNA文库插入片段大小主要集中在100～500 bp之间.斑点杂交筛选得到30个阳性克隆,序列测定和同源性对比分析表明,所得克隆功能涉及到第二信使、转录因子、激素代谢、蛋白质降解及转运等多个方面.并对其中几个差异表达基因的功能进行了初步分析,为进一步认识油菜植株矮化机理奠定了基础.     

cDNA文库构建策略及其分析研究进展

 cDNA文库构建和筛选是基因克隆的重要方法之一，它是目前发现新基因和研 究基因功能的基本工具。从cDNA文库中可以筛选到目的基因，并直接用于该基因的表达。经典 cDNA文库存在克隆的片段短等缺点，而全长cDNA文库则能提供完整的mRNA信息，从而克隆cDNA全长；对文库进行均一化处理即均一化cDNA文库，可以增加克隆低丰度mRNA的机会；差减cDNA文库在研究生物体某一时期基因差异表达上具有重要的意义；改进的固相cDNA很大程度上提高了建库的效率和质量。本文以阐述基本原理为主，介绍几种近年来常用的cDNA构建的方法及其优缺点。     

疫霉侵染的辣椒cDNA文库的构建及非特异性脂转移蛋白cDNA的筛选

建立了辣椒疫霉侵染的辣椒幼苗cDNA文库,该原始文库含有1.5×106个独立克隆,插入片段约为0.5-2 kb.采用基于PCR技术的96孔文库筛选方法,从该cDNA文库中筛选出了1个应答辣椒疫霉侵染的候选基因的全长cDNA.经生物信息学分析,推测这个候选基因为非特异性脂转移蛋白(non-specific lipid-transfer protein,nsLTP)基因.     

金鱼头瘤形成相关基因差减文库的构建与分析

采用差减抑制杂交技术(SSH)以1龄红狮头金鱼(Carassius auratus)的头瘤组织为检测子(Tester),40日龄红狮头金鱼幼鱼的头顶上皮组织为驱动子(Driver),构建金鱼头瘤相关基因的差减cDNA文库。以鲫管家基因α-tubilin为参照检测差减效率,结果表明该文库差减效率达210倍,效率较高。随机挑选阳性克隆进行接头特异引物的PCR检测,结果表明插入片段均在0.1~2.0kb之间。利用斑点杂交对PCR检测结果为单一条带的阳性克隆进行筛选并测序,获得高差异性的有效序列93条。通过生物信息学方法对文库序列进行比对、分类和注释,发现若干结缔形成基因和原癌/抑癌基因等与金鱼头瘤形成相关的功能基因,表明cDNA文库构建成功。     

应用抑制性差减杂交技术分离椪柑枯水相关基因

【目的】探索椪柑枯水分子机理,寻找柑橘枯水应答基因,为柑橘枯水防治奠定基础。【方法】利用抑制性差减杂交技术以椪柑正常果肉cDNA作为Driver,以枯水果肉cDNA作为Tester构建正向差减文库。【结果】挑选了300个有效克隆进行测序分析,260个测序成功。经BLASTx比对分析,197条表达序列标签（ESTs）找到了分属于52个基因的同源序列;63条ESTs同源性较低或没有同源性。对文库中编码β-微管蛋白、衰老相关蛋白、细胞色素c、半胱氨酸蛋白酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、转运蛋白、天冬氨酸蛋白酶前体、WRKY转录因子21的基因进行实时定量RT-PCR验证,结果显示这8个基因均明显上调表达。这些差异性表达基因主要涉及衰老、抗逆防御、几丁质和细胞壁代谢、蛋白降解等过程。【结论】通过构建椪柑果肉枯水正向文库,得到一些与枯水相关的基因,这些基因反映了果实对枯水的调控情况,可作为今后防治枯水病害的候选基因。     

辣椒种质疫病抗性鉴定及防治药剂的筛选

采用了游动孢子灌根法对70份辣椒材料进行了疫病抗性鉴定,结果表明：参试材料的抗病性存在较大差异,其中感病材料32份,中抗材料15份,抗病材料10份,高抗材料13份,VC42-1、VC48-1、线边H、中21×X8F等材料具有极高抗性。采用菌落直径法测定8种药剂对辣椒疫霉的毒力,结果表明,50％烯酰吗啉可湿性粉剂、68％精甲霜·锰锌水分散粒剂和64％噁霜·锰锌可湿性粉剂对菌丝抑制作用相对较强,其EC50值分别为0．1242,5．0630,8．0035μg/mL。对8种药剂的田间防治效果进行比较,结果表明,50％烯酰吗啉可湿性粉剂、68％精甲霜·锰锌水分散粒剂和72％霜脲·锰锌可湿性粉剂的防治效果最好。对比分析室内毒力测定和田间药效试验,筛选出可用于生产上防治辣椒疫病的2种药剂烯酰吗啉和精甲霜·锰锌,防治效果在70％以上。     

cDNA-AFLP技术及在差异表达基因克隆上的应用

cDNA-AFLP技术是在AFLP技术基础上发展起来的主要用于研究基因差异的技术,具有高效可靠的优点,受到研究者的青睐,被广泛应用于包括植物在内的各类生物的基因表达的研究中。简要阐述了cDNA-AFLP技术的原理,重点讨论了操作过程中可能出现的问题和技术关键,并就该技术与其他差异表达技术进行了比较,以说明其在克隆差异表达基因上的优势,还简要列举了一些在抗病育种等领域的应用实例。     

