H1N1猪流感广东株血凝素基因的克隆与序列分析

用RT-PCR方法扩增H1N1亚型猪流感病毒广东分离株A／Swine／GuangDong／711／2001HA基因，对其进行了克隆和测序。结果显示，HA基因全长1771bp．共编码579个氨基酸。A／Swine／Guang Dong／711／2001HA基因编码的氨基酸序列中有8个糖基化位点，5个位于HAl基因的第27、28、40、104和287位点，3个位于HA2基因的21、153和213位点。与H1N1亚型猪流感经典毒株比较后发现，血凝素糖基化位点并不是高度保守的。将A／Swine／Guang Dong／711／2001与自Gen Bank读取的1918年人流感毒株A／South Carolina／1／18、1991年人流感毒株A／MD／12／91和1997年猪流感毒株A／Swine／Wisconsin／238／97等进行核苷酸同源性比较分析，A／Swine／Guang Dong／711／2001与A／SouthCarolina／1／18、A／MD／12／91和A／Swine／Wisconsin／238／97等毒株的核苷酸同源性分别为93．9％、94．7％和93．9％。从系统发生树来看，A／Swine／Guang Dong／711／2001与A／South Carolina／1／18和A／Swine／Wisconsin／238／97的亲缘关系相近。     

H7N2禽流感病毒分离株血凝素蛋白全基因的序列分析

为进一步分析H7N2禽流感病毒（AIV）分离株血凝素（HA）基因的特性,参照已发表序列设计了1对引物,采用RT-PCR获得了1条约1.7 kb的DNA片段,测序后进行了同源性比较、HA基因系统发育进化树分析和氨基酸编码分析.结果表明,所测的2个分离株的HA基因全长1 664 bp,编码除信号肽以外的HA蛋白的全部544个氨基酸,其中包括HA1的323个氨基酸,HA2的221个氨基酸.2个分离株HA基因核苷酸序列的同源性为99.4%;与GenBank中AIV标准株A/Afri.Star./Eng-Q/983/79（H7N1）的同源性最高,分别为99.4%和99.0%;与美国A/Chicken/NewYork/13142-5/94（H7N2）株同源性很低（仅65.0%）,而与以色列、意大利H7N2 AIV的同源性较高（为96%～97%）;2个分离株在HA基因进化树中均处于H7亚型AIV的欧亚群系分支内.推导氨基酸的序列分析表明,其HA蛋白裂解位点的氨基酸序列为-GR-GLF-,仅包含1个碱性氨基酸（R-）残基,符合低致病力AIV的基因特征.     

禽流感病毒H9N2亚型分离株HA基因的克隆及序列分析

以禽流感病毒地方株A/chicken/Mudanjiang/ 0 82 3/ 2 0 0 0 (H9N2 )的总RNA为模板 ,用通用反转录引物和自行设计的一对特异性引物 ,采用RT PCR方法扩增了HA基因。测序及序列分析结果表明 :HA基因全长 1 70 7bp ,编码 560个氨基酸残基 ,与GenBank收录的H9N2亚型的核苷酸同源性最高达 99% ,最低为 87 2 3 % ;氨基酸同源性最大达 98 0 4 % ,最低为 88 57%。经HA裂解位点附近的氨基酸序列分析表明 ,CMJ/ 0 0毒株为低致病力毒株     

10株H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因的序列分析

为了解中国目前H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)血凝素(HA)基因的遗传变异情况,对中国不同地区分离的10株H9N2亚型AIV的HA基因进行扩增、克隆和测序,并对所获得的HA全序列进行同源性和遗传进化分析。结果表明,10个分离株的裂解位点均为RSSR↓GLF,符合低致病性AIV的分子特征;10个分离株有7~9个潜在糖基化位点,由于基因突变有些HA基因出现了新的糖基化位点;与参考株相比,发现了4个抗原表位的突变,这些表位的突变可能引起病毒致病性的改变;受体结合位点除198位有变异外,其他位点均较保守;6株病毒234位氨基酸均为L,具有与哺乳动物唾液酸α,2-6受体结合的特征;10个分离株HA基因与国内疫苗株的核苷酸及氨基酸序列同源性分别为90.4%~99.2%和92.2%~98.7%;10个分离株同属于欧亚谱系中的A/duck/Hong Kong/Y280/97群,但差异显著,为此本试验又将其分为4个不同的亚群。人工感染排毒试验结果表明,BJ15和NJ17分离株在鸡体内具有较强的复制能力,排毒周期较长且排毒量也较大,而S145N的漂变导致在145-147位氨基酸多出1个糖基化位点NGT,可能是分离株复制能力增强的原因。     

