以LacZ为报告基因探讨促进基因表达及基因免疫应答物质的筛选

应用分子生物学技术构建了LacZ报告基因的pcDLacZ真核表达载体 ,并对多种促进基因表达的物质进行了筛选。应用筛选的促进基因表达物质对pcDST基因疫苗的免疫增强效果进行了观察。结果 :构建的LacZ报告基因的pcDLacZ真核表达载体 ,肌注后 1天就有表达 ,到第 7天达到高峰。通过对多种促进基因表达的物质进行筛选证明 ,4.5 %斯苯、1 %甘油、2 5 %蔗糖有明显促进基因的表达作用。 4.5 %斯苯、1 %甘油能促进pcDST猪瘟基因疫苗的免疫效果。表明 :4.5 %斯苯、1 %甘油可做为基因疫苗的免疫佐剂使用     

LacZ基因在小鼠骨骼肌中表达的时─空模式

以ＬａｃＺ为报告基因,利用ＤＮＡ重组技术构建了ＬａｃＺ真核表达质粒ｐＣＤＬａｃＺ,ｐＣＤＬａｃＺ肌注小鼠后,Ｘ－Ｇａｌ染色法及半乳糖苷酶定量分析结果表明,ＬａｃＺ基因在小鼠胫前肌中得到表达,并在肌注后第７天左右达到高峰,表达的ＬａｃＺ主要分布于胫前肌近膝关节肌腱结合处,提示肌肉接种基因疫苗应采用纵向,接种部位应接近肌腱结合处。     

LazZ基因在小鼠骨骼肌中表达的时—空模式

以ＬａｚＺ为报告基因,利用ＤＮＡ重组技术构建了ＬａｃＺ真核表达粒ｐＣＤＬａｃＺ,ｐＣＤＬａｃＺ肌注鼠后,Ｘ－Ｇａｌ染色法及半乳糖苷酸定量分析结果表明,ＬａｃＺ基因在小鼠胫前肌中处,提示肌肉接种基因疫苗应脂取纵向,接种部位应接近肌腱结合处。     

表达大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

对已构建的重组质粒ｐＸＳＴ１进行了核苷酸序列分析和免疫原性研究。序列分析结果表明，该粒中含有２个正向串联在一起的ＳＴ１基因，且融合在ＬａｃＺ基因的上游，具有正确的阅读框架。免疫实验结果表明，构建的ＤＨ５α重组菌株安全无毒。     

PEG法GUS基因在水稻原生质体及其愈伤组织中的瞬间表达初报

本文作者构建了ｐＸＭ１和ｐＧＣＹ６两个质粒，其中质粒ｐＸＭ，含有高赖氨酸基因和ＧＵＳ报告基因，质粒ｐＧＣＹ６则由裂解多肽Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ｂ基因和ＧＵＳ基因组成。这两个基因均以ＣａＭＶ３５Ｓ作为启动子，以ＮＯＳ作为终止子。经纯化的质粒ＤＮＡ以ＰＥＧ法导入４个水稻品种：８９－２、Ｌａｃｃａｓｉｎ、Ｃｙｐｒｅｓｓ、台北３０９细胞悬浮系的原生质休中，组织化学检测结果表明，ＧＵＳ基因在原生质体、愈伤组织及     

马立克氏病病毒gB基因的重组痘苗质粒构建

根据马立克氏病病毒（ＭＤＶ）ｇＢ基因序列设计ＰＣＲ引物,以ｇＢ质粒为模板,扩增出ＭＤＶｇＢ基因５’端到３’端３８８ｂｐ的ＤＮＡ片段。用ＥｃｏＲⅠ和ＸｂａⅠ双酶消化ＰＣＲ产物,将其克隆入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ质粒,构建中间质粒Ⅰ;用ＸｂａⅠ消化ｇＢ质粒,切出ＭＤＶｇＢ基因ＸｂａⅠ片段,并正向克隆入中间质粒Ⅰ的ＸｂａⅠ位点,将ＭＤＶｇＢ基因１３７ｂｐ的ＰＣＲ产物与其ＸｂａⅠ片段正向连接,构建中间质粒Ⅱ用ＥｃｏＲⅠ调出中间质粒Ⅱ中的ＭＤＶｇＢ基因,正向克隆入痘苗病毒表达载体ｐ１６启动子下游,构建ＭＤＶｇＢ基因表达质粒ｐ１６－ＭＤＶｇＢＭＤＶｇＢ基因重组痘苗表达质粒的成功构建,为下一步进行重组病毒的构建及ＣＴＬ应答的深入研究奠定了基础     

