辣椒GMS育性相关miRNA的鉴定和表达分析

研究辣椒花药中sRNA分布,筛选育性相关miRNA,通过miRNA及其靶基因的表达分析探讨miRNA对雄性育性的调控。利用高通量测序技术对辣椒细胞核雄性不育两用系处于小孢子单核靠边期的花药进行sRNA测序,同时分析两材料间miRNA的表达差异。通过qRT-PCR技术验证差异分析结果,并对miRNA及其靶基因在小孢子发育不同时期的表达模式进行分析。在构建的不育株和可育株两个文库中共发掘出857个可信度高的miRNA;筛选得到42个表达差异显著的miRNA;通过靶基因预测与注释,预测出的差异表达miRNA的靶基因中与繁殖有关的基因有152个,与生殖过程有关的基因有151个。通过qRT-PCR验证了选出的9条miRNA的存在,其表达差异与测序分析结果基本一致;单核靠边期多数miRNA负调控其靶基因,不同发育时期其调控模式会发生变化。本研究为揭示辣椒miRNA与雄性育性的关系提供了重要信息。     

异源表达拟南芥赤霉素2–氧化酶基因对矮牵牛形态发育的影响

拟南芥赤霉素2–氧化酶基因AtGA2ox1在矮牵牛（Petunia hybrida）中过量表达导致转基因植株开花延迟,株形明显矮化,花冠变小,花冠表皮细胞变小,但花色变化不明显。施用多效唑对矮牵牛花冠的影响与过量表达AtGA2ox1一致。用拟南芥茎特异性表达基因At3g56700的启动子驱动AtGA2ox1在矮牵牛中表达时,转基因植株的表型变化在株系间存在明显的差异,但外源基因在茎中的表达量都明显高于叶和花中的,果实和种子的发育未受影响,通过对转基因后代的筛选可以获得株形矮化,其它性状的发育受影响较小的转基因株系。     

拟南芥At-pri-miR828 基因的克隆及其对番茄的遗传转化

 MicroRNA828（miRNA828）是一种新近发现的生物学功能还未全面研究的miRNA。为从 不同角度阐明miRNA828 的生物学功能,从拟南芥中克隆到At-pri-miR828 基因并构建了该基因过量表达 的植物表达载体pC2300-pOT2-At-pri-miR828,通过农杆菌介导的叶盘法将pC2300-pOT2-At-pri-miR828 导入异源植物番茄品种‘Ailsa Craig’中。PCR 鉴定结果显示,外源基因At-pri-miR828 已成功整合到转 基因番茄基因组中,共获得9 个转基因株系,67 株转基因植株。定量PCR 检测结果显示,与野生型番茄 植株相比,转基因植株中miR828 的表达量显著增加,而生物信息学所预测的miR828 靶基因Sly-myb-like1 的表达水平则相应降低。花青素含量测定结果显示,miR828 过量表达的转基因番茄植株花青素含量明显 低于野生型植株,表明miR828 参与了番茄花青素的生物合成调控。     

桃PpIDD11调控花发育的功能研究

从‘秋蜜红’桃中克隆到1个IDD转录因子基因PpIDD11。结果显示：PpIDD11编码区全长1 575 bp,编码524个氨基酸,具有保守的ID域。烟草亚细胞定位显示PpIDD11蛋白定位于细胞核,酵母转化试验表明其具有酵母转录自激活活性。荧光定量PCR分析显示PpIDD11主要在花器官中表达,特别在雌蕊中转录水平最高。过表达PpIDD11拟南芥株系出现了柱头高于野生型、荚果变短且结实率下降的表型,同时也出现了莲座叶叶片卷曲、植株变矮的现象。转录组测序分析显示,PpIDD11转基因拟南芥株系共有上调基因3 378个,下调基因3 156个,其中包含LOX4、LOX3、GLC、E6L1等花器官发育调控基因。     

山茶花CjAPL1基因正义表达载体的构建及对拟南芥的转化分析

 为研究山茶花CjAPL1基因对于重瓣花形成的作用,构建了pCAMBIA1300-CjAPL1正义植物表达载体,酶切结果显示,CjAPL1基因正向插入pCAMBIA1300的启动子和终止子之间,表明CjAPL1植物表达载体构建成功。将pCAMBIA1300-CjAPL1采用农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥,获得转基因阳性植株65株。随机挑选表型变异明显的3株进行PCR扩增都得到了目的条带,Southern杂交鉴定进一步确认为转基因阳性植株。同时荧光定量检测到在转基因植株中CjAPL1基因表现出较对照显著提高6 ~ 25倍的表达量。转基因阳性植株表型变异明显,花柱和雄蕊数相比野生型各增加1枚和1 ~ 4枚,萼片边缘发育成白色的瓣化状,表明在拟南芥中过量表达CjAPL1基因可以引起花器官形态的变异和数量的变化,因此该基因在花器官形成和重瓣花发育中具有显著的调控功能。     

