1 株抗草甘膦棉花突变体草甘膦抗性的初步鉴 定简

 目的在于探明1株新的草甘膦抗性棉花突变体是否能用于发掘新的草甘膦抗性基因以及在农业生产中作为抗草甘膦种质的选育和利用的潜在价值。本文采用PCR的方法,在基因组和转录水平上排除了CP4-EPSPS基因对该突变棉株的污染;通过测定莽草酸含量,鉴定了该突变体草甘膦抗性的典型生理特征;通过盆栽试验研究了该突变体苗期对草甘膦抗性的表型。结果显示：不论草甘膦处理与否,突变棉株莽草酸的含量都没有显著的积累,在生理水平上显示出草甘膦抗性植株的显著特点;2叶期时草甘膦处理结果显示,突变棉株的草甘膦抗性表型同孟山都的品种对草甘膦的抗性表型基本一致。在基因组和转录水平的PCR检测结果都排除了突变棉株草甘膦抗性的获得是CP4-EPSPS基因污染造成的。结合对其他已报道的草甘膦抗性基因的类似排除,说明该抗性突变存在着自身特有的分子机理。     

转G10eve基因棉花的获得及草甘膦抗性初探

【目的】为培育高抗草甘膦棉花新品种提供种质材料。【方法】对草甘膦抗性基因G10eve进行生物信息学分析,利用农杆菌介导的方式将G10eve导入到珂字棉312中。利用PCR(Polymerase chain reaction)、qRT-PCR(Quantitative real-time PCR)方法分析G10eve的表达情况。对受体及转基因植株进行草甘膦喷施实验,测定其莽草酸含量,分析其抗性水平。【结果】最终获得28个独立的转基因阳性系,转化率及幼苗分化率分别高达49.3%、40.6%。PCR及qRT-PCR检测证明外源G10eve基因已经整合到棉花基因组中,且在不同转基因株系间表达量差异显著。在子叶期,转基因植株可耐受8 mL·L~(-1)浓度的草甘膦,而非转基因对照在2 mL·L~(-1)浓度草甘膦处理下已出现药害。草甘膦处理前后,转基因植株叶片莽草酸含量未出现明显积累,进一步说明其具有草甘膦抗性。【结论】过量表达G10eve基因能够提高受体材料对草甘膦的抗性,获得了高抗草甘膦的棉花株系。     

黑龙江省大豆产区疑似转基因大豆的分子检测

利用表型鉴定和PCR分子检测相结合的方法,对黑龙江省国储库拒收的疑似转基因大豆进行了转基因成分检测.表型鉴定方法为草甘膦叶片涂抹,PCR分子检测对象为CaMV35S启动子、NOS终止子及目的基因CP4-EPSPS.利用大豆自身的凝集素基因作为PCR检测的内标基因,以有效排除DNA质量、实验操作等因素对检测结果的影响.结果表明,所测材料不抗草甘膦除草剂,也不合所检测的外源基因,由此判断该批次材料不是转基因大豆.     

棉田反枝苋和马齿苋对草甘膦的抗药性

为明确棉田反枝苋和马齿苋对草甘膦的抗性水平,采用培养皿种子法和整株检测法分别测定了7个省18个采样点反枝苋、马齿苋的抗性水平,并采用紫外分光光度计测定采样点反枝苋、马齿苋体内莽草酸含量变化的差异。结果表明:采样点地区的反枝苋和马齿苋对草甘膦存在不同程度的抗药性,2种监测法的抗性趋势基本一致,其中陕西西安采样点的反枝苋和新疆疏勒采样点的马齿苋处于敏感水平,河北曲周采样点的反枝苋抗性倍数最高。植物体内莽草酸积累变化与植物抗性水平相关,抗性较低的植物体内莽草酸积累量普遍高于抗性较高的植物。     