十字花科花药特异性基因保守序列研究初报

构建了庭荠花芽ｃＤＮＡ文库,用Ｂｃｐ１作探针,筛选文库。来自油菜ｃＤＮＡ克隆的Ｂｃｐ１是一种在单倍体花粉和二倍体绒毡层均能表达的花药特异性基因,通过核酸杂交筛选,期望分离出与Ｂｃｐ１同源性克隆,分析这些基因ＤＮＡ和蛋白质序列,找出它们具有重要功能的保守序列。     

新型伪狂现病毒基因缺失株的构建

以伪狂犬病病毒Ｆａ株为起我建;的ｐｐ６３ＬａｃＺ转移载体质粒与ＰＲＶ Ｆａ ＤＡ经磷酸钙转染,在ＭＤＢＫ细胞内同源重组获得ＰＲＶ Ｆａ ｇＥ／ｇｉ＾－／ＬａｃＺ基因缺失株。以ＰＤＴＫ３－６,５－６ＴＫ缺失质粒与上述基因缺失株在ＴＫ＾－１４３细胞内同源重复且,获得ＰＲＶ－ＳＡ２１５等三基因缺失株。经核酸杂交证实构建是成功的。生物学特性观察显示,该基因缺失株对多种动物安全,具有良好的免疫原性,有望成为     

家蚕核多角体病毒Lef—1和DA26基因的克隆及部分序列分析

ｌｅｆ－１和ＤＡ２６基因分别位于ｅｇｔ基因的上游和下游．从ｐＵＡｃ－ｅｇｔ中分离出ＥｃｏＲＩ－ＸｂａＩ１．１ｋｂ的ｅｇｔ基因片段，进行缺口平移标记，获得探针。与ＢｍＮＰＶＤＮＡ经ＨｉｎｄⅢ酶切、电泳、转移至ＮＣ膜的ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交，发现ＢｍＮＰＶＤＮＡ的ＨｉｎｄⅢＤ片段呈阳性。从ＢｍＮＰＶ基因组中分离出１０．４ｋｂ的ＨｉｎｄⅢＤ片段，用ＥｃｏＲＩ酶切得到ＨｉｎｄⅢ－ＥｃｏＲＩ２．２ｋｂ、ＥｃｏＲＩ１．４ｋｂ和ＥｃｏＲＩ－ＨｉｎｄⅢ６．８ｋｂ３个片段，分别克隆于ｐＵＣ１９中，命名为ｐＵＨＥ２．２、ｐＵＥ１．４和ｐＵＥＨ６．８。经双链测序并与ＡｃＮＰＶ相关基因序列进行比较，发现ｌｅｆ－１基因被克隆于ｐＵＨＥ２．２中，ＤＡ２６基因克隆于ｐＵＥＨ６．８中。从所测定的ｌｅｆ－１和ＤＡ２６基因的启动子及５＇端部分序列来看，它们在ＡｃＮＰＶ和ＢｍＮＰＶ之间有极高的同源性。     

猪瘟基因疫苗免疫小鼠外周血细胞免疫动态变化研究

应用ＦＡＣＳ、ＭＴＴ法对猪瘟基因疫苗ｐｃＤＳＴ、ｐｃＤＳＷ免疫鼠外围血中ＣＤ４＾＋和ＣＤ８＾＋淋巴细胞数、淋巴细胞的转化功能等动态变化进行了观察。结果：ｐｃＤＳＴ、ｐｃＤＳＷ猪瘟基因疫苗免疫小鼠后,小鼠的外周血淋巴细胞对ＬＰＳ有强烈的反应性,ＣＤ４＾＋细胞数量增加,外周血淋巴细胞ＣＤ８＾＋细胞数量在一段时间内增加。ＣＤ４＾＋和ＣＤ８＾＋细胞数量在免疫后３２天达到高峰后开始下降。表明ｐｃＤＳＴ、ｐｃＤＳＷ质粒免疫小鼠后诱发免疫反应。     

