中国柑橘叶斑驳病毒和碎叶病毒发生状况及其分子特性研究

柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus,CLBV)和柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)均可侵染柑橘的不同种。为明确CLBV及CTLV在中国柑橘上的发生状况和分子特性,采用RT-PCR技术对来源于中国7个省的342份和346份柑橘样品进行检测,检出率分别为9.6%和11.0%。对14个CLBV分离物和15个CTLV分离物的外壳蛋白(Coat protein,CP)基因部分序列分析显示,CLBV分离物间cp核苷酸和编码氨基酸序列相似性分别为82.1%~100%和88.1%~100%,CTLV分离物的cp核苷酸和编码氨基酸序列相似性分别为89.5%~100%和92.5%~100%。测定的14个CLBV分离物在系统进化树中聚为2个组;而CTLV分离物分组不明显,该病毒的系统进化与寄主来源无明显关系。     

芋花叶病毒的RT-PCR检测及外壳蛋白基因序列分析

 采用RT-PCR技术对采自中国湖北、浙江和山东的91份芋[Colocasia esculenta（L.）Schott]样品的芋花叶病毒（Dasheen mosaic virus,DsMV）进行了检测,检出率为26.4%。对其中14个DsMV分离物的317 bp扩增产物（为外壳蛋白基因的一部分）序列分析的结果显示,各分离物内的核苷酸变异相对较低,而分离物间存在较大的分子变异,相似性为68.3% ~ 97.8%。对来自湖北和浙江的2个DsMV分离物DsMV-SCS和DsMV-JH的外壳蛋白基因（coat protein gene,cp）进行了测序,全长分别为951 bp和987 bp,二者cp核苷酸和氨基酸序列相似性分别为79.0%和82.3%,与已报道DsMV的cp核苷酸和氨基酸序列相似性分别为73.0% ~ 92.1%和74.8% ~ 98.2%,在构建的系统发育树上聚在两个不同的簇,各DsMV分离物的系统进化关系与其寄主和地理来源无显著相关性。     

山东省芋花叶病毒病的田间调查及鉴定

为明确芋花叶病毒(Dasheen mosaic virus,Ds MV)在山东芋种植区的发生和遗传进化,在山东潍坊、青岛、烟台、日照和临沂等5个芋主栽区进行调查,对采集样品进行病毒病病原鉴定、序列分析和遗传进化分析。结果显示,芋花叶病毒的检出率为55.9%,在5个地区皆有分布。5个Ds MV分离物cp基因的核苷酸序列相似性为88.5%~91.9%,氨基酸序列相似性为93.4%~97.5%;与国内外已报道代表性Ds MV分离物cp基因的核苷酸与氨基酸的序列相似性分别为74.8%~99.4%、79.7%~99.1%。遗传进化分析显示,Ds MV山东分离物与日本分离物(Ds23)、中国分离物(ND和ZAN)和美国分离物(Ds MV-U2)亲缘关系较近,聚在同一分支。综上,Ds MV在山东省芋主栽区发生普遍,其cp基因序列之间变异相对较大。     

苹果茎痘病毒RT-PCR检测及分子变异分析

利用RT-PCR技术对采自6个苹果品种和7个梨品种的33个样本中的苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus, ASPV) 进行了检测, ASPV感染率为63% ( 19 /33) 。对6个ASPV中国分离物外壳蛋白(Coat protein, CP) 基因进行了扩增、克隆和测序, 测序结果显示CP基因全长为1 191 nt, 编码397个氨基酸。中国分离物与GenBank中其他分离物核苷酸序列同源性为70.2% ～91.7%。系统进化分析显示不同ASPV分离物分为3个大的类群, 呈现一定的寄主相关性, 并未呈现明显的地理相关性。第一和第三大类群的寄主皆为苹果, 第二大类群包含6个梨分离物和2个苹果分离物。不同ASPV分离物的抗原指数差异较大, 推断可能由于序列变异引起抗原表位变异, 从而引起血清型差异。     