利用人工miRNA沉默StIAA22对马铃薯根系构型的影响

通过检测26个StIAA家族基因在马铃薯根系发育过程中的表达发现:18个StIAA基因在根系成熟后的表达量比发育初期显著上调,8个StIAA基因变化不显著。利用人工microRNA(artificial microRNA,amiRNA)技术对上调表达最为显著的StIAA22做进一步的功能研究:构建干扰表达载体pBI121-amiRIAA,通过根癌农杆菌介导法转入马铃薯栽培品种‘Dèsirèe’。经定量PCR检测,StIAA22在所有转基因株系中的表达均受到明显抑制;其根系形态构型与非转基因植株差异明显,根系生长受到抑制,根长明显变短,侧根数量增加,根系生物量减少。以上结果表明StIAA22在调节马铃薯根系形态建成中起关键作用。     

大白菜耐旱相关基因BpNFYA5 的克隆及功能初步分析

 以拟南芥（Arabidopsis thaliana）NFYA5 基因（GenBank 登录号：At1g54160）的序列为基准,通过比对获得芸薹属大白菜[Brassica campestris L. ssp. pekinensis（Lour.）Makino]同源EST 序列;采用电子克隆的方法从大白菜中克隆到相关基因全长序列,命名为BpNFYA5。该基因包含3 个内含子,其推导蛋白与拟南芥NFYA5 CCAAT-box 结合域相似性达92.6%。对大白菜进行干旱胁迫,发现BpNFYA5显著上调表达。构建了植物过表达载体pBIn-NFYA5 和RNA 干扰载体pFGC-NFYA5,通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导浸花法转化拟南芥。经除草剂、潮霉素筛选及PCR 鉴定获得转基因植株。采用干旱和10% PEG6000 模拟亏水胁迫,对转基因材料的T2 代进行了耐旱性鉴定。结果显示：过表达植株（OL）较野生型植株（WT）和干扰表达植株（Ri）叶绿素含量高;渗透胁迫下OL 植株脯氨酸含量迅速积累,积累量显著高于WT 和Ri 植株;控水干旱2 周OL 株系较WT 及Ri 材料具有更好的干旱耐受性;OL 株系离体叶片的失水速率较小,叶片有效水分利用率较WT 和Ri 高。结果表明所克隆的基因BpNFYA5 在亏水胁迫调控中具有抗旱作用。     

芥蓝八氢番茄红素脱氢酶基因BaPDS1和BaPDS2的克隆与表达分析

以白花芥蓝为材料,采用反转录PCR技术克隆得到2个八氢番茄红素脱氢酶基因BaPDS1和BaPDS2,GenBank登录号为KX426039和KX426040,其开放阅读框分别为1 692和1 698 bp,分别编码563和565个氨基酸。同源性及进化树构建结果表明PDS蛋白在进化过程中比较保守,芥蓝PDS基因与甘蓝、白菜、花椰菜等十字花科蔬菜亲缘关系较近。半定量PCR分析发现,BaPDS1和BaPDS2表达水平在芥蓝不同发育时期和组织器官间均存在显著差异。萌动种子期BaPDSs表达量较低,之后迅速上升;BaPDS1在成熟期器官间呈现组成型表达,BaPDS2在器官间表达差异较大,幼果中未检出;花器官中萼片的BaPDSs表达量显著低于其他组织,在开花过程中,雄蕊和雌蕊的BaPDS1表达水平出现上调。     

miRNA调控园艺作物生长发育研究进展

miRNA(microRNA)是真核生物中广泛存在的内源性非编码小RNA，通过碱基互补配对与靶基因的mRNA结合，切割靶mRNA或者抑制靶mRNA的翻译来抑制靶基因的表达。本研究综述了miRNA调控园艺作物生长发育的研究进展，重点阐述了miRNA在园艺作物根、叶、花、果实等器官发育过程中的重要作用。     

枇杷LFY同源基因植物表达载体构建及其功能分析

为研究枇杷LFY同源基因的功能,构建了含枇杷LFY同源基因ejLFY的植物表达载体pBI121-ejLFY,并转入到农杆菌GV3101中。利用花序侵染法将该基因导入拟南芥,经抗性筛选、PCR检测表明获得了25个转化株系。与对照相比,大部分转基因植株明显早花,成花时间可提早1周左右,莲座叶数目减少2-3片;部分植株侧生花序全部转变成单独的花,从莲座叶中抽出的花枝也全部转变为单独的花;少量转化株系花器官异常,不能形成种子。这表明枇杷LFY同源基因在其成花过程中起重要作用,为了解枇杷的成花分子机制奠定了基础。     