2012~2015年H9N2亚型AIV分离株HA基因的克隆及序列分析

为了解近年来中国部分地区H9N2亚型禽流感病毒流行特点及遗传进化情况,利用RT-PCR方法扩增2012~2015年分离的17株H9N2亚型禽流感病毒的HA基因片段,并进行序列测定和遗传进化分析,同时对HA蛋白的裂解位点、受体结合位点和潜在的糖基化位点进行分析。结果显示,17株H9N2亚型禽流感病毒HA基因核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为87%~100%和75%~100%,均属于Y280-like亚系毒株。HA基因裂解位点均为非连续碱性氨基酸,属于低致病力毒株。HA基因受体结合位点149、198、234和235位氨基酸存在变异,其中,16株分离毒株的234位氨基酸由Q突变为L,表现出人流感病毒受体结合特征。潜在糖基化位点分析结果显示,11株病毒在218位氨基酸处缺失1个糖基化位点,4株病毒在492位氨基酸处缺失1个糖基化位点,17株病毒在313位氨基酸处增加1个糖基化位点。研究结果表明,应加强对H9N2亚型AIV的流行病学监测,关注疫苗毒株与流行毒株的差异。     

禽流感病毒A/Afri.Star/Eng-Q/983/79/(H7N1)血凝素基因的全序列分析

对反转录－聚合酶链反应扩增克隆的Ｈ７亚型禽流感病毒（ＡＩＶ）Ａ／Ａｆｒｉ．Ｓｔａｒ／Ｅｎｇ－Ｑ／９８３／７９／（Ｈ７Ｎ１）的血凝素（ＨＡ）基因进行了核苷酸序列分析。结果,克隆的ＨＡ基因共１７０７ｂｐ,包括完整的阅读框架;同源性分析表明该毒株起源于欧亚群系;ＨＡ裂解位点只有一个碱性氨基酸,显示典型的低致病力特征。Ｈ７亚型ＡＩＶＨＡ基因的克隆成功为分子诊断和基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

H9N2亚型禽流感病毒HA和NA基因的序列分析

禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)是正黏病毒科流感病毒属A型流感病毒。禽流感又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟,被国际兽医局(OIE)列为A类传染病。H9N2亚型AIV为低致病性禽流感病毒,虽然毒力较H5N1亚型AIV弱,但自1966年HoMee从患温     

禽流感病毒A/Chicken/Yangzhou/N/2005(H9N2)HA基因的克隆及序列分析

根据GenBank公开发表的H9N2型禽流感病毒血凝素(HA)基因序列设计1对引物,用RT-PCR方法成功扩增出H9N2型禽流感病毒分离株A/Chicken/Yangzhou/N/2005(H9N2)HA基因,凝胶电泳结果显示,扩增产物为1.7 kb的单一条带,与预期结果相符.将PCR扩增片段连接到pCR2.1-T载体上,重组质粒酶切鉴定正确.序列测定分析结果显示,所获序列与GenBank中收录的H9N2亚型分离株核苷酸同源性最高达99%,与原型毒株A/Furkey/Wisconsin/1/1966(H9N2)氨基酸同源性为89%.对HA裂解位点附近的氨基酸序列分析表明,此毒株为低致病力毒株.     