重庆辣椒上番茄斑萎病毒的血清学检测及分子鉴定

为明确重庆地区辣椒上番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)的发生情况及其外壳蛋白基因(cp)序列变异特征,采用斑点免疫杂交法(Dot-ELISA)和反转录PCR(RT-PCR)技术对采自重庆的298份辣椒病毒病样品进行了检测和分子鉴定。Dot-ELISA检测结果表明,有40份辣椒样品检测到TSWV,检出率为13.42%。通过电子显微镜在TSWV检测呈阳性的样品中观察到具包膜的球状病毒粒体。设计扩增TSWV cp的引物,选取6个TSWV阳性样品进行RT-PCR扩增,均扩增到大小约750 bp的目的片段。序列分析表明,重庆辣椒分离物TSWV-CQ(KX611497)与已报道的22个TSWV分离物cp基因的核苷酸相似性为96.1%~99.4%,与已报道的TSWV中国分离物亲缘关系较近,表现出明显的地理相关性。     

柑橘鳞皮病毒3个分离物全基因组序列分析

运用转录组测序和RT-PCR方法克隆测定了柑橘鳞皮病毒（Citrus psorosis virus,CPsV）3个分离物CHN-1、CHN-2和CHN-3的全基因组。序列分析结果表明,CHN-1、CHN-2和CHN-3的基因组全长分别为11 282、11 279和11 278 nt,均包含4个开放阅读框。CHN-1、CHN-2和CHN-3之间的核苷酸相似性为93.48% ~ 95.98%,编码氨基酸相似性为98.18% ~ 98.86%;与6个已知国外CPsV分离物的外壳蛋白基因核苷酸序列相似性为85.83% ~ 95.23%,其对应氨基酸序列相似性为94.09% ~ 99.32%。系统进化分析显示CHN-1、CHN-2和CHN-3与地中海沿岸国家的CPsV分离物聚为一簇,可能具有共同的起源。     

砂糖橘上碎叶病毒外壳蛋白基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术对广东砂糖橘碎叶病毒的外壳蛋白(CTLV-CP)基因进行了克隆和测序分析。DNA序列分析表明,砂糖橘CTLV-CP基因的cDNA序列全长为786bp,编码262个氨基酸。BLAST分析结果显示,所得序列与苹果、梨茎沟病毒(ASGV)外壳蛋白基因及其它柑橘CTLV-CP基因的同源性在87%～91%,证明所克隆的片段为CTLV-CP基因。     

杨凌番茄黄化曲叶病毒外壳蛋白基因的克隆与其核心序列分析

以陕西杨凌番茄生产基地感病（TYLCV 症状）番茄植株为材料,分离得到杨凌番茄黄化曲叶
病毒分离物,命名为TYLCV-Yl（GenBank 序列号：KC293824,未公布）;克隆该病毒外壳蛋白全基因序
列CP 及其核心序列tCP;分析核心序列tCP 的特征、 进化特征;运用DNAMAN 多重比较了该病毒外壳蛋
白序列与其他18 个TYLCV-CP 核苷酸序列并且构建了基于CP 基因核苷酸序列的进化树。结果表明：获
得杨凌番茄黄化曲叶病毒（TYLCV-Yl）分离物,确定杨凌番茄黄化曲叶病毒源;获得TYLCV-Yl CP 全
基因序列核心序列tCP,为基于CP 抗TYLCV 奠定基础;tCP 核心序列非常保守,长度为 419 bp,编码
137 个氨基酸,其中在79～97 个氨基酸之间具有1 个跨膜结构;基于CP 基因构建的进化树可将番茄黄
化曲叶病毒分为3 个亚组：TYLCV 亚组Ⅰ,TYLCV 亚组Ⅱ,TYLCV 亚组Ⅲ,其中杨凌番茄黄化曲叶病毒
（TYLCV-Yl）属于TYLCV 亚组Ⅰ。     