桃ABA 8’–羟化酶基因PpeCYP707As在拟南芥中过表达的功能分析

以8年生‘中油4号’油桃为试材,对休眠期的枝条进行ABA和GA处理发现,ABA延迟芽体萌动,GA促进萌芽和提前开花,在桃芽萌发中ABA和GA起拮抗作用。利用转基因技术在拟南芥中过表达桃ABA分解代谢关键酶ABA 8’–羟化酶基因PpeCYP707A1、PpeCYP707A2和PpeCYP707A3,获得纯合株系,RT-PCR结果表明,目的基因在过表达株系中的表达量分别达到对照的23.86倍、7.37倍、3.23倍;过表达株系生长缓慢,抽薹、开花延迟,其中过表达PPECYP707A1株系生长最慢,开花最晚;过表达株系种子萌发和幼苗生长对ABA不敏感,受伤害程度小;10℃低温处理试验证明,过表达株系相对生长速率高于野生型,推测低温条件下,过表达CYP707As正调控拟南芥的生长发育。     

梨糖转运相关基因PbTMT4启动子克隆及功能分析

以‘砀山酥梨’(Pyrus bretschneideri‘Dangshan Suli’)为材料,利用梨基因组数据库,通过PCR获得了糖转运相关基因PbTMT4(Pbr032130.1)2 211 bp的CDS序列及其编码起始位点上游长度为1 220 bp的启动子序列。使用农杆菌介导法将PbTMT4导入拟南芥,与野生型对照植株相比,转基因拟南芥植株的生长速度更快,抽薹、开花时间更早,叶片糖积累量更高。生物信息学分析表明,该启动子中含有多个与逆境应答、激素信号和光信号相关的顺式作用元件。为进一步分析PbTMT4启动子功能,构建了该启动子与GUS基因融合的植物表达载体并转化拟南芥。对T_3代转基因拟南芥各组织进行GUS活性染色和半定量分析,发现GUS基因在根、茎、叶、花和果荚中均有表达,NaCl、干旱、GA_3、MeJA以及光照处理均能一定程度上提高转基因拟南芥中GUS基因的转录水平。逆境处理发现,PbTMT4转基因株系较野生型植株受到的伤害小。研究结果初步表明,PbTMT4可促进转基因拟南芥发育并提高糖积累量,可能在抗非生物胁迫中起重要的调控作用。     

MdMYB73的分子克隆及其在苹果愈伤组织和拟南芥幼苗中的盐抗性功能鉴定

从‘嘎拉’苹果中克隆了一个MYB转录因子基因(序列号:MDP0000894463)。该基因包含长为729 bp完整的开放阅读框,编码243个氨基酸,预测其蛋白质分子量为26.34 kD,等电点为9.29。系统进化树分析表明,这一MYB转录因子与拟南芥AtMYB73同源序列相似性最高,因此将其命名为MdMYB73。功能域分析表明,MdMYB73蛋白含有保守的R2R3-typeMYB绑定域。荧光定量PCR分析表明,MdMYB73在苹果的各个组织均有表达,在叶片和花中表达相对较高;MdMYB73的表达明显受盐胁迫的诱导。将异位表达MdMYB73的拟南芥幼苗进行抗盐鉴定,结果表明MdMYB73负调控拟南芥盐胁迫抗性;同时,AtSOS1,AtSOS3和AtNHX1抗盐相关基因的表达水平显著降低,表明MdMYB73可能负调控SOS反应,影响拟南芥抵抗高盐胁迫过程。将MdMYB73基因遗传转化苹果愈伤组织,抗盐表型分析表明,MdMYB73过量表达也明显降低了转基因愈伤组织对盐胁迫的抗性。     

苹果MdRGL3a基因的功能分析

为进一步揭示苹果(Malus×domestica)中GA信号转导机制以及MdDELLAs的生理功能,以‘嘎拉’苹果为试材,克隆基因MdRGL3a(GenBank:DQ007887),并通过在拟南芥中过量表达,分析该基因的功能。qRT-PCR结果表明,MdRGL3a在苹果不同组织中都有表达,其中在花和果实中表达量较高。在拟南芥中异位表达MdRGL3a,表现为根长和下胚轴变短,种子萌发较慢,叶片变小,植株矮化。过表达MdRGL3a拟南芥植株对赤霉素介导的生长反应敏感性降低,证明MdRGL3a是GA信号途径中的一个负调控因子。     