抗草甘膦棉花突变体R1098对草甘膦抗性研究

为研究抗草甘膦棉花突变体对草甘膦除草剂抗性,以抗草甘膦棉花突变体R1098为材料,以其遗传背景亲本柯字棉312为对照,在无菌培养过程中分别加入不同浓度的10%草甘膦水剂和95%的草甘膦粉剂,考察幼苗的生长发育和POD活性变化,研究结果表明柯字棉312对两种草甘膦除草剂均较为敏感,低浓度草甘膦处理情况下即枯萎死亡;抗草甘膦棉花突变体R1098对95%草甘膦粉剂抗性较强,随着草甘膦粉剂处理浓度的增加,各项指标未见显著差异,而对10%草甘膦水剂抗性较差,随着草甘膦水剂处理浓度的增加,各项生长发育指标显著的降低,POD活性显著的增加;当草甘膦处理浓度大于0.6 mmol/L时,在两种草甘膦除草剂之间抗草甘膦棉花突变体R1098幼苗全株鲜重、叶重、根重、下胚轴长度和POD活性等各项指标差异均达到显著水平;R1098对10%草甘膦水剂抗性较差,极有可能是因为10%草甘膦水剂本身含有严重阻碍R1098幼苗生长发育的其他有害物质。综上所述,抗草甘膦棉花突变体R1098对草甘膦粉剂具有良好的抗性,该非转基因种质在棉花育种和生产上均具有重要意义。     

转基因抗草甘膦棉花及其对草甘膦抗性的时空表达

草甘膦是一种非选择性除草剂,它通过竞争性抑制莽草酸途径中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶（EPSP合酶）干扰芳香族氨基酸的生物合成而发挥毒性作用。虽然获得抗草甘膦棉花的途径有多种,但当前用于生产的抗草甘膦棉花主要是以CP4- EPSPS基因转化棉花获得的。草甘膦对转CP4- EPSPS棉花的营养生长没有不利影响,但4叶期后喷施草甘膦会显著降低花粉粒的活性,抑制散粉、授粉和结实,导致转CP4- EPSPS棉花对草甘膦抗性呈现出一定程度的时空变化。草甘膦对抗草甘膦棉花（雄性）生殖器官的抑制效应一方面源于草甘膦在生殖器官内的大量积累,另一方面在于CP4- EPSPS基因在（雄性）生殖器官的低效表达。促进CP4- EPSPS基因在全株高效表达是提高棉花对草甘膦抗性的重要途径。     

土壤宏基因组中抗草甘膦新基因的克隆与转化水稻的研究

EPSPS (5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶EC 2.5.1.19)是植物芳香族氨基酸和植物次生代谢产物生物合成中莽草酸途径的关键酶; 同时也是广谱性除草剂草甘膦的作用目标。本实验通过对草甘膦污染土壤宏基因组文库的建立及筛选, 成功克隆了一个新的草甘膦抗性的EPSPS基因(命名为soilEPSPS)。序列分析表明soilEPSPS基因全长1404 bp, 其编码的467个氨基酸中未涉及已公布专利中保护的氨基酸序列。原核功能验证表明该基因对草甘膦的耐受能力优于EPSPS CP4基因。将该基因与水稻Rubisco SSU引导肽相融合构建由actin启动子驱动的植物表达载体, 用农杆菌介导法实现了水稻的遗传转化。抗性再生植株的PCR和Southern杂交结果表明所获得的26株再生植株均为转基因阳性植株, 其中共有3个单拷贝转化事件。草甘膦抗性鉴定证明纯合体T₂代植株能够耐受高达500 mmol L^-1的草甘膦。本研究为转基因抗除草剂水稻新品种的培育奠定了基础。     

广东发现对百草枯、草甘膦和草铵膦均产生抗药性的牛筋草种群

<正>华南农业大学农学院通过比较分析牛筋草对百草枯、草甘膦和草铵膦的抗药性指数,旨在筛选出对3种除草剂产生多抗性的牛筋草种群,为杂草抗药性机制的深入研究及其合理治理奠定基础。研究人员以采集于广东省不同地区的13个牛筋草种群为材料,采用整株生物测定法对牛筋草种群进行了百草枯和草铵膦抗药性水平测定,并采用培养皿法和莽草酸含量法对牛筋草种群进行草甘膦抗药性水平测定。     