侵染节瓜的3种病毒多重PCR检测体系的建立

 根据侵染节瓜3种病毒——小西葫芦黄花叶病毒（ZYMV）、番木瓜环斑病毒（PRSV）和黄瓜花叶病毒（CMV）的外壳蛋白基因保守区序列设计特异引物,在建立各种病毒单项PCR技术的基础上,通过优化多重PCR反应条件,初步建立了能同步、快速、灵敏地检测这3种病毒的多重PCR检测体系,为节瓜病毒病原的检测提供了理论与技术支持。     

新疆、甘肃和河南部分地区甜瓜瓜类蚜传黄化病毒分子变异初步分析

从新疆鄯善县、甘肃瓜州县和河南通许县采集表现瓜类蚜传黄化病毒(Cucurbit aphid-borne yellows virus,CABYV)症状的甜瓜叶片样品63份,利用反转录PCR(RT-PCR)检测,从阳性样品中选取25个分离物扩增出1.4 kb的片段,并对其序列进行分析。结果表明:63份样品中,36份为CABYV阳性;获得的序列包括部分3′端的依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)基因、非编码区(NCR)和全长外壳蛋白(CP)基因。随机选取25个分离物的CP基因与GenBank中的序列进行比对,其序列相似性为93.2%~100%。通许分离物间序列相似性为98.8%~99.8%,瓜州分离物间序列相似性为98.2%~100%,鄯善分离物间序列相似性为99.2%~100%,组内表现出极高的同源性。基于其部分RdRp基因、NCR及CP基因序列构建的系统进化树表明:25个CABYV分离物与中国及周边地区(泰国、韩国等)的分离物聚为一簇,而与欧洲地区分离物距离较远,说明了该病毒分子变异与分离物的地理分布有关。     

侵染广东辣椒的辣椒脉斑驳病毒的分子特征

辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus,ChiVMV）是引起广东辣椒病毒病的主要病原之一,为了明确侵染为害广东辣椒的ChiVMV分子特征,采用分段RT-PCR和RACE扩增方法克隆了ChiVMV广东分离物（ChiVMV-GD）的基因组全序列,结果表明,除poly（A）尾外,ChiVMV-GD基因组大小为9 721 nt,编码一个大小350.44 kD多聚蛋白（位于167 ~ 9 436 nt）,5′–非编码区（5′-UTR）和3′–非编码区（3′-UTR）分别含有166和285 nt,5′–末端结合病毒基因组连接蛋白（VPg）,3′–末端含有poly（A）尾。序列同源性分析结果表明：ChiVMV-GD与ChiVMV其他分离物的基因组序列同源率为79.1% ~ 96.9%,其中与来自中国海南分离物（登录号：GQ981316.1）的同源率最高（96.9%）。系统进化分析结果显示,ChiVMV-GD与海南分离物聚集在一个小分支,说明与海南分离物亲缘关系最近。     

贵州辣椒叶脉黄化病毒分离物检测及其P0、CP、MP基因进化分析

为明确辣椒叶脉黄化病毒（Pepper vein yellows virus,PeVYV）在贵州辣椒上的发生分布及其分子变异情况。用RT-PCR法对采自贵州省25个采样地点的548份辣椒疑似病毒病样品进行检测。结果表明：129份为阳性样品,检出率为23.54%。将获得的14个不同采样点PeVYV分离物和已报道的中国和其他国家PeVYV分离物进行序列比对,P0基因核苷酸同源性为90.9% ~ 100.0%,氨基酸相似性为97.7% ~ 100.0%;CP基因核苷酸同源性为93.7% ~ 100.0%,氨基酸相似性为97.9% ~ 100.0%;MP基因核苷酸同源性为94.7% ~ 100.0%,氨基酸相似性均为100.0%。在系统进化树中,有13个采样点PeVYV分离物P0基因聚在一起,与中国分离物（KP326573）的亲缘关系较近,而遵义播州PeVYV分离物与澳大利亚分离物的亲缘关系较近。贵州所有PeVYV分离物CP基因与中国、澳大利亚、美国和西班牙分离物聚为一支,但不同采样点的PeVYV分离物又聚为两个不同的分支。而不同采样点MP基因全部聚在一起,且与其他地区PeVYV分离物的差异不明显。研究结果表明贵州辣椒上不同地区PeVYV分离物具有一定的分子差异,存在遗传分化现象。     

