梅花鹿Thymosin beta 10基因RNAi慢病毒载体的构建及其对鹿茸干细胞增殖的影响

利用慢病毒干扰系统,对梅花鹿生茸区骨膜干细胞(Antlerogenic periosteum cells,AP细胞)Thymosin beta 10(Tβ10)基因进行RNA干扰(RNA Interference,RNAi),并初步研究该基因对细胞增殖的影响。结果表明:试验设计的3条针对梅花鹿Tβ10基因的shRNA序列与载体质粒p LVTHM连接成功,与p SPAX2、p MD2.G质粒共转染HEK 293T细胞,获得的重组慢病毒成功感染了AP细胞;荧光定量PCR检测结果表明,RNA干扰后Tβ10基因的mRNA水平下调,MTT试验结果显示Tβ10基因的下调可以抑制AP细胞增殖。试验成功构建了针对梅花鹿Tβ10基因RNAi载体,并成功干扰了Tβ10基因在AP细胞中的表达,基因下调最高可达35.6%,并初步确定Tβ10基因下调可抑制AP细胞的增殖。     

梅花鹿生茸区骨膜细胞基因片段测序分析

在已经构建的梅花鹿生茸区骨膜细胞cDNA表达文库的基础上对文库中的噬菌斑进行随机挑取筛选,对筛选出来的噬菌斑进行质粒亚克隆、鉴定及表达序列标签序列测定和生物信息学分析。通过随机筛选及生物信息学分析的方法发现,在梅花鹿生茸区骨膜细胞中有特殊意义的基因或者基因片段。随机挑选表达频率比较高的11个基因片段中有6个基因片段具有重要意义,对这6个基因片段进行了生物信息学分析,为进一步的鹿茸生物学研究打下了基础。     

利用慢病毒表达载体干扰梅花鹿角柄骨膜细胞P21基因

利用慢病毒干扰系统,对东北梅花鹿角柄骨膜干细胞(PP细胞)P21基因进行干扰。结果表明:筛选出的2条针对梅花鹿P21基因的siRNA与载体质粒PLVTHM连接成功,并与pMD2.G、pCMV-dr8.9质粒共转染到293t细胞,获得重组慢病毒;通过感染PP细胞并利用流式细胞仪进行分选,获得了纯度90%以上的感染细胞;荧光定量RT-PCR检测表明P21基因的mRNA水平大幅度下调,干扰效率达到70%。表明成功干扰了P21基因在PP细胞中的表达,获得了低表达P21的PP细胞系。     

tTS真核表达载体构建及稳定转染HepG2细胞系的建立

为了构建tTS真核表达载体,转染HepG2细胞,建立稳定转染的HepG2细胞系,采用PCR方法,以质粒pTet-tTS为模板扩增tTS基因的编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pApoE-rtTA-Neo,经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HepG2细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HepG2细胞系,用RT-PCR、Western blot法检年测tTS的表达,成功构建了pApoE-rtTA-tTS-Neo真核表达载体,并建立了稳定转染的HepG2细胞系,成功地表达目的基因。真核表达载体成功构建和稳定转染HepG2细胞系的建立为进一步研究tTS的功能奠定良好的实验基础。     

Pin1真核表达载体的构建及鼻咽癌稳定表达细胞的鉴定

目的 构建Pin1真核表达载体并筛选鼻咽癌稳定表达细胞株.方法 提取HEK293细胞RNA行逆转录,扩增Pin1基因编码区,将其克隆到真核表达载体pcDNA6B中,菌液PCR鉴定并测序;将成功克隆的质粒转染至CNE1细胞,杀稻瘟素筛选和Western Blot鉴定稳定表达Pinl细胞.结果 成功扩增Pin1编码区,并克隆至真核表达载体pcDNA6B中;Pin1过表达载体转染至CNE1细胞并筛选稳定表达细胞后,Western Blotting检测结果显示Pinl表达水平明显增加.结论 成功构建Pin1过表达载体并筛选出鼻咽癌稳定表达细胞,可用于后续研究.     