一种抗草甘膦转基因油菜的快速鉴定方法

为建立一种快速鉴定抗草甘膦转基因油菜的方法,以抗草甘膦转基因油菜品系及后代分离群体为研究材料,利用不同草甘膦浓度滤纸平板进行种子发芽,观察抗性材料和非抗性材料幼胚抗性反应表型,并通过PCR和苗期草甘膦处理进行抗性验证。结果表明,利用0.5~1 g/L的草甘膦溶液处理的抗性材料胚根根毛生长正常,而非抗性材料胚根生长迟缓且光滑无根毛;利用该浓度的处理BC₁和F₂抗性分离群体,幼胚根毛有无性状分离比符合1:1和3:1,幼胚个体的基因组PCR扩增结果与根毛有无呈共分离。通过观察在该浓度草甘膦发芽处理后的幼胚根毛有无,可有效区分抗草甘膦转基因油菜的抗性和非抗性材料。本研究建立的鉴定方法不仅能够对抗草甘膦油菜材料进行快速、准确鉴定,而且能保证材料成活,对抗草甘膦转基因油菜育种和种子纯度鉴定提供技术参考。     

基于抗草甘膦基因的棉花茎尖农杆菌介导转化方法的研究

以中棉所49、珂字棉201和YZ-1为受体材料,通过对培养基草甘膦浓度、农杆菌侵染时间和浓度、共培养时间以及恢复培养条件等因素的优化,建立了基于抗草甘膦基因的棉花茎尖农杆菌转化技术体系,并将抗草甘膦基因(EPSPS-G6)导入3个受体材料,获得转基因抗草甘膦棉花植株.研究结果表明,适合于棉花茎尖农杆菌介导的草甘膦筛选浓度为10 mg·L-1;茎尖转化体系为农杆菌菌液OD600为0.9～1.0,侵染时间为20min,共培养时间为48 h,选用SH培养基并加入适量活性炭(0.5 g·L-1)作为恢复培养基.用本研究创制的转化技术体系,转化处理3个陆地棉受体360个茎尖,共获得60株抗性再生植株,经PCR检测,获得阳性抗性植株26株,移栽成活23株.以茎尖外植体数计算,本体系的转化成功率6.4％.该转化体系适合于转化抗草甘膦基因或以抗草甘膦基因为筛选基因的外源基因,具有转化频率高、嵌合体少、转化周期短等优点.     

薤白EPSP合成酶基因转化烟草提高其草甘膦抗性

葱属植物薤白具有较强的草甘膦抗性.将薤白中与草甘膦抗性相关的EPSP合成酶基因(EPSPsA)cDNA重组到植物表达载体pWM101中,构建薤白植物表达EPSPsA重组载体,采用根癌农杆菌介导法将其转入烟草品种WS38,获得转薤白EPSPsA基因烟草.PCR分析表明,目的基因已经整合进烟草基因组中.对转基因烟草愈伤组织及幼苗进行的草甘膦抗性检测表明,转基因烟草对草甘膦的耐受性明显提高.     

半野生棉与亚洲棉对草甘膦抗性评价及比较分析

采用叶片棉球定位鉴定法,初步鉴定并评价了半野生棉和亚洲棉对草甘膦的自然抗性,结果表明:参试材料抗性水平从高抗至高感分6级,极端抗性水平相差33.3倍(0.2%对0.006%)。其中,半野生棉对草甘膦的自然抗性分级丰富,抗性水平分布自高抗至高感;但大部分半野生棉不耐草甘膦,近86%(346份)的材料抗性水平处于低耐级别以下。而亚洲棉抗性水平都处于高抗至低耐的4个级别,抗性多样性较差,但整体抗性水平较高,70.3%(71份)表现为耐或以上级别。从半野生棉和亚洲棉中分别筛选到2份和5份高抗材料,半野生棉中有1份高感材料,亚洲棉中无对草甘膦敏感材料。本研究报道的极端材料为棉花草甘膦抗性遗传机制研究、新品种的培育、内源抗性基因的挖掘和感抗机理研究,奠定了良好的材料基础。     

