家蚕脂肪体原代细胞的有丝分裂观察

取家蚕4-5龄幼虫背部脂肪体,采用胰蛋白酶消化法,在28℃,pH6.4-6.8的条件下,用Grace培养基辅以20%的标准胎牛血清进行家蚕脂肪体细胞原代培养.原代细胞培养6个月后,观察到了家蚕脂肪体细胞的3种有丝分裂过程及其特征.     

家蚕脂肪体原代细胞的有丝分裂观察

取家蚕4～5龄幼虫背部脂肪体,采用胰蛋白酶消化法,在28℃,pH 6.4～6.8的条件下,用Grace培养基辅以20%的标准胎牛血清进行家蚕脂肪体细胞原代培养.原代细胞培养6个月后.现察到了家蚕脂肪体细胞的3种有丝分裂过程及其特征.     

绵羊肌内脂肪前体细胞的体外培养及分选

为建立绵羊肌内脂肪前体细胞的体外培养模型,选用组织块法培养绵羊肌内脂肪前体细胞,制备用荧光染料PE(Phycoerythrin)标记的兔抗绵羊Pref-1蛋白的多克隆抗体,通过流式细胞术分离纯化脂肪前体细胞,对纯化后的细胞进行诱导分化以及油红O染色鉴定。结果表明:利用流式细胞仪能分选纯化出被标记的肌内脂肪前体细胞且分选率近30%;纯化后得到的细胞是功能活跃的脂肪前体细胞。研究表明,用绵羊羔羊肌肉组织采用组织块培养法可以建立绵羊肌内脂肪前体细胞培养模型,抗绵羊Pref-1蛋白多克隆抗体可以作为纯化脂肪前体细胞的工具。     

人脂肪干细胞体外增殖的安全性评价

目的探讨体外培养条件下增殖的人脂肪干细胞是否具有做为种子细胞的安全性。方法体外分离、培养人脂肪干细胞并传代,观察其生物学特性,分别对第4代及第12代的人脂肪干细胞用TRAP法检测端粒酶活性,并进行染色体核型分析。结果新鲜分离和传代的人脂肪干细胞在体外培养12代的端粒酶活性呈阴性或者低水平表达,且未见染色体核型的改变。结论体外分增殖过程中,人脂肪干细胞的端粒酶活性及染色体核型未发生异常变化,符合作为种子细胞安全性的要求。     

山羊松果体细胞原代培养及其生物学特性研究

目的:观察体外培养山羊松果体细胞的增殖情况和功能状态．为进一步提高季节性繁殖动物的繁殖率提供理论基础。方法:对松果体细胞进行培养,倒置显微镜下观察细胞形态,MTT法检测细胞增殖情况,5-HT免疫组织化学染色显示细胞的功能状态。结果:松果体细胞呈圆形或多角形,折光性强,细胞体积有增大趋势;细胞有明显的增殖现象,大约于11d达到高峰;5-HT阳性细胞数量随细胞的增殖而增加。结论:山羊松果体细胞在体外增殖旺盛。     

双峰驼黄体细胞的分离与培养

为了探索双峰驼黄体细胞的percoll液分离及体外培养方法,观察黄体细胞的生物学特性,采用胶原酶消化法从双峰驼黄体组织中分离并获得妊娠期双峰驼黄体细胞,通过形态学观察确定了大小黄体细胞的生长特性.结果表明:胶原酶消化可获得数量较多,生长状态良好的双峰驼黄体细胞,而小黄体细胞的数量远远多于大黄体细胞,其形态学和生物学特性具有典型类固醇分泌细胞的特征.试验建立的体外双峰驼黄体细胞原代培养的方法,所获细胞生物学特征稳定,纯度较高,适用于体外试验研究.     

