对一种多基因组装方法的改进

改建了基于Cre/LoxP重组的2个供体载体和1个兼容Gateway系统的供体载体:pYLd1GW/pYLd2GW、pYLd1GW35s/pYLd2GW35s和pYLd1GWMPK/pYLd2GWMPK。在改建载体的基础上构建了2个供体载体pYLd1GWMdSPDS1和pYLd2GWCBF1,并将2个基因构建于受体载体pYL1305,得到双价表达载体pYL1305MC。采用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,经PCR检测和GUS组织化学染色检测发现,双价基因已成功转入烟草。对6株转基因烟草进行荧光定量PCR检测,发现在不同植株中同一基因表达量差异很大,但2个基因表达量差异趋势一致。     

蚯蚓MT基因植物表达载体的构建及烟草转化

为了提高植物对重金属的耐受力和富集能力,从而减少重金属对土壤的污染,本研究将克隆的赤子爱胜蚓(Eiseniafoetia)MT基因,装入植物表达载体pPZP111,构建了植物表达载体pPZP-efMT。然后用三亲法将其导入根瘤农杆菌EHA105中,通过叶盘法转化烟草。经PCR检测,efMT基因已整合到烟草基因组中,为进一步验证转基因烟草的抗重金属能力奠定了基础。     

菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因在烟草中的表达

构建了含菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因BADH基因的重组植物表达载体pLM46,转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,LBA4404),用农杆菌介导的叶圆盘法对烟草(Nicotiana tabacumL.)叶片进行遗传转化。在含有潮霉素的MS筛选分化培养基上筛选,获基因转化烟草植株4株。经W estern blot等方法检测,证明BADH基因在烟草转化植株中得到了表达。     

菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因在烟草中的表达

构建了含菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因BADH基因的重组植物表达载体pLM46,转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,LBA4404),用农杆菌介导的叶圆盘法对烟草(Nicotiana tabacumL.)叶片进行遗传转化。在含有潮霉素的MS筛选分化培养基上筛选,获基因转化烟草植株4株。经W estern blot等方法检测,证明BADH基因在烟草转化植株中得到了表达。     

产肠毒素大肠杆菌K88-STII-LTA2/LTB融合基因在烟草中的表达

融合保护性抗原的LT类全毒素具有传输抗原载体和免疫佐剂两重功效。利用基因工程技术，构建了带有信号肽的Pr1as-K88ac-STII-LTA 2/UP-LTB融合基因的双价植物表达载体。双价植物表达载体通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101，并利用农杆菌介导技术叶盘法转化模式植物烟草。转基因烟草经PCR和RT-PCR初步检测，证明外源基因已经整合到受体植物基因组中，同时表明融合基因在转录水平上有表达。转基因烟草的获得，为进一步研制新型的抗腹泻植物口服疫苗奠定了良好的基础。     

大肠杆菌甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆及其在烟草中的表达

利用PCR克隆了大肠杆菌甜菜碱醛脱氢酶基因(betB),构建了含betB基因的重组植物表达质粒载体pLM47,并用农杆菌介导的叶圆盘法对烟草叶片进行遗传转化。结果表明,在含有潮霉素的MS筛选分化培养基上筛选,获得基因转化烟草植株3株;经报告基因GVS的组织化学检测和Western blot检测,证明betB基因在烟草转化植株中得到了表达。     

基因枪法将Bhlea2基因导入玉米的初步研究

构建了牛耳草(Boea hygrometrica)胚胎发育晚期丰富蛋白基因(Bhlea2)的植物表达载体pYL1,以玉米(Zea mays L.)自交系501的愈伤组织为受体,利用基因枪法将Bhlea2基因导入,获得51株抗性植株,经PCR检测有10株阳性植株,阳性率为19.6%,初步证明外源基因已整合到玉米基因组中。     

中国抗虫棉GFM Cry1A杀虫基因的合成及表达载体构建

根据苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Cry1A(b)和Cry1A(c)的氨基酸序列,采用植物偏爱密码子,人工合成了全长1824bp的融合GFM Cry1A Bt杀虫基因,并构建了带有多个表达调控元件的该基因高效植物表达戢体pGBI1214AB,以及该基因和修饰豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因的双价杀虫基因植物表达载体pGBI1214ABC。经在烟草中验证,这两种表达载体在植物中可高效表达并赋予转基因烟草抗虫性。为我国抗虫棉的研究打下了基础。     