犬SLAM基因真核表达载体的构建及在MDCK细胞中的稳定表达

为了构建稳定表达犬信号淋巴细胞激活因子(SLAM)的MDCK细胞系,该研究从犬外周血淋巴细胞中克隆了犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)细胞受体SLAM基因,将鉴定正确的SLAM基因插入到高效真核表达载体pcDNA3.1(+)中.采用脂质体转染的方式将重组质粒pcDNA3.1/SLAM转染到MDCK细胞中,采用G418加压筛选及有限稀释法克隆,获取稳定表达SLAM的MDCK细胞株.结果表明,成功构建了SLAM的真核表达载体pcDNA3.1/SLAM,并通过G418筛选获得了稳定表达SLAM的细胞系MDCK.     

稳定表达T_7RNA聚合酶的猪睾丸细胞系的建立

根据GenBank中登录的T7RNA聚合酶基因参考序列,设计合成了1对特异性引物扩增对T7RNA聚合酶基因进行扩增,将测序正确的T7RNA聚合酶基因和真核表达载体pIRES2-EGFP双酶切后进行连接构建pIRES2-EGFP-T7RNA RNA质粒。再将构建正确的pIRES2-EGFP-T7RNA质粒经用脂质体法转染猪睾丸细胞,通过G418筛选和单细胞克隆化,同时构建pET-32a-RED原核表达质粒载体,用其检测T7启动子控制下的红色荧光蛋白的表达。结果表明,建立的ST/T7RNA细胞系经20次传代仍然能稳定表达T7RNA聚合酶。结果显示,成功建立能稳定表达T7RNA聚合酶的猪睾丸细胞系,为猪瘟病毒反向遗传操作平台奠定了基础。     

环氧合酶-2的DNA疫苗构建及其在COS-7细胞中表达

构建了环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2, COX-2)的DNA疫苗载体pVAX1-COX-2, 并考察在COS-7细胞中表达. 用RT-PCR法从肺癌A549细胞中获得环氧合酶-2基因片段, 此片段插入pVAX1载体构建pVAX1-COX-2真核重组表达质粒, 脂质体介导法转染COS-7细胞, 以pVAX1为对照, 收集稳定转染细胞, 利用RT-PCR和Western-blot分别在mRNA和蛋白水平上考察COX-2表达. 实验结果表明: RT-PCR法从A549细胞mRNA中扩增1.8 kb的COX-2基因片段, 酶切与测序结果表明所构建的真核表达载体pVAX1-COX-2与预期相符, 质脂体法成功地将质粒DNA转染到COS-7细胞中. RT-PCR和Western-blot分析结果表明COX-2已表达. 因此, 所构建的真核表达载体pVAX1-COX-2正确, 且在COS-7细胞中表达.     

环氧合酶-2的DNA疫苗构建及其在COS-7细胞中表＊达

构建了环氧合酶-2（Cyclooxygenase-2,COX-2）的DNA疫苗载体pVAX1-COX-2,并考察在COS-7细胞中表达.用RT-PCR法从肺癌A549细胞中获得环氧合酶-2基因片段,此片段插入pVAX1载体构建pVAX1-COX-2真核重组表达质粒,脂质体介导法转染COS-7细胞,以pVAX1为对照,收集稳定转染细胞,利用RT-PCR和West-ern-blot分别在mRNA和蛋白水平上考察COX-2表达.实验结果表明：RT-PCR法从A549细胞mRNA中扩增1.8 kb的COX-2基因片段,酶切与测序结果表明所构建的真核表达载体pVAX1-COX-2与预期相符,质脂体法成功地将质粒DNA转染到COS-7细胞中.RT-PCR和Western-blot分析结果表明COX-2已表达.因此,所构建的真核表达载体pVAX1-COX-2正确,且在COS-7细胞中表达.     