牛冠状病毒4H12/1D4单链基因片段在大肠杆菌中的表达

用ＥｃｏＲＩ酶切ＰＲ５Ｂ４质粒，采用“Ｖ”字形内槽电洗脱法回收约０．８０４Ｋｂ牛冠状病毒基因工程抗体４Ｈ１２／１Ｄ４单链基因片段，并将其插入载体质粒ＰＥＴ－１７ｂ的ＥｃｏＲＩ位点构成重组质粒ＰＥＴ－Ｄ４，将重组质粒转化ＤＨ５α感受态细胞，在ＩＰＴＧ的诱导下表达，细菌裂解物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳筛选，发现含ＰＥＴ－Ｄ４细菌经诱导新增一条约２８ＫＤα蛋白带，该蛋白带与设计基因工程抗体的大小相符，经光密度扫描，表达量约占菌体总蛋白的１４％     

VP1intron敲除对pSVL-WAP-tPA暂时性乳腺定位表达的影响

在以ｃＤＮＡ表达外源蛋白时,表达载体中是否含有ｉｎｔｒｏｎ 会对表达造成一定的影响－ 利用基因工程手段将乳腺定位表达载体ｐＳＶＬＷＡＰｔＰＡ 中ＶＰ１ｉｎｔｒｏｎ 敲除,构建了表达载体ΔｐＳＶＬＷＡＰｔＰＡ－ 采用基因直接注射方法将两种表达载体分别注入家兔乳腺中,溶圈试验结果显示,ＶＰ１ｉｎｔｒｏｎ 去除后,ｔＰＡ 表达水平有所提高,分娩后第５ ｄ 乳中表达水平分别为４００ μｇ·Ｌ－１和６５０ μｇ·Ｌ－ １－     

表达禽流感病毒凝素基因的重组禽痘病毒的构建

为构建表达禽流感病毒（ＡＩＶ）血凝素（ＨＡ）基因的重组禽痘病毒,将禽痘病毒启动子ＬＰ２ＥＰ２驱动的Ｈ７亚型ＡＩＶ ＨＡ基因ｃＤＮＡ和大肠杆菌ＬａｃＺ基因插入禽痘病毒疫苗株Ｆ－０１７的复制非必需区。经蓝班筛选后,对重组病毒又进行了３次蚀斑克隆。以不同代次重组禽痘病毒核酸为模板,利用Ｈ７亚型ＡＩＶ ＨＡ基因特异的引物进行聚合酶链式反应,均扩增出１条特异的１．７ｋｂ ＤＮＡ条带。收集不同代次的重组禽痘病毒细胞培养物进行免疫斑点试验,均检测到ＨＡ蛋白,表明Ｈ７ ＨＩＶ ＨＡ在重组禽痘病毒中获得了成功表达。该重组禽痘病毒的构建为ＡＩＶ病毒活载体疫苗的研制奠定了基础。     

表达重组鸡新城疫病毒免疫原蛋白基因的研究

以ＮＤＶ ＨＮ基因重组禽痘病毒载体与禽痘病毒转染液为材料,以载体质粒的ＬａｃＺ报告基因为筛选标记,在含有Ｘ－ｇａｌ的培养基上筛选蓝色空斑的阳性重组子,对初次筛选到的蓝色空斑经过三轮蚀斑纯化,得到了能稳定增殖的病毒子,再分别提取病毒子感染细胞,正常对照细胞基因组ＤＮＡ,ＢａｍＨ Ｉ酶切后,以ＤＩＧ标记的探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测,发现重组病毒感染的细胞基因组ＤＮＡ在７ｋｂ处有一ＤＮＡ片段,能与     