双价抗虫基因共转化烟草叶绿体的研究

 分别构建苏云金芽孢杆菌晶体毒蛋白基因 [BtCryIA(C) ]和水稻巯基蛋白酶基因 (Oryzacystatin ,OC)叶绿体转化载体 ,其中Bt基因叶绿体转化载体以烟草叶绿体基因trnH psbA trnK为同源片段 ,以水稻 (OryzasativaL .)叶绿体 psbA基因启动子和终止子为调控基因 ;OC基因叶绿体表达载体以烟草叶绿体基因片段 psbA ORF5 12为同源片段 ,以烟草叶绿体 16S启动子和终止子为调控基因 ;两载体均以壮观霉素抗性基因 (aadA)为筛选基因。利用基因枪方法 ,共转化烟草叶片 ,获得壮观霉素抗性植株。经Southern、Western检测、表达蛋白活性测定证明 ,双价抗虫基因己整合到烟草叶绿体中并得到表达。转基因植株抗棉铃虫试验表明 ,转基因植株具有显著杀虫活性     

甘露聚糖酶基因在烟草中的表达

构建了携带湖北大学生命科学学院分子微生物与基因工程实验室克隆的甘露聚糖酶基因的重组植物表达载体pLM50,转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,LBA4404),再用农杆菌介导的叶圆盘法对烟草(Nicotiana tabacumL.)叶片进行遗传转化,在含卡那霉素的MS筛选分化培养基上筛选。结果获基因转化烟草植株4株;经PCR、Western blot等方法检测,证明man基因在烟草转化植株中得了表达。     

适于烟草脆裂病毒诱导的本氏烟基因沉默分析的对照载体构建(英文)

对烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)诱导的基因沉默分析体系中目前最常用的对照载体——空pYL156载体(pYL156∷00)对沉默处理后番茄和本氏烟(Nicotiana benthamiana)植株的病毒症状和生长影响进行分析.结果表明:pYL156∷00沉默处理后的番茄和本氏烟植株均表现出严重的系统性病毒症状,生长受到显著抑制,因此,pYL156∷00并不是一个用于TRV诱导的番茄和本氏烟基因沉默分析的好的对照载体;为获得更好的对照载体,试验构建了2个新的对照载体pYL156∷NIRi和pYL156∷eGFP,它们分别通过在pYL156∷00载体多克隆位点插入253bp菜豆亚硝酸还原酶基因内含子序列和400bp eGFP基因片段而获得,对这2个对照载体对沉默处理后本氏烟植株的病毒症状和生长情况的影响与pYL156∷00进行比较分析.结果表明:pYL156∷00沉默处理后的植株表现出较严重的系统性病毒症状,生长受到显著抑制,其中26.7%植株死亡;pYL156∷NIRi沉默处理后的植株也表现出明显的病毒症状以及生长受抑制现象,但与pYL156∷00相比,所受影响较小,只有13.3%植株死亡;而pYL156∷eGFP沉默处理后的植株不表现明显的病毒症状,植株生长也不受显著影响;病毒积累量检测结果显示,3个对照载体沉默处理的植株病毒症状和生长受抑制情况与植株体内TRV病毒的积累水平密切相关.这些结果表明,新构建的pYL156∷eGFP可以作为一个优越的对照载体应用于TRV诱导的基因沉默分析.     

矮牵牛PhDFR基因和抗除草剂Bar基因植物表达载体的构建及对烟草的遗传转化研究

[目的]构建矮牵牛PhDFR基因的植物表达载体,并对烟草进行遗传转化。[方法]从不同花色的矮牵牛中克隆了2个PhDFR基因,通过目的基因序列克隆、多步载体酶切、连接、转化等技术手段,将其连入通用植物表达载体pCAMBIA2300及pCAMBIA3301。利用冻融法将重组质粒导入农杆菌GV3101继而转化烟草。[结果]构建了含卡那霉素抗性筛选标记基因NPT11和除草剂抗性筛选标记基因Bar的GFP融合蛋白植物表达载体pCAMBIA2300-PhDFR-GFP和pCAMBIA3301-PhDFR-GFP。转基因植株的GUS染色结果进一步验证了所构建表达裁体的正确性和实用性。[结论]所构建的表达载体为进一步研究PhDFR基因在植物花色调控效应的功能及开展植物花色改良基因工程研究奠定了基础,为植物基因工程科研工作提供了优良的备选植物表达我体。     