犬瘟热病毒水貂分离株F基因真核表达载体的构建与表达

为了构建犬瘟热病毒F基因真核表达载体,利用RT-PCR方法扩增出水貂源犬瘟热病毒分离株的F基因,将其克隆至pMD-18T载体上,用BamHⅠ和KpnⅠ进行双酶切,回收目的基因。将目的基因亚克隆至pcD-NA3.1(+)中,获得真核重组质粒pcDNA3.1-CDVF。通过脂质体介导法将pcDNA3.1-CDVF转染至BHK-21细胞中,并利用间接免疫荧光试验和RT-PCR法检测pcDNA3.1-CDVF在BHK-21细胞中的表达情况。结果表明,真核重组表达质粒pcDNA3.1-CDVF构建成功,F基因可在BHK-21细胞中表达。     

新孢子虫NcGRA2基因真核表达质粒的构建及其在293细胞内的表达

[目的]为了构建新孢子虫NcGRA2基因的真核表达载体,探讨重组载体在体外细胞的表达.[方法]从含有NcGRA2基因的重组质粒pGEX-4T1-NcGRA2中,用限制性内切酶进行酶切获得带有粘性末端的NcGRA2基因片段.经琼脂糖凝胶电泳切胶回收NcGRA2基因片段,与pcDNA3.1载体连接.将构建的真核表达质粒pcDNA3.1-NcGRA2转染到293细胞中表达.[结果]经酶切分析和序列测定,证实了重组质粒的正确连接.经免疫荧光抗体试验验证pcDNA3.1-NcGRA2能在293细胞中表达NcGRA2蛋白.[结论]获得重组质粒pcDNA3.1-NcGRA2,并能在体外细胞中表达NcGRA2蛋白,为进一步研究核酸疫苗的动物免疫试验奠定了基础.     

弓形虫GRA3基因真核表达质粒的构建与鉴定

以pGEX-GRA3为模板,经PCR扩增获得弓形虫GRA3基因,克隆于pMD-18T simple载体上。重组质粒经PCR鉴定、PstⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后测序分析,再将其定向插入真核表达载体pVAXⅠ,构建真核表达重组质粒pVAX-GRA3。经PCR和酶切鉴定后,将重组质粒pVAX-GRA3转染Hela细胞,然后进行RT-PCR检测。RT-PCR结果表明,检测到了目的基因的存在,说明pVAX-GRA3成功转入Hela细胞。     

H9N2亚型禽流感病毒NS1基因的原核与真核表达

【目的】构建H9N2亚型禽流感病毒(AIV)NS1基因的原核和真核表达载体,将其分别在大肠杆菌和293细胞中进行表达,为进一步研究NS1蛋白的功能及其与宿主的相互作用,以及鉴定禽流感疫苗免疫禽和野毒感染禽ELISA诊断试剂盒的制备提供理论依据。【方法】用RT-PCR方法扩增H9N2亚型AIV的NS1基因,将其定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)中构建NS1基因的原核重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达;同时,将NS1基因克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,构建NS1基因真核重组质粒,将其瞬时转染293细胞,48h后收集感染细胞,对大肠杆菌表达产物和293细胞表达产物进行Western-blotting分析。【结果】成功构建了NS1基因的原核表达载体pET-32a-NS1和真核表达载体pEGFP-C1-NS1。Western-blotting结果表明,大肠杆菌和293细胞的表达产物均能检测到特异性条带(大肠杆菌的表达产物在约44ku处出现阳性条带,293细胞表达产物在约55ku处出现特异条带)。【结论】NS1基因在大肠杆菌和293细胞中得到成功表达,获得的NS1蛋白具有良好的抗原活性。     