猪肌内脂肪前体细胞与皮下脂肪前体细胞分化过程中基因差异表达分析

【目的】探讨猪肌内脂肪细胞与皮下脂肪细胞的基因表达差异。【方法】通过改进的胶原酶消化法,分别从猪（大×长二元杂）皮下脂肪组织和背最长肌肌肉组织中分离脂肪前体细胞,用850 nmol•L-1胰岛素和50 nmol•L-1地塞米松诱导细胞分化,采用油红O提取法测定细胞分化过程中的聚酯水平。同时采用实时荧光定量PCR方法检测细胞分化过程中的转录调控因子基因（PPARγ、C/EBP β与SREBP-1）、脂肪合成酶相关基因（GPDH、ACC和SCD-1）、脂肪酸转运相关基因（LPL、FAT与AP2）以及肌肉旁分泌因子受体基因（ACVR2B、IL-6R和IGF-1R）的表达模式。【结果】猪肌内脂肪前体细胞诱导后聚酯的速度快于皮下脂肪前体细胞。与此相似,肌内脂肪前体细胞中PPARγ、SREBP-1、SCD-1、LPL、AP2和FAT的mRNA表达在分化后期均显著高于皮下脂肪细胞。肌肉旁分泌因子受体基因ACVR2B、IGF-IR和IL-6R mRNA在皮下脂肪前体细胞随分化程度的增加其表达水平逐渐降低,但肌内脂肪前体细胞ACVR2B却在诱导后不断上调。【结论】建立了猪肌内和皮下脂肪前体细胞的原代培养模型,发现在离体培养条件下猪肌内脂肪前体细胞比皮下脂肪前体细胞具有更强的分化聚酯能力。从在体情况下肌内脂肪的沉积量少,沉积时间晚等现象可以推测肌内脂肪前体细胞的分化有可能受到肌肉旁分泌因子的局部抑制。     

大黄鱼肾脏组织细胞系(YCK)的建立

大黄鱼Larimichthyscrocea是福建省最重要的经济性鱼类之一。为扩充完善大黄鱼体细胞库,丰富其病毒学、细胞毒理学及细胞工程学研究手段,以大黄鱼肾脏组织为材料,进行组织细胞体外培养条件的探索,构建大黄鱼体细胞体外培养技术体系,并在此基础上建立大黄鱼肾组织细胞系(YCK)。原代培养使用组织块贴壁翻瓶法,标准传代培养是以0.25%胰蛋白酶消化细胞,使用添加10%胎牛血清(FBS)的M-199,在27℃下进行密闭培养,每72h完全换液1次。该细胞系主要由上皮样细胞构成,在上述培养条件下生长旺盛,经过400多天的连续培养,已经成功传代超过70次,第65代YCK细胞的群体倍增时间为36.12h。对常用的鱼类细胞培养基进行适应性筛选,确认M-199是最适合该细胞系的培养介质,也可适用于其他大黄鱼细胞的培养。对该细胞系的染色体分析表明:虽然出现了异倍化现象,但该系依然符合2n=48的二倍体细胞系。     

体细胞胚胎发生及其基因表达的研究进展

在合适的培养条件下,植物体细胞会模仿胚胎发育过程产生体细胞胚胎。体细胞胚胎发生提供一个实验系统,便于研究植物形态建成的分子和细胞机制等方面。文中主要对体细胞胚胎发生的影响因素(激素、胁迫因素和Ca2 等)和该过程中的基因表达与调控方面论述了国内外研究进展。     

家蚕微孢子虫抗体免疫荧光检测方法的建立及应用

通过制备家蚕微孢子虫总蛋白多克隆抗体,建立了多克隆抗体免疫荧光检测方法(IFA),并利用此方法特异性地检测出了体外培养细胞系(家蚕胚胎细胞系BmE-SWU1)中处于不同发育阶段的家蚕微孢子虫.结果在细胞爬片中可观察到呈较强的黄绿色荧光微孢子虫以及在BmE-SWU1细胞中的寄生分布情况,还可看到孢子极丝的弹出等现象.IFA检测方法鉴别诊断家蚕微粒子虫具有快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好、操作简便等特点,可以广泛应用于微孢子虫形态学、流行病学以及蛋白质的定位等研究领域.     