Pti5基因植物双元表达载体的构建及鉴定

Pto基因编码丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,对番茄细菌病具有良好抗性。Pti5是与Pto互作的蛋白质,Pti5蛋白与广泛存在的病程相关蛋白基因（PR基因）中的顺式元件相结合,可增强PR基因的表达,为提高植物抗病性提供了有效的途径。本研究将Pti5基因构建到植物双元表达载体pBI121上,获得pBI121UCH1重组质粒,并将该质粒转到根癌农杆菌LBA4404中,为植物利用根癌农杆菌转化系统转Pti5基因进行抗病基因工程育种奠定了基础。     

含绿色荧光蛋白(gfp)基因的植物重组表达载体pBI121-GFP-62390和pBI121-GFP-51780的构建

[目的]构建含绿色荧光蛋白(gfp)基因的植物重组表达载体pBI121-GFP-62390和pBI121-GFP-51780。[方法]用PCR方法扩增psmGFP的GFP片段,BamHI和SacI双酶切PCR产物,同时用BamHI和SacI双酶切pBI121。从琼脂糖凝胶中回收纯化pBI121的大片段,经连接、转化、鉴定出改造后的质粒。[结果]用PCR方法扩增得到长度为740 bp的增强型的绿色荧光蛋白基因片段,克隆入pBI121表达载体后,获得了新的重组质粒pBI121-GFP。分别将编码拟南芥BAG7、BAG4蛋白的基因At5g62390和At3g51780通过PCR方法扩增后,克隆入pBI121-GFP,构建了用于超量表达BAG蛋白基因的GFP融合蛋白双元表达载体pBI121-GFP-62390和pBI121-GFP-51780。利用细胞感受态法将该植物表达载体分别导入根癌农杆菌GV3101中。[结论]为进一步研究BAG蛋白在拟南芥抗性胁迫中的功能及其在细胞内的动态分布奠定了基础。     

苹果周期蛋白依赖性蛋白激酶亚基基因MdCKS表达载体的构建

根据GenBank上与周期蛋白依赖性蛋白激酶基因相关序列,从苹果MdCKS基因编码区设计带有XbaI和SalI酶切位点的引物。以富士MdCKS基因的eDNA为模板将PCR扩增片段连接到pMD18-TSim-pieVector上,测序正确后,再连接到植物表达载体pBII21上,经过抗性筛选和测序验证,成功构建了MdCKS基因表达载体。并通过电击转化法导入农杆菌LBA4404,以备将来用于番茄转化。     

开花调控基因BpMADS4无抗性表达载体的构建

为了构建含有报告基因GFP基因和BpMADS4基因的无抗性双元表达载体pCAMBIA1302-GFP-Bp,参考已发表的欧洲白桦（Betula pendula）开花调控基因（BpMADS4）序列,利用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）从欧洲白桦的幼嫩花序中克隆得到促进开花的BpMADS4基因。将该基因替换pCAMBIA1302载体中的潮霉素抗性基因,构建含有报告基因GFP基因和BpMADS4基因的无抗性双元表达载体pCAM-BIA1302-GFP-Bp。结果表明：成功构建了无抗性双元表达载体pCAMBIA1302-GFP-Bp。该表达载体在苹果遗传转化中不使用抗生素筛选,可以解决抗生素抗性筛选降低苹果转基因转化效率的问题以及转基因苹果中选择标记基因造成的生物安全性问题,用该载体转化苹果可以缩短苹果童期,有效提高其育种效率。本研究为筛选对环境安全的、具有易成花特性的苹果新种质奠定了基础。     

双抗植物表达载体的构建

用限制性内切酶将抗虫的胰蛋白酶抑制剂（ＴＩ）基因从质粒ｐＢｉｎ２０上切下,插入带有抗细菌的抗菌肽Ｂ和抗菌肽Ｄ基因的植物表达载体ｐＤＢ３的ＸｂａⅠ位点。通过点杂交和酶切鉴定,得到了带有３个抗性基因的双抗植物表达载体ｐＤＢＴ．     

单子叶植物表达载体pUN3300的构建

植物双元表达载体在植物基因工程研究中具有重要作用,表达载体所包含的结构元件,如启动子、多克隆位点、筛选标记等,对植物遗传转化效率、外源基因表达强度及遗传稳定性等具有重要影响。本研究中,为提高目的基因对单子叶植物的遗传转化效率,对植物表达载体pCAMBIA3300进行改造,在原有以bar基因作为选择标记的基础上,采用不完全酶切的方法添加了Ubiquitin启动子,经酶切、测序表明,植物双元表达载体pUN3300构建成功。该载体对于研究外源基因功能、植物性状改良及新品种的培育,具有重要的价值。