人pot1基因cDNA的克隆及其在HeLa细胞中的表达

目的：克隆人端粒保护蛋白（human proteetlon of telomeres 1.pot1）基因cDNA全编码区,构建成真核表达质粒并实现在HeLa细胞中的表达。方法：RT-PCR法扩增出HeLa细胞hpot1基因cDNA编码区全序列,定向克隆至真核表达载体pcDNA3,阳性重组质粒经插入片段测序验证;重组的pcDNA3-hpot1质粒瞬时转染HeLa细胞,RT-PCR和EMSA法（电泳迁移率改变分析）检测hpot1基因的表达水平。结果：来自Hela细胞的hpot1基因cDNA编码区全序列构建成的真核表达质粒pcDNA3-hpot1,经测序分析序列和ORF正确;该重组质粒转染在HeLa细胞48h后,hpot1基因表达水平增高。结论：真核表达载体pcDNA3-hpot1构建成功,并实现了hpot1在Hela细胞中的表达。     

人HIF-1α基因重组减毒沙门氏菌载体的构建及稳定性检测

利用RT-PCR方法从低氧预处理的A549细胞中获得HIF-1α基因片段,将其定向插入pIRES-SEQ质粒NheⅠ、MLuⅠ2个酶切位点之间,得到真核表达载体pIRES-HIF-1α;采用电转化方法将其电转化入减毒沙门氏菌Ty21α中,获得重组减毒沙门氏菌菌株TPH;转染A549细胞,RT-PCR法检测HIF-1α基因表达,ELISA方法检测HIF-1α蛋白表达;TPH菌株在氨苄青霉素(+)和氨苄青霉素(-)LB培养板上分别传代40代,每10代提取质粒进行PCR及酶切鉴定.结果表明:试验成功构建了携带HIF-1α基因的重组减毒沙门氏菌TPH,其可在体外细胞中稳定表达HIF-1α基因及蛋白,TPH可稳定遗传.     

慢病毒载体介导稳定表达Cas9基因的293T细胞系构建及其基因编辑效率验证

为通过慢病毒感染细胞构建稳定表达CRISPR/Cas9的293T细胞系,实现高效率基因编辑, PCR扩增Cas9基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G共感染293FT细胞, 48 h后收集病毒并浓缩纯化测定其病毒滴度,最后用纯化后的病毒感染293T细胞,通过抗性和荧光标记筛选得到稳定表达Cas9的细胞系,并对单克隆细胞进行DNA、RNA特异性和反转录验证。针对ABCG4基因设计sgRNA并构建重组载体感染单克隆细胞,通过DNA特异性和T7E1酶切验证基因敲除效率。结果表明:成功构建了Cas9-pLent慢病毒载体,用构建成功的慢病毒载体对293FT细胞进行慢病毒包装(三质粒系统)并对包装成功的病毒进行了浓缩与纯化,最后通过病毒感染293T细胞,采用荧光观察的方式测定其病毒滴度均在10~6 TU·mL~(-1)之上。用纯化后的病毒感染293T细胞并通过加药(Puro)进行抗性筛选,筛选出3株能稳定表达Cas9的293T细胞系,目的基因ABCG4的基因编辑功能验证表明其中1株T7E1酶切掉带明显, sgRNA靶向敲除效率较高,该株命名为Cas9-293T-10A。该研究建立了稳定表达Cas9的293T细胞系,可用于目的基因的高效敲除。     

