大肠杆菌感受态细胞制备及转化研究现状

大肠埃希氏菌(Escherichia coli,E.coli)又称大肠杆菌,因结构简单、遗传背景明确而成为基因克隆实验中最常用的受体菌种。感受态细胞的制备与转化是生物转化实验中的重要环节,大肠杆菌感受态细胞的转化效率直接影响携带目的基因的重组质粒能否导入受体细胞,表达出新的遗传性状。大肠杆菌感受态细胞(competent cells)制备常采用物理或化学方式改变细胞膜通透性,诱导受体菌摄取外源性DNA并整合入受体菌。此外,细菌细胞密度值(OD_(600))、转化液浓度、热激参数、培养条件等因素也影响转化效率。综述了国内外大肠杆菌感受态细胞的制备及转化方法,以期为各大实验室制备和转化大肠杆菌感受态细胞提供参考。     

大肠杆菌感受态细胞的少量制备方法及转化条件研究

[目的]提高大肠杆菌感受态细胞的转化效率。[方法]根据普通实验室的试验条件,总结出1种少量制备大肠杆菌感受态细胞并高效率转化质粒的方法。[结果]利用该方法少量制备大肠杆菌感受态细胞,在OD600nm值为0.3～0.6时均可达到高转化率的效果。与常用的大量制备法相比,该方法的转化率提高100～300倍。[结论]该方法简单方便、重复性好、转化效率高、成本低,能够满足基因库的构建、分子克隆等研究的要求,是从事基因克隆研究方面的科研人员的良好选择。     

大肠杆菌感受态细胞保存条件的研究

研究了保存时间、温度和抗冻剂对大肠杆菌感受态细胞保存的影响。结果表明：在4℃-、40℃、-70℃条件下,大肠杆菌感受态细胞转化效率在保存前期随保存时间增加呈上升趋势,转化效率在第1天或第7天达到最大值,此后随保存时间增加而呈下降趋势;在保存前期,保存于4℃的大肠杆菌感受态细胞转化效率高于保存在-70℃、-40℃的大肠杆菌感受态细胞的转化效率,在保存后期低于保存在-70℃、-40℃的大肠杆菌感受态细胞的转化效率;在相同保存温度和保存时间下,保存在甘油的大肠杆菌感受态细胞转化效率高于保存在DMSO的大肠杆菌感受态细胞的转化效率。     

大肠杆菌感受态细胞制备及转化条件优化

针对大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α,以pGM－T、pMD－18T为载体,在传统CaCl2方法的基础上,对制备及转化条件进行了改进和优化,结果表明,42℃热激的最佳时间为100 s,最适冷却时间为6～8 min。本研究将常规的50 mL离心管改成了1．5 mL EP管,有效降低了分装过程中可能产生的污染风险,简化了试验程序,提高了转化效率。     

温度对大肠杆菌感受态细胞的影响

在不同的培养温度下制备一系列大肠杆菌感受态细胞，并选取其中一组感受态细胞在4种不同的温度下保存，对培养温度与大肠杆菌感受态形成的关系以及感受细胞在不同保存温度下的保持情况进行了研究。结果表明，不同培养基温度下大肠杆菌生长出现高峰期不同。其中，18℃和25℃，出现于对数期早期，而30℃和37℃则出现于对数期中后期。在25℃条件下转化效率最高。感受态细胞在4种不同温度条件下保存，受活菌数和感受态2种因素的影响程度都不同。转化效率在前期都有不同程度的提高，液氮条件下保存感受态细胞时间最长。     

长期保存活力低下的大肠杆菌制备感受态细胞条件的优化

研究了Ca Cl2溶液处理方法、长期保存的原始菌种活化次数、离心条件对感受态细胞最终转化效率的影响,并分析其最佳转化效率参数、优化感受态制备和转化方法。结果发现:使用过滤处理的Ca Cl2比灭菌处理的Ca Cl2制备的感受态细胞转化效率高。在其他条件相同的情况下,长期保存的大肠杆菌菌种活化3次以上的转化率最高;制备感受态细胞第1次离心在4℃、4 000 g条件下离心15 min,第2次离心时在4℃、4 000 g条件下离心5 min得到的感受态细胞转化率最高。     

一种简捷有效的大肠杆菌感受态细胞制备方法

[目的]探索建立简捷快速有效的大肠杆菌感受态细胞制备方法。[方法]在已有的TSS法基础上进行了进一步的改进,建立了一个只需一步室温离心便能够获得与常规方法效价相近,能够长期保存的大肠杆菌感受态细胞的制备方法。[结果]新方法制备的感受态细胞每微克转化菌落数达105~106个,可以满足在质粒中进行的常规克隆需要。不同冻存时间对新方法制备的感受态细胞转化效率无显著影响。新方法制备的感受态细胞可以立即使用也可以于-80℃下长期保存至少9个月不会影响其转化效价。这也与常规CaC l2法制备的感受态细胞性能相当。[结论]该方法为一次大量制备并长期保存使用感受态细胞奠定了基础。     

高效JM109感受态细胞制备及转化条件的优化

采用不同的转化液制备大肠杆菌(Escherichia coli)JM109感受态细胞,并进行pUC18质粒的转化,考察细菌生长状态、转化液、转化的热激时间和转化后所用培养基对转化率的影响.结果表明,菌液A600nm为0.705时采用TB转化液制备感受态细胞,在42℃热激45 s,转化后采用SOC培养基振荡培养,转化效率最高,可达8.59×108 CFU/μg质粒.     

