牛病毒性腹泻病毒抗原捕获ELISA方法的建立

用兔抗牛病毒性腹泻病毒(BVDV)多抗作为包被抗体,BVDV NS3单克隆抗体作为捕获抗体,建立了检测BVDV抗原的捕获ELISA方法,对各项反应条件进行优化,最终获得最佳工作条件为兔多抗1∶1 600稀释包被,NS3单抗1∶2 000稀释,酶标抗体工作浓度为1∶4 000稀释。特异性和敏感性试验结果表明,该方法对牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛分支杆菌无特异性交叉反应,其最低可检测7.9×103个TCID50的病毒量,与RT-PCR方法的相比较,符合率为100%。所建立的BVDV抗原捕获ELISA方法快速、特异、敏感,可用于BVDV抗原的检测。     

牛病毒性腹泻病毒抗体胶体金检测试纸条的制备

采用sf9昆虫细胞-杆状病毒系统重组表达牛病毒性腹泻病毒P80蛋白抗原,经纯化鉴定后将P80蛋白用胶体金标记作为示踪抗原,未标记的P80抗原作为捕获抗原,并以羊抗牛IgG抗体作为质控抗体,建立了牛病毒性腹泻病毒抗体快速诊断试纸条。试验结果表明,该试纸条检测灵敏度高,特异性良好,与牛口蹄疫病毒、牛传染性鼻气管炎病毒无交叉反应。使用建立的胶体金试纸条和IDEXX牛病毒性腹泻病毒ELISA抗体检测试剂盒同时检测80头份牛血清,阳性结果符合率为86.7%,阴性结果符合率为100%,总符合率为95%。该试纸条可用于临床牛病毒性腹泻病毒抗体的诊断和检测。     

牛支原体间接ELISA检测方法的建立

以牛支原体(Mycoplasma bovis)全菌蛋白经超声波裂解后的裂解物作为包被用抗原,建立检测牛支原体血清抗体的间接ELISA方法。通过棋盘滴定法确定抗原最适包被浓度、待检血清最佳稀释度,同时对抗原的包被方式、封闭剂和封闭时间、酶标二抗最佳工作浓度、一抗和二抗最佳作用时间、血清稀释液、底物显色时间进行优化。用该方法测定10份阴性血清的OD450值计算出阴性临界值,并对牛布氏杆菌病、牛病毒性腹泻黏膜病抗血清进行检测。结果:抗原最适包被浓度为200μg/mL,待检血清最佳稀释度为1∶100,阴性临界值为0.327。用该方法检测牛布氏杆菌病、牛病毒性腹泻黏膜病抗血清均无交叉反应,表明该间接ELISA具有很好的特异性。     

基于单抗捕获牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原ELISA方法的建立及应用

应用制备的牛病毒性腹泻病毒(BVDV) CC13B毒株E2蛋白的单克隆抗体与多克隆抗体,建立了基于单抗捕获牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus,BVD-MDV)抗原的双抗体夹心ELISA方法。方阵试验确定的捕获BVDV抗原的单克隆抗体最佳抗体包被量为200 ng/孔,酶标多克隆抗体的最佳稀释浓度为1 000倍稀释。对100份BVDV阴性粪便样品进行检测与统计学处理,确定了夹心ELISA检测BVDV抗原的判定标准为待检样品D₄₉₀值≥0.156 7时,检测结果判定为阳性。特异性、敏感性和重复性试验结果显示,建立的检测BVDV抗原的方法具有特异、敏感、快速及重复性好等特点。以建立的单抗捕获BVDV抗原的夹心ELISA方法,调查了山东、河南和吉林3省部分地区牛群BVDV感染情况,发现上述地区牛群的BVDV感染率低至6%。本研究结果为BVDV感染的诊断、检疫、净化及防制提供了有效的技术手段及流行病学理论依据。     

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原捕获ELISA检测方法的建立

用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)单克隆抗体包被酶标板,以兔多克隆抗体作为夹心抗体,建立BVDV抗原捕获ELISA(AC-ELISA)检测方法,优化反应条件并对该方法的稳定性等指标进行了测试和评价。结果表明,单抗最佳包被质量浓度为5μg/mL,兔多抗血清最佳质量浓度为10μg/mL;单抗在4℃包被12~24 h,多抗在37℃作用1 h为双抗体的最佳反应条件;酶标抗体最适稀释度1∶10000,最适作用时间为1 h;采用1%BSA和1%明胶分别在抗体包被后和加入待检抗原反应后进行两次封闭效果好。用AC-ELISA方法检测临床采集的11份牛腹泻病料和12份健康牛组织样品,同时以病毒分离和RT-PCR检测方法做对比,3种方法符合率很高。研究表明AC-ELISA方法稳定性好,可用于BVDV的临床快速检测。     

BVDV E2蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

本试验克隆、表达了牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的E2蛋白,以表达纯化后的E2蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件建立了间接ELISA检测法.确定该方法的阴阳判定临界值为0.33,抗原包被浓度为8μg/mL,一抗的最佳稀释度为1:100,10％PEG4000为最佳封闭液,酶标二抗最佳稀释度为1:6000.用建立的ELISA...     