鸡TNNI2基因的真核表达载体构建及功能生物信息学分析

【目的】构建鸡快骨骼肌亚型肌钙蛋白I基因(fast skeletal muscle troponin I,TNNI2)的真核表达载体,并在永生化鸡前脂肪细胞系(immortalized chicken preadipocyte cell line,ICP1)细胞中转染和鉴定。【方法】利用RT-PCR方法获得鸡TNNI2基因的全长CDS区序列,采用定向克隆的方法构建该基因的真核表达载体,并对基因序列进行功能生物信息学分析,构建系统发育树。【结果】TNNI2基因ORF全长552 bp,编码183个氨基酸,蛋白质分子量大小为21.24 ku,理论等电点(pI)为9.19;fsTnI蛋白无信号肽和跨膜区,亚细胞定位于细胞核,属于亲水性不稳定蛋白质;磷酸化预测含有14个磷酸化位点;二级结构主要以α螺旋的形式存在;同源性比对结果表明:不同物种间的TNNI2基因具有较高的同源性。【结论】本研究成功构建了TNNI2基因的真核表达载体pCMV-HA-TNNI2,并成功转染ICP1细胞系,本结果可为进一步研究鸡TNNI2基因的功能奠定基础。     

番鸭源禽1型副黏病毒HN基因主要抗原结构域和V基因融合表达载体的构建

为构建番鸭源禽1型副黏病毒HN主要抗原结构域(HNd)和V基因融合表达载体,经PCR及融合PCR分别从重组质粒pMDHN和pMDP中扩增HN基因主要结构域和V基因cDNA.将HNd经KpnⅠ和BamHⅠ双酶切、V基因用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后,分别定向插入真核载体pcDNA3的多克隆位点相应的酶切位点中,对2个单表达质粒pcDNAHNd和pcDNAV进行酶切和测序鉴定.利用融合PCR技术扩增出HNd-V基因,定向克隆至pcDNA3的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切酶切位点之间,转化感受态细胞后,经PCR反应初筛后,对阳性克隆进行酶切分析及测序鉴定.对单表达重组质粒进行酶切分析及测序鉴定,结果表明:HNd和V基因已被正确定向克隆至真核表达载体peDNA3,成功构建了2个基因的单表达质粒pcDNAHNd和pcDNAV;对融合重组质粒酶切分析和测序鉴定表明,HNd-V融合基因正确克隆进真核表达质粒pcDNA3中,成功构建了融合表达载体pcDNAHNd-V.     

VRTN Promoter-hsp68-LacZ表达载体的构建与鉴定

利用β-半乳糖苷酶(LacZ)报告基因对与猪脊椎发育相关的VRTN基因调节突变区进行研究和鉴别。使用通路克隆技术构建与VRTN基因的启动子区与热休克蛋白(hsp68)启动子及LacZ相连的报告载体,将其转染人肾上皮细胞系(HEK293T细胞),并将载体线性化后整合入HEK293T细胞基因组中进行上述表达质粒整合效率的评估。结果表明:利用通路克隆技术构建真核表达质粒快速准确;在脂质体介导下转染HEK293T细胞后,将细胞置于42℃热休克染色后检测转染效率60%左右;线性化后转染HEK293T细胞加新霉素G418筛选后可得到稳定遗传的整合有质粒的细胞。     

7个shRNA分子对绵羊BMPR-1B基因的干扰作用分析

为获得有效干扰绵羊BMPR-1B基因的shRNA干扰分子,从绵羊卵巢组织中扩增了1 515 bp BMPR-1B基因全长编码区cDNA序列,添加HA标签序列后,插入Plex-mcs慢病毒质粒,构建Plex-BMPR-1B慢病毒表达载体,转染HEK293细胞,并与2个包装质粒共转染293T细胞进行病毒包装,用获得的重组慢病毒感染HEK293细胞;同时,将7个干扰分子与Pll-LentiLox 3.7载体重组,并与3个包装质粒共转染293T细胞进行病毒包装,获得干扰分子的重组病毒颗粒。最后用干扰分子重组的病毒颗粒感染整合Plex-BMPR-1B的HEK293细胞,进行qRT-PCR和Western blot检测。结果显示:重组BMPR-1B蛋白质在稳定整合Plex-BMPR-1B的HEK293细胞系中获得了表达;研究中设计的7个shRNA分子能抑制绵羊BMPR-1B基因表达水平68.30%～99.86%,其中PLL-BMPR-1B-1306和PLL-BMPR-1B-1475干扰分子的干扰效果最好。