尿激酶原基因cDNA在BHK21细胞中的表达

将人尿激酶原基因ｃＤＮＡ分别插入到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子和ｐＳＶ２ｎｅｏ的ＳＶ４０启动子下游,构建了重组表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＵＫ和ｐＳＶ－２－ＵＫ分别将这两种表达质粒以脂质体载体法转染ＢＨＫ２１细胞。ＥＬＩＳＡ检测结果表明,ｐｃＤＮＡ３－ＵＫ和ｐＳＶ２－ＵＫ在哺乳动物细胞中能够表达,７２ｈ表达量分别为２８．７ｎｇ／ｍｌ和１３．５ｎｇ／ｍｌ。     

含有IBV S1基因的昆虫杆状病毒表达载体的构建

以含有鸡传染性支气管炎病毒Ｈｏｌｔｅ株Ｓ１基因的重组质粒ｐＵＣ１８－Ｓ１．Ｈｏｌｔｅ和ｐＵＣ１８－Ｓ‘１．Ｈｏｌｔｅ为材料,分别构建了可表达ＩＢＶ Ｓ１基因的昆虫杆状病毒转移载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＾＋Ｘ３－Ｓ１．Ｈｏｌｔｅ（含ＩＢＶ先导序列）,ｐＳＸＩＶＶＩ＾＋Ｘ３／４－Ｓ１．Ｈｏｌｔｅ（ＩＢＶ先导序列为融合短肽）,ｐＡｃＧＨＬ－Ｃ－Ｓ１,Ｈｏｌｔｅ。     

人参皂甙对酵母菌中β—半乳糖甙酶诱导的影响

研究了红参皂甙（总皂甙，皂甙组分Ｒｂ１和Ｒｇ１）对酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中的β－半乳糖甙酶诱导的影响，认为人皂甙将穿过细胞膜，在细胞核中起甾体激素作用。为了达到这一目的，把包含ＣＡＬ１启动子的ＥｃｏＲＩ的ＤＮＡ片段（６８５ｂｐ）插入到质粒ＹＥｐ３５６（７．９６６ｋｂ）的ＬａｃＺ基因上游的多酶切点，假设由此产生的质粒ＰＧＡＬ１－ＬａｃＺ在半乳糖存在下仅表达β－半乳糖     

转座子报告基因Tn5gusA5诱变甘蓝黑腐病菌分离与致病相关的突…

构建携带报告基因的转座子Ｔｎ５ｇｕｓＡ５于广谱性ｃｏｓ质粒ｐＬＡＦＲ１上，利用Ｔｎ５ｇｕｓＡ５诱变野生型甘蓝黑腐病黄单胞菌，筛选与致病性有关的因子（胞外多糖，胞外酶）突变体，通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和报告基因ｇｕｓ表达验证，突变体是由转座子诱变所致。     

尿激酶原基因cDNA在BHK21细胞中的表达

将人尿激酶原（Ｐｒｏ－ＵＫ）基因ｃＤＮＡ分别插入到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子和ｐＳＶ２－ｎｅｏ的ＳＶ４０启动子下游,构建了重组表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＵＫ和ｐＳＶ２－ＵＫ,分别将这两种表达质粒以脂质体载体法转染ＢＨＫ２１细胞。ＥＬＩＳＡ检测结果表明,ｐｃＤＮＡ３－ＵＫ和ｐＳＶ２－ＵＫ在哺乳动物细胞中能够表达,７２ｈ表达量分别为２８．７ｎｇ／ｍｌ和１３．５ｎｇ／ｍｌ。     

新城疫病毒融合蛋白基因片段的构建与鉴定

本文重缚和构建了新城疫病毒（ＮＤＶ）融合蛋白基因,并对该基因进行了鉴定,将新城疫病毒Ｆ基因片段经ＲＴ－ＰＣＲ扩增,插入经ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ酶切的克隆载体ｐＵＣ１８及表达载体ｐＧＥＭＥＸ,转化大肠杆菌ＪＭ１０９株,用氨苄青霉素平板法初步筛选克隆,再用双酶切法,核酸探针,ＰＣＲ及核苷酸序列分析法鉴定,表明插入成功并且阅读框架正确。