大肠杆菌HB101感受态细胞制备条件的优化

为探讨大肠杆菌HB101感受态细胞制备的最优条件,从菌种来源、感受态细胞的生长状态及其储存方式等3个方面进行了优化。结果表明：从-70℃冰箱中保存的菌种活化大肠杆菌HB101,当细胞的OD600值为0.3～0.4时制备感受态,4℃冰箱放置1d,-70℃下放置1个月,均可获得较高的转化效率,每微克DNA最高可达1.18×107cfu。     

影响禽致病性大肠杆菌信号分子AI-2产生的因素分析

【目的】探讨禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic Escherichia coli, APEC)在不同生长时期和不同培养条件下,信号分子AI-2(Autoinducer-2, AI-2)的合成与luxS和pfs的转录水平之间的关系。【方法】利用哈维弧菌BB170（vibrio harveyi BB170）检测不同生长时期和不同培养条件下APEC的AI-2活性。同时利用Real-time PCR检测APEC不同生长时期和不同培养条件下luxS和pfs的转录水平。【结果】APEC在不同生长时期的AI-2活性与luxS的转录水平保持一致。培养基中加入葡萄糖,麦芽糖和NaCl后,AI-2活性和luxS转录水平都上调,加入蔗糖后则都下调,两者保持一致性。AI-2活性与pfs的转录水平则并不一致。【结论】APEC的AI-2产生水平与luxS的转录水平有高度的相关性,而与pfs的转录水平没有显著相关性;葡萄糖、麦芽糖和NaCl,促进AI -2的合成。     

纳米蒙脱石对大肠杆菌吸附作用的研究

采用纳米蒙脱石和普通蒙脱石与大肠杆菌的体外对比吸附检测的方法，结果发现纳米蒙脱石的吸附能力明显提高，为纳米蒙脱石应用于医药领域提供了证据。     

鸭大肠杆菌药敏试验研究

新疆米泉某鸭场12日龄雏鸭大量发病死亡,根据临床症状、病理变化、细菌分离鉴定,确诊为鸭大肠杆菌病。对该菌的18种临床常用抗菌药物进行药敏试验,结果表明:头孢唑林、诺氟沙星对分离菌株敏感性最好,抑菌圈直径为20～21 mm;链霉素、恩诺沙星中等敏感;硫酸新霉素低敏感;其余药物不敏感。     

致病性大肠埃希菌对头孢噻呋的耐药性研究

[目的]以头孢噻呋为底物将大肠埃希菌标准菌株诱导为耐药菌株,研究诱导的耐药菌株对头孢噻呋产生耐药性的机制。[方法]用亚抑菌浓度法对标准菌株C83907和C83845进行诱导,诱导10代后用双纸片法和PCR扩增法,进行超广谱β-内酰胺酶（Extendspectrumβ-lactamses,ESBLs）检测;用试管2倍稀释法测定头孢噻呋对产ESBLs菌株的最小抑菌浓度值;对产生ESBLs的耐药菌株,用试管2倍稀释法测定了头孢噻呋与他唑巴坦钠以不同配比对产生ESBLs大肠埃希菌的最小抑菌浓度。[结果]诱导15代后,头孢噻呋对诱导菌的MIC值8～10μg/ml,且均检测出ESBLs;头孢噻呋与他唑巴坦钠质量比（1∶1～8∶1）联合使用对产生ESBLs的大肠埃希菌的最小抑菌浓度较头孢噻呋单独使用降低20～22倍。[结论]致病性大肠埃希菌对头孢噻呋产生耐药性的主要机制是产生了ESBLs。     

动物源大肠埃希氏菌QnrS阳性株体内氟喹诺酮药物蓄积的研究

【目的】研究氟喹诺酮类药物在动物源大肠埃希氏菌QnrS阳性株体内蓄积量的变化规律,探讨主动外排机制在携QnrS菌株中的作用。【方法】采用肉汤微量稀释法测定QnrS阳性株对氟喹诺酮类药物的MIC,荧光测定法检测盐酸环丙沙星在QnrS阳性株体内浓度的变化及能量抑制剂碳酰氰间氯苯腙(CCCP)对菌体内药物蓄积的影响。【结果】动物源大肠埃希氏菌QnrS阳性株对氟喹诺酮药物的敏感性存在明显差异,均对盐酸环丙沙星的蓄积呈能量依赖性降低,其中以耐药株体内的药物浓度降低最为明显。加入能量抑制剂后,耐药株体内的药物浓度上升程度明显高于敏感株,但均达不到标准株体内药物浓度水平。【结论】主动外排泵的激活,使受试菌体内盐酸环丙沙星减少并低于有效浓度,从而影响QnrS介导的氟喹诺酮类耐药性。