H9(N2)型禽流感病毒HA基因的克隆与序列分析

研究采用异硫氰酸胍法提取禽流感病毒分离株的SPF鸡胚尿囊毒RNA,利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增出禽流感病毒(H9亚型)血凝素的cDNA。用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收纯化目的片段,后连接到线状克隆载体pGEM-T easy vector,转化JM109感受态细胞,在含氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆。经PCR扩增,进一步确证为目的片段,并对目的片段进行测序,结果获得3个毒株的HA基因全长。与已知序列进行同源性比较,同源性最高的都可达98％,表明这些分离株的亲缘关系较近;系统发育分析表明,这三个毒株均属欧亚种系;通过血凝素裂解位点的氨基酸序列分析可知,三分离株的HA切割位点上均为-PARSSR-GLF-。所克隆的基因为珠海地区禽流感病毒HA基因芯片的研究奠定了基础。     

1株鸭源H4N6亚型流感病毒全基因组序列测定和遗传演化分析

2010年在山东水禽市场健康鸭体内分离鉴定1株H4N6亚型流感病毒（AⅣ）,命名为A／duck／shandong／1／2010（H4N6）（缩写为DK／SD／1／2010）。对其全基因序列进行测定,并与GenBank中相关序列进行遗传演化分析。结果表明：DK／SD／1／2010HA基因切割位点附近的氨基酸序列（PKKASR↓GLF）符合低致病力AIV的特征;HA基因与A／avian／Japan／8k10185／2008（H4N6）在同一进化分支内;PB2基因与A／Mallard／Hokkaido／24／2009（HSN1）在同一分支内;NP基因与A／Spot-billedduck／Korean／546／2008（H6N1）在同一分支内;M基因与A／Dintail／Aomori／1130／2008（HIN3）在同一分支内。因此,推测DK／SD／1／2010可能是不同来源的流感病毒基因在鸭体内经过复杂重组演变的一株重组病毒。     

禽流感病毒KMI/99(H9N2)HA和NA基因的序列分析

研究分别以自行设计的一对简并引物和另一对普通引物，经RT－CR，一次性成功地扩增禽流感病毒A／Chicken/Guangxi/KMI/99(H9N2）HA全和基因cDNA和NA全长基因cDNA，并将它们克隆于pGEM-T Easy的T－T窗口，首次报道了该毒株的HA全基因和NA全基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列，测序结果显示，该毒株的HA基因全长为1683bp，编码560个氨基酸。NA全长为1398bp，编码466个氨基酸残基。研究发现其HAI羧基端的分子特征是：R－S－S－R。从分子水平推论。A/Chicken/Guangxi/KMI/99(H9N2)属于非高致病力毒株。研究还发现NA蛋白于63－65位缺失了T、E、I三个氨基酸。     

一株鸡源H6N1亚型禽流感病毒全基因的分子特征

2008年国家禽流感参考实验室在我国禽流感流行病学调查期间分离到1株鸡源H6N1亚型禽流感病毒(AIV)A/Chicken/ZheJiang/80/2008(H6N1)(简称为CK/ZJ/80/08),为了弄清该病毒的分子特征,我们对其8个基因片段分别进行扩增和序列测定,对每个基因进行BLAST分析,找出同源性最高的毒株。利用DNAStar中的Megalign功能进行进化分析。结果表明CK/ZJ/80/08的HA裂解位点附近的氨基酸序列为QIETR↓GLF,推测可能为一株低致病力AIV。其HA基因与日本北海道的A/duck/Hokkaido/228/2003(H6N8)和黑龙江的A/mallard/Heilongjiang/131/2006(H6N2)以及香港早期分离株A/chicken/HongKong/17/77(H6N1)等处于同一分支;NA基因在颈部没有缺失,与A/duck/Tsukuba/718/2005(H1N1)、A/goose/Guangdong/1/96(H5N1)等处于同一分支;M基因与A/duck/Hokkaido/W90/2007(H10N7)高度同源(同源性为99%);NS基因与A/duck/Denmark/65047/04(H5N2)和A/goose/Guangdong/1/96(H5N1)处于同一分支。NP、PA、PB1、PB2分别与贵州和江西分离的H5N2亚型AIV的相应基因关系密切,同源性分别为98%、97%、97%、97%。由此推测CK/ZJ/80/08可能是由H6N2、H1N1、H10N7、H5N2等多个亚型病毒重组而成。     