固醇调节元件结合蛋白-1c在肝脂肪合成中转录调节

固醇调节元件结合蛋白 -1c(SREBP -1c)是脂肪合成基因的重要转录调节因子 ,又称脂肪细胞决定和分化因子 1(AdipocyteDetermi nationandDifferentiationfactor -1,ADD1) ,它是动物肝脏中主要的转录物 ,主要调节动物脂肪合成和葡萄糖代谢相关基因的表达。研究发现 ,SREBP -1c的过度表达与肝脏等非脂肪组织的脂质积聚相关。SREBP -1c调节体内的脂肪合成主要是通过改变自身的mRNA水平来实现的 ,即生脂酶的转录调节是由SREBP- 1cmRNA的数量控制的。另一方面 ,LXRs、胰岛素、胰高血糖素等因素对SREBP- 1c的转录有调节作用。     

广西桑蚕原种毒率的时间序列分析

【目的】了解广西桑蚕原种微粒子病毒率（下简称毒率）的时间发展变化规律,为桑蚕微粒子病的防控提供理论依据。【方法】采用普通线性回归模型（Linear regression model）、自回归模型（Autoregression model）及季节性结构分量模型（Seasonal structure component）对2006～2010年广西桑蚕原种毒率的时间发展变化规律进行分析研究。【结果】普通线性回归模型对桑蚕原种毒率时间序列数据分析不理想;自回归模型能在一定程度上解决残差自相关问题,且预测值和实际值吻合程度较好;季节性结构分量模型分析结果表明,广西桑蚕原种病毒率在5年内（2006～2010年）呈现逐年上升的态势,且一年中桑蚕原种生产第1、4、5、6批的毒率较高,以第6批最高;第2、3、7、8、9、10、11、12批的毒率较低,其中以第8、9、10批次最低。【结论】时间序列分析能客观反映广西桑蚕原种毒率的发展变化规律,今后可从数据挖掘角度对桑蚕微粒子病进行防控。     

农药在桑树上单一施用与混合施用对家蚕残毒期的测定

[目的]调查混配农药残毒期。[方法]采用敌敌畏、乐果以及双扑3种药剂的单一与混合1000倍稀释液喷施桑园,于施药后不同间隔时间采收桑叶饲喂家蚕,进行其对家蚕的残毒期测定。[结果]单一喷施敌敌畏后第3天桑叶的饲蚕死亡率为36.7%,第5天为3.3%,第7天桑叶饲蚕无中毒和死亡现象。单一喷施乐果后第3天桑叶的饲蚕死亡率为6.7%,第5天桑叶饲蚕已无中毒现象。单一喷施双扑后第3天桑叶的饲蚕死亡率为100.0%;第5天为93.3%;第10天桑叶饲蚕仍有个别死亡或中毒现象。施药后第3天,各混剂处理桑叶饲蚕死亡率均超过80.0%;第5天,敌敌畏＋乐果处理桑叶饲蚕已无中毒现象,其他处理桑叶饲蚕死亡率依然很高;第7天,敌敌畏＋乐果处理桑叶饲蚕已无死亡和中毒表现。[结论]单剂混合可能使残毒期缩短或延长。     