苹果MdAFS叶绿体定位表达对拟南芥萜类挥发物的影响

以‘青香蕉’苹果(Malus×domestica‘White Winter Pearmain’)α–法尼烯合酶基因(MdAFS)为目标基因,构建叶绿体定位的植物过表达载体,并通过农杆菌介导遗传转化拟南芥,获得使MdAFS在叶绿体中过表达的拟南芥转基因株系。将pBI122-rbcS1-pla-MdAFS-GFP表达载体瞬时表达本氏烟,分析表明叶绿体定位肽能成功将MdAFS蛋白定位到叶绿体中。定量测定莲座期和盛花期拟南芥光合色素,结果显示,转基因拟南芥叶绿素和类胡萝卜素含量较野生型显著增加。qRT-PCR分析萜类代谢相关基因转录表达水平表明,尤其在盛花期,过表达MdAFS能显著影响萜类代谢基因表达上调。应用静态顶空固相微萃取法收集拟南芥挥发物并结合GC–MS分析鉴定萜类挥发物成分,转基因拟南芥中萜类挥发物含量和种类明显增加。这些结果表明,过表达MdAFS能显著影响萜类代谢流的重新定向,增加萜类代谢挥发物。叶绿体是萜类代谢工程一个理想的亚细胞空间。     

超表达MdFLS2的拟南芥fls2突变体识别细菌鞭毛蛋白,提高对轮纹病菌的抗性

以红肉苹果‘紫红3号’愈伤组织为试材,克隆了细菌鞭毛蛋白受体基因MdFSL2,研究了其与拟南芥AtFLS2对细菌鞭毛蛋白敏感性差异以及对苹果轮纹病抗性的影响。进化树分析表明,MdFLS2与拟南芥AtFLS2亲缘关系较远,处于不同的进化树分支,与梨PbFLS2的亲缘关系最近。时空表达特异性研究表明,在苹果叶片中MdFLS2表达不随组织衰老而产生差异,能够被外源SA处理诱导,不受IAA、ACC处理影响;在根系中表达量最高,而在花与果实中表达量较低。在拟南芥中异源过表达MdFLS2,显著抑制植株生长,并出现叶片边缘枯死或细胞死亡的表型。在转基因拟南芥中受SA诱导的病程相关基因AtPR1、AtPR2和AtPR5,及衰老相关基因AtORE1和AtNAP的表达水平均显著高于野生型。为研究MdFLS2是否具有感知细菌鞭毛蛋白的能力,进行拟南芥根系生长抑制试验,MdFLS2超表达恢复了细菌鞭毛蛋白N端22个保守氨基酸肽段(flg22)对拟南芥fls2突变体根系生长的抑制作用,但flg22分别处理30和60 min,或20和40 min,flg22诱导的标志性基因表达水平及MAPK激酶活化水平在过表达MdFLS2的fls2突变体中显著低于同样处理的野生型。超表达MdFLS2提高了拟南芥叶片对轮纹病菌的抗性,并增强了拟南芥突变体fls2对假单胞菌DC3000的抗性。研究结果说明苹果MdFLS2是一个有功能的免疫相关基因,MdFLS2与AtFLS2在具体执行功能与作用机制上可能存在差异。     

桃乙烯应答因子PpERF1a的克隆与功能分析

以‘丰光’油桃嫩梢组织为试材,克隆了1个ERF家族基因并命名为PpERF1a(ppa018178m)。该基因全长为600 bp,编码199个氨基酸,含有1个典型的AP2结构域。亚细胞定位结果显示PpERF1a定位于细胞膜和细胞核。在拟南芥中超量表达PpERF1a,共获得15个阳性转基因株系。与对照相比,转基因植株出现发育不良的表型,其中6株持续长出莲座叶,但不抽薹;6株能够抽薹开花,但不结实且生长势明显弱于对照;3株能够开花结实,但种子产量极低。这些结果表明PpERF1a在转基因拟南芥中具有调控生长发育的功能,为后期在桃中开展PpERF1a的功能研究提供了有益的启示。     

苹果乙烯信号转导相关基因MdEIL1的克隆及功能鉴定

以苹果‘嘎拉’（Malus × domestic‘Royal Gala’）为试材,分离了乙烯信号转导相关的MdEIL1基因（基因序列号：MDP0000423881）。序列分析表明,该基因包含长为1 980 bp完整的开放阅读框,编码658个氨基酸的蛋白。进化树分析表明MdEIL1属于EIN3/EIL转录因子家族蛋白。定量分析显示,MdEIL1基因在苹果的根、茎、叶、花和果实中有不同程度的表达,而且它的表达也受到乙烯、生长素和细胞分裂素的诱导。通过原核表达试验体外诱导MdEIL1蛋白成功,为后续蛋白功能鉴定奠定了基础。MdEIL1基因在拟南芥中异位表达,增强其乙烯响应,在暗处表现为下胚轴变短,并且AtERF1的表达量上升,显示转基因植株对乙烯的敏感性提高。