一株野禽源H4亚型禽流感病毒HA基因的序列测定及全球谱系演化分析

采用RT-PCR方法扩增出一株鄱阳湖地区野禽源H4亚型AIV的血凝素基因,并进行分子克隆与测序。与GenBank上已发表的不同来源的H4亚型AIV进行同源性对比,发现该毒株与亚洲分离株核苷酸同源性较高,达96%。全球谱系分析表明,该毒株属东半球谱系的欧亚分支。研究结果对于进一步深入研究野生鸟类的禽流感传播作用具有重要参考价值。     

H9N2亚型禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因的遗传分析

H9N2亚型禽流感病毒自1994年在中国首次发现以来,一直在家禽中流行,其导致的产蛋下降和发病死亡给养禽业发展带来严重危害。以前的研究发现中国的H9N2亚型禽流感病毒在进化过程中形成多个基因型,其表面抗原蛋白血凝素基因(HA)可被划分为以A/chicken/Beijing/1/94、A/quail/Hong Kong/G1/97(G1)和A/chicken/Heilongjiang/35/01等为代表的3个亚群,神经氨酸酶基因(NA)可被划分为以A/chicken/Beijing/1/94、A/quail/Hong Kong/G1/97(G1)和A/chicken/Hong Kong/G9/97(G9)等为代表的3个亚群。其中类G1病毒的HA基因只在香港分离株中出现。本研究对我国2003年～2004年从禽类中分离的H9N2亚型禽流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因进行测定和遗传演化分析,结果表明其中11株病毒的HA基因属于CK/BJ/1/94群系,NA基因属于CK/BJ/1/94或DK/HK/G9/97群系,并首次发现两株病毒含有类G1病毒HA和NA基因,而且这些类G1病毒具有不同的抗原性以及人流感病毒的受体结合位点。本研究结果提示应对H9N2病毒的防治及其公共卫生意义予以高度重视。     

云南2株H4N6亚型禽流感病毒株的分离与鉴定

采集家禽喉气管作为检测样品,用甲型流感病毒M基因检测引物进行RT-PCR检测,确定样品为甲型流感病毒感染。用已建立的PCR法检测H5、H9亚型及新城疫结果为阴性。在9日龄鸡胚中进行病毒分离培养,收集48 h后死亡鸡胚尿囊液进行血凝和血凝抑制试验,有血凝效价但不能被H5、H7、H9和新城疫阳性血清抑制。为进一步确定病毒的亚型,用甲型流感病毒血凝素基因通用引物进行RT-PCR扩增、克隆及测序,将测得的HA基因序列与血凝素亚型标准序列进行比对,同源性为34.9%～87.3%,与H4亚型的同源性为87.3%;设计神经氨酸酶基因测序引物,将所测序列与神经氨酸酶亚型标准序列进行比对,同源性为47.7%～90.8%,与N6亚型的同源性高达90.8%。通过进行HA和NA基因序列比对,可以确定试验所分离到的2株甲型流感毒株为H4N6亚型禽流感病毒。     

两株鸭源H6N2亚型禽流感病毒的序列分析及对鸡的致病性研究

为了解鸭源H6N2亚型禽流感病毒(AIV)的生物学特性,本研究对两株鸭源H6N2亚型AIV [A/duck/Hube/Sd061/2008(HB/061/08)和A/duck/Fujian/S2080/2009(FJ/080/09)]进行序列分析和致病性试验.序列分析显示:两株病毒的HA和NA基因均来源于我国近年流行的H6亚型病毒株,但是HB/061/08株的内部基因可能来源于H9、H5等其他亚型.与病毒株HB/061/08 NP、PA、PB2基因的核苷酸同源性最高的病毒株为A/environment/Hunan/2-84/2007(H9N2);与M、PB1和NS基因的核苷酸同源性最高的病毒株分别为A/duck/Zhejiang/11/2000(H5N1)、A/chicken/Hebei/7/2008(H9N2)和A/chicken/Henan/L1/2008(H9N2).两株病毒的抗原差异性较显著,相关系数为0.49;用106 EID50病毒剂量感染4周龄SPF鸡,结果显示FJ/080/09株不能感染鸡,而HB/061/08株在鸡体内能够高效复制,并通过咽喉和泄殖腔持续排毒.鸡群感染后第3d采取脏器样品,在气管和肺部能够检测到病毒存在,部分脏器和器官的组织学观察显示存在一定程度的病理变化.以上数据表明,H6亚型AIV在跨越不同宿主感染的传播过程中,对新宿主适应能力的差异导致对其致病性的差异.     