海南冬瓜褐斑病病原鉴定

为了明确海南冬瓜种植基地发现的冬瓜新病害病原菌种类,将从澄迈县采集的病样进行分离纯化培养后观察分析。结果显示:该病害为冬瓜褐斑病,根据病原菌形态特征和致病性鉴定为多主棒孢〔Corynespora cassiicola(BerkCurt)Wei〕,序列比对结果与多主棒孢同源性为100%,且与不同地区的多主棒孢均属于同一分支,确定病原菌为多主棒孢。     

菠菜NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆及分析

依据已知NBS-LRR类抗病基因的P-loop和GLPL两个保守结构域设计简并引物,对抗菠菜霜霉病商业杂交种RZ51-147、自交系12S3和12S4的基因组DNA进行PCR扩增、克隆和序列测定,共获得23条具有完整开放阅读框且含有NBS结构的抗病基因同源序列(resistancegeneanalogs,RGAs),编号为SP1~SP17、SP19~SP24,其在NCBI中的登录号为KX914865~KX914887。核苷酸比较分析结果表明,这23条RGAs大多与甜菜中推测的一些抗病蛋白基因或其他相关蛋白基因具有较高的同源性,其中SP1、SP2、SP5、SP6、SP10、SP11、SP12、SP13等8条序列均与甜菜RF45类抗病蛋白有着86%以上的同源性;SP3、SP4、SP8、SP9、SP24等5条序列与甜菜RPP13类抗病蛋白的同源性在85%以上,与向日葵抗霜霉病基因PI8相应区域的氨基酸序列相似性为32.20%~33.52%,且在进化树上聚为一类,推测其可能与抗霜霉病相关。同源进化分析结果表明,除SP7外,其余序列均为non-TIR-NBS-LRR类抗病基因,并与推导的氨基酸序列多重比较结果一致。     

烟草花叶病毒山西番茄分离物的全基因组序列测定及分析

为明确山西省晋中市侵染番茄的病毒种类,采用双链RNA(double-stranded RNA,ds RNA)技术和非序列依赖PCR扩增(sequence-independent amplification,SIA)方法对感病番茄进行分子鉴定。序列测定及分析发现,具有花叶、卷曲症状的番茄为烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)所侵染。进一步克隆TMV番茄分离物(TMV-SXFQ)的全基因组序列,得到TMV-SXFQ(Gen Bank登录号为JX993906)全长为6 394 bp,含4个开放阅读框(open reading frame,ORF)。序列比对分析表明,TMV-SXFQ与烟草花叶病毒属其他分离物的同源性为86.3%~99.6%;系统进化分析表明,TMV-SXFQ与韩国分离物IM聚为一簇、亲缘关系最近。     

新疆哈密瓜病毒的DAS-ELISA检测和分子鉴定

为了明确当前新疆哈密瓜病毒病的主要毒原种类及其遗传分化,为哈密瓜病毒病害的防治提供科学依据,对吐鲁番、鄯善、昌吉等哈密瓜主产区的病毒病调查、采样,采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（DAS–ELISA）和RT-PCR技术对侵染哈密瓜的7种主要病毒及瓜类重要检疫性病毒--黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）进行检测和分子鉴定。结果表明：在所检测的121个样品中,黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）的检出率最高,为70.2%;西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus,WMV）和小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV）次之,分别为62.0%和37.2%,甜瓜坏死斑点病毒（Melon necrotic spot virus,MNSV）的检出率仅为2.5%,CGMMV、南瓜花叶病毒（Squash mosaic virus,SqMV）、番木瓜环斑病毒（Papaya ring spot virus W,PRSV-W）和烟草坏死病毒（Tobacco necrosis virus,TNV）未检测到。CMV、WMV、ZYMV在田间分布广泛,2种及3种病毒的复合侵染发生普遍（60.19%）。对各病毒分离物进行CP基因扩增、序列测定和系统发育分析,确定了CMV新疆哈密瓜分离物归属于CMV亚组ⅠB。ZYMV、WMV和MNSV与已报道的病毒株系CP基因核苷酸序列具有较高的同源性,但存在一定的变异,ZYMV和WMV具有明显的地域分化现象。     