Krüppel-Like Factor 3（KLF3）基因对牛脂肪沉积的作用

【目的】通过研究牛KLF3基因对牛脂肪分化和脂肪酸代谢关键基因表达量的作用,进而探讨KLF3 基因对脂质沉积的影响。【方法】合成干扰siRNA,筛选得到KLF3基因干扰效率最高SiRNA,分离培养秦川牛肉用新品系新生牛前脂肪细胞生长至70%-90%汇合度时转染筛选得到的KLF3基因SiRNA和阴性对照SiRNA（NC）,并进行诱导分化培养至第0天和第4 天时,利用荧光定量PCR方法研究分化标志基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator activated receptor γ, PPARγ）、CCAAT增强子结合蛋白（CCAAT/enhancer-binding proteins α, C/EBPα）,脂肪酸代谢关键基因脂肪酸合成酶（fatty acid synthase,FAS）、乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase α, ACCα）和脂肪酸结合蛋白4（fatty acid binding protein 4, FABP4）基因在牛脂肪细胞分化不同时期干扰KLF3基因处理组和对照组之间表达量的变化,同时在干扰KLF3基因处理并进行诱导脂肪细胞分化的第 4天采用油红O染色法观察干扰KLF3基因处理组和对照组之间脂滴差异及采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法测定甘油三酯含量进一步确定KLF3基因对牛脂肪细胞分化和脂肪酸代谢的作用。【结果】KLF3-Si2 具有最高的干扰效率达到73%。转染KLF3-Si2后PPARγ的表达量在牛脂肪细胞诱导分化的第0天 和第4 天与对照组相比分别下调了58% 和37%,达到了差异极显著（P<0.01）,C/EBPα 的表达量也分别下调了64% 和41%,达到了差异极显著（P<0.01）。脂质代谢的关键基因FABP4的表达量与对照组相比在牛脂肪细胞诱导分化的第0天和第4 天分别下调了89% 和60%,而ACCα的表达量干扰KLF3处理组与对照组相比在脂肪细胞诱导分化第0天和第4天分别下调了50% 和37%, 而FAS的表达量则分别下调了73% 和19%,都分别达到了差异极显著（P<0.01）。在牛脂肪细胞诱导分化第4天油红O染色和甘油三酯含量测定也发现干扰KLF3基因处理组与对照组相比脂滴减少,甘油三酯含量显著下降（P<0.05）。【结论】干扰牛KLF3基因可以抑制牛脂肪细胞分化和脂肪酸代谢关键基因表达量下调,进而影响脂肪的沉积。     

家蚕细胞色素C基因的克隆及其蛋白在家蚕凋亡细胞中的释放

 【目的】细胞色素C是线粒体凋亡路径上的关键因子,通过家蚕细胞色素C基因的克隆和其蛋白在家蚕凋亡细胞中的释放研究,为家蚕细胞凋亡的研究奠定基础。【方法】利用生物信息学和分子生物学方法克隆家蚕细胞色素C基因,通过紫外线照射诱导家蚕细胞凋亡,应用流式细胞仪和Western-blotting检测家蚕凋亡细胞的线粒体膜电位变化和细胞色素C的释放。【结果】在家蚕中克隆了一个含有细胞色素C保守结构域的同源基因,该基因cDNA长570 bp,有3个外显子,开放阅读框（open reading frame,ORF）长324 bp,编码108个氨基酸,存在参与细胞凋亡时与下游凋亡蛋白酶激活因子（Apaf－1）相互作用的保守关键位点;紫外线诱导家蚕胚胎细胞BmE-SWU1凋亡后12 h,细胞线粒体跨膜电位明显下降,同时检测到了细胞色素C由线粒体向细胞质释放。【结论】在家蚕细胞凋亡中可能存在细胞色素C由线粒体释放的路径。     

3种微生物诱导的家蚕attacin基因异常表达形式的研究

[目的]研究家蚕抗菌肽attacin基因在不同诱导源诱导时的表达情况。[方法]应用3种外源微生物BmNPV、JM109以及农杆菌LBA4404对家蚕进行诱导,半定量PCR检测attacin基因在诱导后的家蚕血液和脂肪体的表达情况,对诱导表达产物进行克隆测序及进一步的分析。[结果]attacin基因在所有诱导后的脂肪体中均出现1条800 bp左右的特异表达条带,克隆测序（GenBank登录号：FJ373020）后发现其产生由正常表达形式的2个内含子未被剪接引起,且原序列第1内含子5′端的1个TGA终止密码子使得加长的特异表达序列翻译氨基酸时在此处终止,最终导致了attacin C末端结构的缺失。[结论]attacin基因有2种剪接形式,该研究对探明atta-cin基因在家蚕免疫中的作用具有参考价值。     