Isolation of avian influenza virus (H9N2) from emu in China

This is the first reported isolation of avian influenza virus (AIV) from emu in China. An outbreak of AIV infection occurred at an emu farm that housed 40 four-month-old birds. Various degrees of haemorrhage were discovered in the tissues of affected emus. Cell degeneration and necrosis were observed microscopically. Electron microscopy revealed round or oval virions with a diameter of 80 nm to 120 nm, surrounded by an envelope with spikes. The virus was classified as low pathogenic AIV (LPAIV), according to OIE standards. It was named A/Emu/HeNen/14/2004(H9N2)(Emu/HN/2004). The HA gene (1683bp) was amplified by RT-PCR and it was compared with other animal H9N2 AIV sequences in GenBank, the US National Institutes of Health genetic sequence database. The results suggested that Emu/HN/2004 may have come from an avian influenza virus (H9N2) from Southern China.     

两株H6N2亚型鸡源禽流感病毒的分离鉴定

本研究利用血凝抑制试验(HI)、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、基因测序等方法,对广东省某活禽交易市场进行流行病学调查时获得的两株非H5、H9亚型禽流感病毒65株和C7株进行了亚型鉴定。结果表明这两株病毒均具有血凝活性,且能被抗H6亚型禽流感病毒标准阳性血清特异性抑制。用针对禽流感病毒的M基因、H6亚型禽流感病毒HA基因、N2亚型禽流感病毒NA基因特异性鉴定引物对65株和C7株进行RT-PCR扩增,分别获得特异性目的片段。测序及BLAST分析表明两株分离株与H6N2亚型禽流感广东分离株的HA基因和NA基因核苷酸序列相似性均高达95%以上。将该两分离株鉴定为H6N2亚型禽流感病毒,并命名为A/Chicken/Guangdong/65/2009、A/Chicken/Guangdong/C7/2009。     

表达H5N1亚型禽流感病毒HA和NA基因的重组鸭瘟病毒的构建

利用PCR技术扩增出鸭瘟病毒(DPV)生长非必需的TK基因(约1.1kb),将其克隆入pGEM-Teasy载体获得载体pGTK。根据已知的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C1的序列设计了一对引物,PCR扩增出pEGFP-C1上含CMV启动子、EGFP及其多克隆位点的完整的基因表达盒插入pGTK的TK上,获得质粒pGTK-EGFP。根据Genbank已发表的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因序列,设计了两对引物,分别从pT-HA和pT-NA两个质粒上扩增出HA和NA基因,克隆到pGTK-EGFP的表达盒的多克隆位点Kpn2I与SmaI之间,构建含EGFP及HA和NA基因的转移质粒载体pGTK-EGFP-HA-NA。将这质粒载体与DPV34F2疫苗毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过荧光方法筛选,获得了表达HA和NA基因的重组DPV(rDPV-HA-NA)。     

我国与韩国禽流感H9N2病毒血凝素分子特性的区别

中国与韩国都发生了H9N2亚型禽流感，且都对养禽业造成了严重损失。国际上有不少学者认为韩国的H9N2亚型流感是由中国通过禽肉及其相关产品的输入而引起。本研究针对这一情况对从中国大陆分离的H9N2病毒和自GeneBank读取的韩国H9N2病毒的血凝素核苷酸序列进行了比较分析，结果表明两者属于不同的进化分支。所有中国H9N2病毒的血凝素裂解位点都为-RSSR／G-，而韩国H9N2病毒的血凝素裂解位点为-ASVR／G-、-ASYR／G-或-ASGR／G-。韩国H9N2病毒血凝素的受体结合位点的氨基酸在第183、190和226位点分别H、E和Q；而中国毒株的变异较大，在第183位点全部为N，190位点为A、T或V，第226位点为L或Q。因此，中韩两国的H9N2病毒血凝素分子特性显著不同。