农杆菌介导的转双价基因耐草甘膦玉米研究

本研究构建了含有耐草甘膦基因G2-epsps和R79-epsps的双价植物表达载体pCMG2R79-EPSPS,以优良玉米自交系78599和综31的幼胚为受体材料,采用农杆菌介导法将耐草甘膦双价基因G2R79-epsps转入玉米幼胚细胞,以期获得耐草甘膦性更高的转基因玉米植株。目前已获得转基因再生玉米植株32株,经特异PCR检测表明其中7株植株转入了目标基因,阳性率达到21.9%。对得到的阳性植株的T1、T2代进行了跟踪检测,经田间喷施除草剂试验结果表明,获得了可耐草甘膦6‰的玉米材料,即生产上草甘膦田间使用浓度3倍水平的材料,为抗除草剂玉米新品种选育提供了较好的基础材料。     

拟南芥突变体L1.3的表型分析及遗传定位

本研究在转橡胶树Hb CBF1基因的拟南芥后代中,发现了一株矮小突变体。对其进行表型观察,发现突变体叶片颜色为深绿色、叶片椭圆、根系不发达、植株极度矮化、营养生长和生殖生长周期延长。通过基因组重测序技术对该突变体的遗传位点进行了定位,发现Hb CBF1基因的插入破坏了BRI1基因的编码,进而引起突变。通过实时荧光定量PCR对突变体中细胞周期相关基因CDKA、CDKB、CYCB1-1、CYCD3-1的表达量进行分析,发现这些基因的表达量显著低于野生型,推测BRI1基因的突变阻碍了细胞有丝分裂,从而造成矮化等表型。     

肠杆菌20 aroA基因的克隆及功能分析

挖掘草甘膦抗性基因将有助于抗草甘膦遗传改良作物的培育。本研究分离了一株新型草甘膦抗性菌株肠杆菌20(Enterobacter.E20),该菌株在营养缺陷型培养基中能够耐受高达400 mmol/L草甘膦的胁迫,为充分发掘该菌株在草甘膦抗性方面的利用价值,对该菌株进行了全基因组测序(Gen Bank:CP012999.1)。分离克隆了肠杆菌20其EPSPS(5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶)编码基因aroA20(WP_039261572.1),该基因序列长度为1 284 bp,编码427个氨基酸,序列比对分析显示AroA20具有Ⅰ型EPSPS典型的保守结构特征,系统进化分析显示AroA20与大肠杆菌K12的EPSPS具有最近的亲缘关系。利用原核表达系统鉴定了重组aroA20菌株在草甘膦胁迫下的耐受性,在转基因烟草中过表达了aroA20基因并鉴定了转基因植株的草甘膦抗性。研究肠杆菌20与其草甘膦的靶标EPSPS编码基因aroA20在草甘膦抗性上存在差异的分子机制将为深入理解生物体草甘膦抗性奠定研究基础。     

草甘膦胁迫对甘薯生长前期生理特性的影响

为了研究喷施草甘膦之后,甘薯各项生理指标的变化,阐明草甘膦对甘薯生长的影响。以耐草甘膦甘薯品种‘N3014’为试验材料,喷施不同浓度的草甘膦,研究甘薯各项生理指标的变化。结果显示：喷施草甘膦之后,甘薯叶片的净光合速率和叶绿素含量下降,喷施草甘膦的浓度越大,净光合速率和叶绿素含量下降越严重;叶片的CAT活性、MDA含量以及莽草酸含量升高,喷施浓度越大,上升越明显。根茎叶的蔗糖含量均升高,且块根与茎中的蔗糖含量均高于叶片中的蔗糖含量。由此可知,叶面喷施草甘膦药剂,加剧了甘薯叶片膜脂过氧化程度,阻碍了莽草酸途径中芳香族氨基酸和芳香化合物的生物合成,导致莽草酸积累增多;草甘膦通过影响甘薯的光合作用而抑制光合产物的生成,影响光合产物的运输。     