溴虫腈对家蚕起蚕不同性别的毒力比较

[目的]了解吡咯类杀虫剂溴虫腈对家蚕不同性别的毒力差异。[方法]以家蚕卵色限性品种卵2为供试材料,采用浸叶法测定溴虫腈对家蚕雌、雄2～5龄起蚕的半致死浓度(LC50)。[结果]溴虫腈对该品种雄蚕各龄期起蚕的LC50都高于同一龄期的雌起蚕,不同龄期中溴虫腈对3龄雌起蚕和雄起蚕的毒力最大,然后依次为2、4、5龄雌起蚕和雄起蚕。[结论]家蚕起蚕雌雄性别对溴虫腈的耐受性存在明显差异,该研究结果为进一步研究家蚕对溴虫腈的耐受性机理奠定了基础,也为指导蚕桑安全生产、专养雄蚕和防治鳞翅目害虫提供了参考。     

脂滴的生物物理学和细胞生物学研究

最早对脂滴的研究可以追溯到19 世纪,Richard Altmann 和E.B. Wilson 都描述了细胞 中的脂肪滴,并推测了它们的起源(Altmann, 1890;威尔逊,1896)。早期,脂滴的高衍射特性为其 鉴定提供了便利的光学条件。20 世纪初,由于它们被认为是大多数细胞的组成部分,这种细胞 器被称为脂质体。然而,在20 世纪60 年代末,人造脂质体被发明出来,并很快取代了这个名 字。从那时起,这种细胞器被有过许多名称,包括脂滴、脂体、脂体、脂滴和脂质体。在植物中, 它们通常被称为油体。随着这一领域的迅速发展,它似乎已经定名为“脂滴”。几十年来,除了 形态学研究,脂滴的其他方面几乎没有受到关注。1991 年,脂肪细胞中与脂滴相关的磷酸蛋白 perilipin 的发现,引起人们对这种细胞器的新关注。从那时起,关于脂滴的论文数量急剧增加, 关于脂滴的功能也逐渐被重视起来。     

桑尺蠖Thelohania类微孢子虫及其对家蚕的传染性研究

从海宁蚕区的桑尺蠖体中分离到Ｔｈｅｌｏｈａｎｉａ类微孢子虫,其孢子形态大小与家蚕微孢子虫Ｎｏｓｅｍａｂｏｍｂｙｃｉｓ相似．在孢子形成期产生多孢子芽膜,孢子形成数为８个．感染寄生于蚕肌肉、气管、生殖腺、脂肪、马氏管等组织细胞,对蚕幼虫的致病性较弱,胚种传染频率较低     

家蚕幼虫各发育时期酚氧化酶原基因的转录活性分析

[目的]为进一步了解家蚕酚氧化酶原基因的功能奠定基础。[方法]根据GenBank上登录的家蚕酚氧化酶原基因(PPO1和PPO2)的cDNA序列设计2对特异引物,通过半定量RT-PCR技术检测家蚕幼虫各发育时期(蚁蚕到5龄起蚕)酚氧化酶原基因的转录活性。[结果]PPO1和PPO2基因在家蚕幼虫各发育时期的转录活性存在较大差异。PPO1基因在2龄眠蚕、4龄眠中的表达量最高,其次是2龄起蚕、3龄眠蚕3、龄起蚕和1龄眠蚕,在3龄眠中、4龄起蚕的表达量较低,在4龄眠蚕有弱表达,在其他发育时期几乎无表达。PPO2基因除了在蚁蚕1、龄眠中、2龄眠蚕无表达外,在其他时期的表达量均较高。[结论]酚氧化酶原基因在家蚕幼虫各发育时期的转录表达均具有明显的时空特异性。