猪流行性腹泻病毒双抗夹心ELISA的建立

用猪流行性腹泻病毒（PEDV）免疫蛋鸡后提取抗猪流行性腹泻病毒的特异性卵黄抗体为捕获抗体,鼠抗猪流行性腹泻病毒多克隆抗体为检测抗体,建立了猪流行性腹泻病毒病原检测的双抗夹心ELISA,其最适包被抗体浓度为1:4000（12.35μg/mL）,鼠抗猪流行性腹泻病毒的多克隆抗体最佳浓度为1:6000（10.25μg/mL）,样品反应时间为30min,酶标抗体工作浓度为1:6000,并以OD450≥0.130作为阳性判断标准。该方法与猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒、猪流感病毒、大肠杆菌K88、K99、987P、F41等病原无交叉反应。对经猪流行性腹泻病毒PCR检测的100份粪便样本进行检测表明,8份PCR检测阳性样本中6份为本法阳性;PCR阴性者本法全部阴性。实验结果表明该方法具有良好的特异性和敏感性,可用于猪流行性腹泻病毒的快速检测。     

利用重组E2蛋白检测BVDV血清抗体间接Dot-ELISA方法的建立

利用大肠杆菌表达的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)重组E2蛋白作为抗原,建立了检测BVDV血清抗体的间接Dot-ELISA.最佳工作条件为:E2蛋白抗原的最适包被质量浓度2.0 mg/L(2.0 ng/点),酶标抗体的工作浓度为1:500,血清稀释度为1:100,3%明胶-TBS作为封闭液,封闭45 min效果最佳.通过重复性试验、交叉试验、特异性试验和稳定性试验等证明,该方法重复性好、特异性强、灵敏度高;与用BVDV全病毒为抗原的IDEXX ELISA试剂盒相比,特异性96.67%,灵敏度90%,符合率95%.应用建立的检测方法对河北省4个奶牛场采集的178份腹泻奶牛血清样本进行检测,结果BVDV血清抗体阳性率40.45%,与IDEXX ELISA试剂盒的检出率无明显差异.     

牛病毒性腹泻病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

将牛病毒性腹泻病毒超免疫血清以常规方法提取IgG，采用过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶（HRP），建立了从粪样中检测牛病毒性腹泻病毒抗原的双抗体夹心ELISA。结果，抗体的最佳包被量为150μg／mL，酶标抗体最适工作浓度为1：200；封闭液为50mL／L的兔血清；待检粪样及酶标抗体的感作时间为37℃ 120min；底物显色时间为室温15min。应用建立的检测方法对河北省8个大中型奶牛场298份乳牛腹泻粪样进行了检测，结果，阳性检出率为42．6％。     

牛传染性鼻气管炎病毒抗体胶体金检测试纸条的制备

采用SF 9昆虫细胞-杆状病毒系统重组表达牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗原,经纯化鉴定后将gD蛋白用胶体金标记作为示踪抗原,未标记的gD抗原作为捕获抗原,并以羊抗牛IgG抗体作为质控抗体,建立了牛传染性鼻气管炎病毒双抗原夹心法胶体金检测试纸条。试验结果表明,该试纸条检测灵敏度高,特异性良好,与牛口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒等阳性血清无交叉反应。使用建立的胶体金试纸条和IDEXX牛传染性鼻气管炎病毒抗体ELISA检测试剂盒同时检测112份牛血清,阳性符合率为93.5%,阴性符合率为96.0%,总符合率为94.6%。说明该试纸条可以应用于临床牛传染性鼻气管炎病毒抗体的诊断和检测。     

抗BVDV卵黄抗体的制备

采用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)免疫产蛋母鸡,然后用水稀释法成功地从卵黄中分离出抗BVDV免疫球蛋白(抗-BVDV IgY)。建立起测定鸡蛋中特异性抗BVDV活性的间接ELISA方法,并采用此方法检测每次免疫后第10天的抗体滴度。结果表明,蛋鸡在首次免疫后第10天,卵黄中可以检测到抗-BVDV IgY;5次免疫后,抗体效价达到1:6400,半年后仍能维持在该水平。     