市售草甘膦除草剂对转基因抗草甘膦棉花幼苗生长的影响

 以转基因抗草甘膦棉花种质系G6-7和G6-8及其非转基因遗传背景亲本对照中棉所49为材料,研究了市售10%草甘膦水剂和95%的草甘膦粉剂对抗草甘膦棉花种子萌发和幼苗生长的影响。结果表明,中棉所49对于两种类型的草甘膦均很敏感,幼苗喷施0.2 mmol·L^-1 的10%草甘膦水剂和95%草甘膦粉剂均全部死亡。转EPSPS-G6基因抗草甘膦棉对95%草甘膦粉剂的抗性较好,但对10%草甘膦水剂的抗性较弱。就转基因棉花对两种剂型草甘膦的反应看,喷施2.4 mmol·L^-1的10%草甘膦水剂和95%草甘膦粉剂后,棉花幼苗全株鲜重、叶重、根重、下胚轴长、可溶性蛋白质增量和POD活性等各项指标在两种草甘膦制剂间的差异均达到显著水平。喷施12.0 mmol·L^-1 的10%草甘膦水剂,转基因抗草甘膦棉花的种子发芽率显著低于相同浓度的粉剂,两者之间的发芽率相差25%~75%。研究结果表明,10%的草甘膦水剂中可能含有对棉花幼苗生长发育有害的物质,影响抗草甘膦棉幼苗的生长,在转基因抗草甘膦棉花品种商业化应用时应谨慎使用。     

抗草甘膦基因aroA转化陆地棉胚性愈伤组织的研究

为了建立以草甘膦为选择标记的农杆菌介导的棉花胚性愈伤组织转化体系,本研究将草甘膦抗性基因(aroA)转化陆地棉WC和YZ-1的胚性愈伤组织,分别以5 mg·L-1和10 mg·L-1的草甘膦浓度作为选择压,经过2~3轮筛选,获得了抗性胚性愈伤组织,诱导出胚状体并发育成苗。对T0再生植株进行PCR及草甘膦抗性检测,以WC和YZ-1为受体的转抗草甘膦基因(aroA)分别获得了33株和10株阳性植株,转化效率分别为82.5%和62.5%。该体系为棉花遗传转化提供了实验方法,获得的抗草甘膦棉花为棉花育种提供种质资源;同时抗除草剂基因还可以作为筛选标记与其它基因串联在一起转化棉花,进行基因功能验证。     

转录因子基因ZmDREB3转化玉米的研究

利用玉米转录因子ZmDREB3基因(Gene ID:EU964828.1)构建了Ubiquitin启动子驱动的植物表达载体PGM0229-ZmDREB3-EP-SPS,以EPSPS基因为抗性筛选标记,通过花粉管通道法将农杆菌EHA105介导的植物表达载体转化到玉米自交系吉444、Mo17中,通过喷洒350mg/L草甘膦除草剂筛选,得到7株草甘膦抗性植株,用PCR检测得到2个同时整合EPSPS标记基因和ZmDREB3目的基因的转基因株系,用PCR-Southern进一步验证,结果呈阳性。以上结果证明外源基因已经被整合到玉米基因组中。     

转CP4-EPSPs基因大豆杂交后代对草甘膦的抗性水平与遗传背景的相关性

第一代抗草甘膦转CP4-EPSPs基因大豆GTS40-3-2是国际上应用时间最长、种植面积最大的转基因作物。本文以6份GTS40-3-2衍生的抗草甘膦转基因大豆新品系为亲本,配制4个杂交组合,利用抗性分级法和相对株高法鉴定杂交亲本及其F_(2:3)子代对草甘膦的耐受性差异,分析其抗性水平与遗传背景的相关性。结果表明,以1230 g a.i.hm~(–2)草甘膦喷施处理时,转基因亲本及其F_(2:3)子代的苗期生长受草甘膦抑制不显著,而当喷施浓度提高至3690 g a.i.hm~(–2)和4920 g a.i.hm~(–2)时则抑制作用显著。供试的6个杂交亲本中以ZLHJ06-1568、ZLHJ10-713和ZLHJ06-698对草甘膦的耐受性相对较强,而4个F_(2:3)组合中以ZLHJ10-713×ZLHJ06-698后代在草甘膦喷施后株高受抑制最小,对草甘膦耐受性最强。不同组合后代对草甘膦的耐受性普遍优于其双亲,呈现出杂种优势。各组合后代与亲本之间对草甘膦的耐受性均呈正相关,但由于亲本间互作效应的不同,导致后代抗性水平产生差异。本研究表明草甘膦抗性基因CP4-EPSPs在大豆中的表达水平与其遗传背景相关联,为利用转基因大豆新种质培育转基因大豆新品种过程中目标基因的定向选择提供了参考依据。