四川地区猕猴桃病毒1的RT-PCR检测及外壳蛋白基因序列分析

为了明确近期新西兰报道的侵染猕猴桃的新病毒——猕猴桃病毒1（Actinidia virus 1,AcV-1）在四川地区猕猴桃上的发生情况及其分子特性,采用RT-PCR对来自四川6个地区疑似感染病毒的90份猕猴桃主栽品种‘红阳’和‘金果’的叶片样品进行检测。结果表明,22份样品为AcV-1阳性,检出率为24.4%。将获得的5个AcV-1分离物和已报道的新西兰分离物K75的外壳蛋白（coat protein,CP）基因序列进行比对,结果表明,分离物间核苷酸序列和氨基酸序列的相似性分别为84.8% ~ 97.1%和89.7% ~ 99.6%,其中除邛崃分离物HYH5与新西兰分离物K75的核苷酸序列相似性较高（97.1%）外,其余4个分离物均低于91%。系统进化分析结果显示,这些分离物主要聚集在3个分支上,分离物HYH5与新西兰分离物K75位于同一分支,其余分离物位于另外2个分支。     

冬瓜和节瓜种质资源遗传多样性的RAPD分析

采用RAPD分子标记技术对41份冬瓜和节瓜种质资源进行遗传多样性分析。从455条随机引物中筛选出23条能产生稳定多态性扩增谱带的引物用于RAPD分析,共产生143条扩增谱带,其中多态性谱带81条,多态性检测率为56.6%,表明冬瓜和节瓜种质资源在分子水平上具有丰富的遗传多样性。用NTSYSpc软件处理RAPD数据,41份材料间的遗传相似系数在0.60～0.99之间。聚类分析结果可将供试材料分为6大类群9个亚类,主坐标分析可将供试材料分为6大类群10个亚类。两种分类方法的结果基本一致。     

黄瓜上甜瓜黄斑病毒寿光分离物的初步鉴定及序列分析

在山东寿光黄瓜保护地种植区采集到疑似感染甜瓜黄斑病毒(Melon yellow spot virus,MYSV)的黄瓜病叶,采用RT-PCR对其进行检测,将扩增产物连接到pEASY-T1 Simple克隆载体后进行测序,结果显示目的片段的大小为505bp,与预期结果一致;序列同源性比对分析结果表明,黄瓜上MYSV寿光分离物与中国三亚的MYSV-Sanya分离物(甜瓜-GQ397254)和中国台湾MYSV-TW(西瓜-FJ386391)亲缘关系较近,同源性可达到98%。     

北京地区南瓜病毒病病原种类鉴定

为明确北京地区南瓜病毒病种类及其主要侵染病原,2016~2017年在北京周边采集疑似感染病毒的南瓜病样84份,并根据南瓜上的6种病毒特异性引物对其进行反转录PCR(RT-PCR)检测。结果表明:共有79份南瓜病样检测显示阳性,其中黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的检出率最高,为52.38%;其次是小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)和西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV),检出率分别为44.01%、14.29%,其他病毒暂未检出。此外,16.67%的样品受2种病毒复合侵染,CMV和ZYMV复合侵染占7.14%,ZYMV和WMV复合侵染占9.52%。北京地区南瓜上优势病毒种类为CMV,且存在病毒复合侵染现象。