抗CP型、NCP型牛病毒性腹泻病毒高免卵黄抗体的制备

本研究采用致细胞病变（cytopathic,CP）型牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus,BVDV）标准毒和非致细胞病变（noncytopathic,NCP）型新疆优势毒株免疫产蛋鸡,用改良PEG法提取卵黄抗体(IgY),并对提取的IgY采用SDS-PAGE检测纯度,间接ELISA检测免疫后每隔7 d的抗体效价,并测定所得抗体对NCP型BVDV的中和效价。结果表明,用该法提取的IgY纯度较高;间接ELISA结果证明,经过4次免疫后,抗CP型BVDV的效价达到1∶32000,抗NCP型BVDV的效价达到1∶40000,3个月后再次检测,卵黄抗体效价未见明显下降。最后一次免疫14 d的抗体对NCP型BVDV的中和效价达到1×10_^-3。     

禽白血病病毒ELISA检测方法的建立与初步应用

本研究以在毕赤酵母系统中表达并纯化的p27重组蛋白为包被抗原,HRP标记的兔抗鸡IgY为酶标二抗,建立了一种快速有效的禽蛋白血病病毒ELISA检测方法,并对其反应条件进行优化。结果显示,该方法具有良好的特异性和重复性;与市售商品试剂盒相比,符合率为96.92%,且更为敏感。应用建立的ELISA方法检测来自吉林省内鸡场314份疑似样品,阳性检出率为75.15%。本研究为禽白血病病毒的检测与诊断提供了一种简便、有效的检测方法。     

抗猪流行性腹泻病毒变异株卵黄抗体的制备、纯化及其活性影响因素的研究

为制备抗猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）变异株卵黄抗体并探索卵黄抗体的纯化方法，本试验采用灭活的PEDV变异株CH/JX01全病毒免疫蛋鸡，收集免疫后所产的鸡蛋，分别用水稀释法、PEG-6000法和水稀释-硫酸铵二次沉淀法对鸡蛋中IgY进行提纯，然后运用间接ELISA和Western blotting方法鉴定和比较3种方法的提纯效果，获得可用于规模化生产的提纯方法；同时研究不同温度、pH条件下抗体活性，寻找对提纯IgY活性具有保护作用的物质。结果显示，本试验成功制备了抗PEDV变异株的卵黄抗体。浓度检测结果表明，水稀释法提取的IgY浓度最高，为6.204 mg/mL；PEG-6000方法提纯的IgY浓度次之，为4.673 mg/mL；水稀释-硫酸铵二次沉淀法IgY浓度最低，为3.359 mg/mL。间接ELISA检测结果表明，水稀释-硫酸铵二次沉淀法提纯的IgY效价最高，为1：12 800；其次是PEG-6000，为1：6 400；而水稀释法最低，为1：1 600。综合3种方法所提纯的卵黄抗体浓度与效价，发现水稀释-硫酸铵二次沉淀法的提纯效果优于其他两种方法。活性影响因素试验结果表明，提纯的IgY在37~60℃活性稳定；pH为4.0~11.0时具有良好的活性；在酸性条件下，20%硫糖铝对IgY活性具有较好的保护作用。本试验结果将为卵黄抗体的大规模生产运用与储存提供了有效的参考依据。     

牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体的制备及阻断ELISA方法的建立

为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)血清抗体的阻断ELISA方法,本研究以经蔗糖密度梯度离心法纯化的IBRV作为免疫原制备1株单克隆抗体(MAb),命名为cp-1-1。经间接ELISA、IFA和western blot鉴定,该MAb与IBRV呈阳性反应,与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)及牛副流感病毒3型(BPIV3)呈阴性反应,具有较强的特异性。质谱分析结果显示MAb cp-1-1识别的表位位于IBRV VP8蛋白。以纯化的IBRV作为包被抗原、MAb cp-1-1作为检测抗体,建立检测IBRV血清抗体的阻断ELISA方法。该检测方法的抗原包被量为0.89μg/孔,样品稀释度为12,检测抗体MAb量为1.3μg/孔,二抗稀释度为15000。利用50份IBRV抗体呈弱阳性的牛血清(中和抗体效价为14~116)作为标准参考血清,确定该检测方法的阻断率Cut Off值为52.06%,即阻断率高于52.06%时判为阳性,低于52.06%时判为阴性。阻断ELISA方法特异性试验显示仅IBRV阳性血清检测为阳性,而BVDV、BPIV3、牛腺病毒3型(BADV-3)和O型口蹄疫病毒(O-FMDV)阳性牛血清均检测为阴性,表明该方法具有较强的特异性;该方法可检测的最低中和抗体效价为14,与病毒中和试验的敏感性一致,表明该方法具有较高的敏感性;重复性试验显示该方法批内、批间变异系数均小于10%,显示较好的重复性。对130份现地牛血清检测结果显示,该方法与病毒中和试验的符合率为98.46%。用该方法对某牛场接种IBRV灭活疫苗的牛血清进行检测,抗体阳性率为99.51%(205/206)。另外,采用该方法对我国8个省(市、自治区)的801份牛血清进行检测,IBRV的抗体阳性率为41.6%(333/801)。本研究建立的阻断ELISA方法可以用于IBRV疫苗免疫监测和血清流行病学调查,为我国IBR的防控提供技术支持。     

Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of antibodies to bovine viral diarrhea virus in bovine sera

A specific and sensitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was established for the detection of antibodies to bovine viral diarrhea virus (BVDV) in bovine sera. Polyethylene-glycol concentrated, equilibrium density gradient purified BVDV was used as test antigen at an optimal amount of 1 microgram/well, whereas the optimal concentration of conjugate was at 1/2000 dilution. The standardized test encountered no non-specific reaction with test sera at a starting dilution of 1/10. A total of 50 bovine serum samples was assayed for the presence of antibodies against BVDV by ELISA and serum neutralization test (SNT). A positive correlation between the 2 tests was found. However, ELISA could be as much as 500-fold more sensitive than SNT in detecting low levels of BVDV antibodies.     

西尼罗河病毒病竞争ELISA检测方法的初步建立及应用

本研究用表达的西尼罗河病毒(WNV)囊膜蛋白E结构域III蛋白作为包被抗原,单抗8F4A4作为竞争检测抗体,初步建立了能够对乙型脑炎病毒(JEV)和WNV进行鉴别诊断的竞争ELISA方法。优化的最佳抗原包被浓度为530ng/mL,单抗的最佳稀释倍数为1:8000,待检血清的最佳稀释倍数为1:10。通过对56份阴性样品进行检测确定了该方法的临界值为30%,以此为判定标准对临床220份血清进行检测,结果均为阴性。此方法的建立弥补了商品化试剂盒不能区分JEV和WNV感染的缺陷,为我国西尼罗河病毒病的流行病学调查提供了一种有效的抗体检测方法。     

犬弓形虫抗体间接ELISA检测方法的建立

试验以利用重组弓形虫SAG1基因转染蜥蜴利什曼原虫所表达获得的目的蛋白作为包被抗原,建立了一种快速、特异、可检测犬弓形虫抗体的间接ELISA方法。确定了抗原最佳包被浓度为6.75 μg/mL,血清最佳稀释度为1∶100,对已知阳性血清检测的下限可达1∶6400,批间和批内重复性试验的变异系数均小于10%,包被抗原的酶标板在4、-20 ℃环境中可保存8个月以上。建立的间接ELISA方法应用于犬弓形虫抗体的检测具有较好的敏感性及特异性。     

Establishment and Preliminary Application of Indirect ELISA Based on Recombinant NS4 Protein for Detection of Bluetongue Virus Antibodies

This study was conducted to establish an indirect ELISA method for the detection serological antibody of bluetongue virus (BTV). The purified BTV recombinant NS4 protein obtained from the prokaryotic express system was used as the coated antigen, and then an indirect ELISA antibody detection method of BTV was developed by optimizing the reaction conditions. SDS-PAGE results showed that the recombinant NS4 protein with a size of about 52 kDa was obtained, which mainly existed in the supernatant. Western blot results showed that the purified recombinant NS4 protein had good antigenicity. The ELISA reaction conditions were optimized by the square matrix test. The optimal coating amount of recombinant NS4 protein antigen was determined to be 3.0 μg per well, and the optimal dilution ratio of serum to be tested was 1:200, and the optimal dilution concentration of HRP-labeled rabbit anti-cow IgG secondary antibody was 1:4 000, and the critical values were 0.29 and 0.35, respectively. The detection sensitivity of the BTV antibody was up to 1:1 600. The intra-assay repeatability and the inter-assay repeatability coefficient of variation were less than 10%. The positive coincidence ratio and negative coincidence ratio were 98% and 100% respectively. The indirect ELISA method established in this study laid a foundation for clinical serum antibody detection and serum epidemiological investigation of BTV.