辣椒疫病生防菌的筛选、鉴定及其抑菌机理初探

采用平板稀释法和平板对峙试验,从武汉、荆州、宜昌和荆门等地的辣椒根际土壤中分离到185株细菌,筛选到1株具有高效拮抗辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)的生防菌Bs04。通过形态学观察、生理生化指标测定、16S r DNA序列测定及进化树构建,确定菌株Bs04为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。Bs04对辣椒疫霉菌丝生长抑制率达80%,同时对烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var.nicotiana)、棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sb.vesinfectum)和黄瓜立枯病菌(Rhizoctonia solani)具有明显的抑制作用。利用光学显微镜观察Bs04对辣椒疫霉菌丝形态的影响,发现菌丝分支增多、顶端畸形、原生质浓缩及生长缓慢等现象,表明Bs04具有显著的抑菌作用。     

不同培养条件对循化线辣椒疫霉菌产孢量的影响

[目的]探讨不同培养条件对循化线辣椒疫霉病产孢量的影响。[方法]针对光照时数、pH、培养基以及温度对循化线辣椒疫霉菌分离培养过程中产孢量的影响进行了研究。[结果]循化线辣椒疫霉菌在24 h/天光照、pH为7.0、马铃薯培养基（PSA）和30℃条件下产孢量最大,其中pH、基础培养基和温度对产孢量影响较大。[结论]为循化线辣椒在自然界发病条件方面的研究奠定了基础。     

辣椒泛素交联酶cDNA的分离及其在UV-B作用下的表达分析

利用96孔板法从UV处理的辣椒叶片cDNA文库中分离获得了一个cDNA阳性克隆,其长度为678 bp,含有148个氨基酸的开放读码框,与马铃薯等其他植物的泛素交联酶基因有较高的同源性,命名为CaE21.荧光定量PCR分析表明CaE21基因在UV-B作用下转录表达水平降低;当UV-B照射停止后,其表达水平逐渐回升.推测该基因与辣椒适应UV-B照射胁迫有关.     

蓝塘猪和大白猪消减cDNA文库与差异基因分析

 【目的】寻找肉质性状候选优势表达基因,研究猪肉质优良性状的遗传基础和分子机制。【方法】利用抑制性消减杂交技术构建蓝塘猪和大白猪肌肉组织差异表达的消减cDNA文库,利用实时荧光定量PCR法研究基因的差异表达。【结果】获得61个有效克隆。对整个文库进行测序分析,获得47条有效序列。用BLAST在线软件与GenBank 和GenBank EST等数据库进行同源序列比较,发现其中有2条未知序列。对文库中所包含的MYL1、LDHA、KPNA3、TPM3、HUMMLC2B、GNTN和Oaz等基因进行了实时荧光定量PCR检测,结果显示MYL1、LDHA、KPNA3、TPM3和HUMMLC2B这5个基因在蓝塘猪肌肉组织的表达量显著高于大白猪（P＜0.05）;GNTN和Oaz基因在大白猪肌肉组织中的表达量显著高于蓝塘猪（P＜0.05）。【结论】很多EST与肉质有关的重要基因具有很高的同源性,这些基因在蓝塘猪和大白猪中表达差异显著（P＜0.05）。     

Identification of Differentially Expressed Genes in Sweetpotato Storage Roots Between Kokei No. 14 and Its Mutant Nongdafu 14 Using PCR-Based cDNA Subtraction

The contents of carotenoids in the storage root of sweetpotato, Ipomoea batatas (L.) Lam. vary dramatically among different cultivars. However, so far little is known about the regulation of carotenoids synthesis in sweetpotato. In our laboratory, we identified a novel sweetpotato mutant, Nongdafu 14, which is a homogenous mutant derived from the wild type Kokei No. 14. The contents of carotenoids in the storage root of Nongdafu 14 were analyzed using high performance liquid chromatography (HPLC), and it was found that the amount of carotenoids, b-carotene, lutein and zeaxantion, three major types of carotenoids in sweetpotato storage roots, increased 2–26 folds in Nongdafu 14 compared to Kokei No. 14. Suppression subtractive hybridization (SSH) was used to identify genes that were differentially expressed in Nongdafu 14, and a differentially expressed cDNA library was constructed using the cDNA of Nongdafu 14 storage roots as tester and that of Kokei No. 14 storage roots as driver. Out of the 1 530 clones sequenced, we identified 292 nonredundant ESTs. GO and KEGG analyses of these differentially expressed ESTs indicated that diverse metabolism pathways were affected and candidate genes involved in regulation of carotenoids synthesis are suggested.     

月季MYB基因cDNA全长克隆和表达分析

 【目的】克隆月季花色代谢相关新基因的全长cDNA序列,并分析其表达功能。【方法】根据月季花色突变体SSH文库分析得到的差异表达EST序列设计引物,采用RACE技术进行全长cDNA克隆。【结果】克隆到1 125 bp的cDNA全长,GenBank登录号为Eu082130。这一cDNA序列编码1个包含294个氨基酸的前体蛋白,它与小金海棠MxMYB1和大豆的GmMYB176 蛋白的保守区同源性分别为70%和58%,都是只有1个MYB结构;而与具有两个MYB结构域的棉花GhMYB26、拟蓝芥AtMYB305和金鱼草AmMYB340同源性很低。该蛋白的分子量为32.33 kD,等电点为9.65,分子式为C1387H2201N435O440S10 。半定量PCR 分析证实了该RhMYB1基因与CHS基因在红花突变体中比在黄花亲本中表达量高。【结论】推测该基因是一个转录因子,参与调控花青苷的合成。