桃潜隐花叶类病毒中国分离株P3的克隆与序列分析

 本研究以提取的类病毒cRNA为模板,采用RT-PCR方法,从5株表现明显花叶症状的"雨花露"桃树上检测到桃潜隐花叶类病毒(PLMVd),并对其中的样品P₃通过2次RT-PCR扩增,然后分别将扩增产物回收、克隆测序,确定了该分离株(命名为PLMVd-P₃分离株)的全长核苷酸序列,其cDNA分子全长为337 nt,这与已经报道的PLMVd典型分离株基因组大小相似。序列比较分析结果表明,该分离株与已经报道的不同地区来源的其它分离株相似性为90%~96%。     

啤酒花潜隐类病毒的实时荧光RT-PCR检测

 近年来,四川省冕宁县大力发展樱桃产业,全县樱桃种植面积1 500 hm2,年产量已达到1 3000 t,是凉山有名的樱桃之乡。2009年开始,在部分樱桃园发现花变绿症状果树,随后发病面积逐年扩大,2011年发病面积已达总栽培面积的3%,发病果园病株率可达10%~40%,对冕宁县樱桃产业造〖HJ*2/3〗成潜在威胁。本研究针对植原体进化过程中的保守基因（16S rRNA和核糖体蛋白rp基因）,采用分子生物学方法对冕宁县采集到的表现花变绿症状的樱桃植株进行检测鉴定,以明确病原及株系的分类地位,为该病害的防治提供参考。     

侵染肥城桃的病毒和类病毒的分子检测与鉴定

为明确山东肥城桃种植区桃树上主要存在的病毒和类病毒及其发生情况,采集具有花叶、斑驳和皱缩典型症状的肥城桃样品,提取叶片总RNA后,分别选用桃树上已报道的啤酒花矮化类病毒Hopstuntviroid(HSVd)、桃潜隐花叶类病毒Peach latent mosaic viroid(PLMVd)、苹果褪绿叶斑病毒Apple chlorotic leaf spot virus(ACLSV)、樱桃锉叶病毒Cherry rasp leaf virus(CRLV)、桃花叶病毒Peach mosaic virus(PMV)、李属坏死环斑病毒Prunus necrotic ringspot virus(PNRSV)、李痘病毒Plum pox virus(PPV)、李矮缩病毒Prunus dwarf virus(PDV)、樱桃绿环斑驳病毒Cherry green ring mottle virus(CGRMV)、杏假褪绿叶斑病毒Apricot pseudo-chlorotic leaf spot virus(APCLSV)、李树皮坏死茎纹孔伴随病毒Plum bark necrosis stem pitting-associated virus(PBNSPaV)和小樱桃病毒1号Little cherry virus 1(LchV1)的特异性引物进行RT-PCR检测。PCR结果显示仅HSVd、PLMVd、ACLSV、PNRSV和PBNSPaV的扩增产物中得到了预期大小的目的片段,将目的片段克隆测序后,经NCBI BLAST比对发现,山东肥城桃分离物HSVd、PLMVd、ACLSV、PNRSV和PBNSPaV与GenBank已报道分离物序列一致性均达90%以上。表明山东肥城桃已感染HSVd、PLMVd 2种类病毒和ACLSV、PNRSV、PBNSPaV 3种病毒。     

应用RT-PCR分子检测技术快速检测大蒜普通潜隐病毒

根据大蒜普通潜隐病毒(Garlic common latent virus,GCLV)的外壳蛋白区域的保守序列设计合成一对寡核苷酸引物,以带毒植物的总RNA为模板,进行反转录和PCR扩增,通过反应体系和反应程序的建立与优化,扩增得到长300 bp的目的片段,并将目的片段转入大肠杆菌进行了克隆和序列测定。测序结果与GenBank中其他GCLV相应区域的序列同源性最高达98%。并对其检测的特异性和灵敏度进行了验证,从而建立了快速、灵敏、特异性强的GCLV分子生物学检测方法。     

啤酒花潜隐类病毒RNA提取方法及检测技术的研究

本研究采用纳米磁珠提取法(Magnetic Nanoparticles,MNP)、改良的Li Cl沉淀法、CTAB法、TRIzol法和RNeasy Plant M ini Kit 5种方法提取感染啤酒花潜隐类病毒(Hop latent viroid,HLVd)的啤酒花叶片总RNA,结果显示Li Cl沉淀法、CTAB法和M NP法提取的RNA的质量较好,而M NP法具有提取时间短、操作简便,环境友好和批量提取的优势,适用于啤酒花潜隐类病毒RNA的快速提取。体外转录制备HLVd RNA标准品,利用实时荧光定量RT-PCR绘制标准曲线,并对其特异性、灵敏度进行评估。应用纳米磁珠提取啤酒花总RNA,结合实时荧光RT-PCR技术,建立了HLVd的快速、高效的M NP-RT-q PCR定量检测方法。     

啤酒花矮化类病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速、灵敏、特异的定量检测啤酒花矮化类病毒(Hop stunt viroid,HSVd)的实时荧光定量RT-PCR (RT-qPCR)方法,设计了2对引物及特异探针,体外转录制备了RNA标准品,绘制标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行评估.建立的定量标准曲线Ct值与模板拷贝数对数之间呈良好的线性关系,相关系数R2为0.9988,扩增效率为95％;该方法的特异性好,与啤酒花潜隐类病毒(HLVd)、葡萄黄斑类病毒1(GYSVd-1)、葡萄黄斑类病毒2(GYSVd-2)和桃潜隐花叶类病毒(PLMVd)均无交叉反应;灵敏度为1.0×102拷贝/μL,比普通RT-PCR高10倍;试验内及试验间重复性试验的变异系数均小于3％.研究表明该方法适用于实际样品中HSVd的快速定量检测.     

纳米磁珠结合实时荧光RT-PCR技术检测大丽花潜隐类病毒

正大丽花潜隐类病毒(Dahlia latent viroid,DLVd)是Verhoeven et al.(2013)用Return-PAGE和s-PAGE技术从大丽花中鉴定出的一种新类病毒。根据2015年国际病毒分类委员会分类报告,DLVd为马铃薯纺锤形块茎类病毒科啤酒花矮化类病毒属成员。该病毒单独侵染时,大丽花没有明显的症状,其与马铃薯纺锤块茎类病毒(Potato spindle tuber viroid,PSTVd)复合侵染时可使大丽花叶片卷曲(Tsu-     

我国北方部分苹果主产区病毒病的发生与检测

苹果病毒病在我国广泛发生,已成为限制我国苹果优质高产的关键因素。20世纪80年代曾对其做过详细的调查和研究,但近年来由于各地农业产业结构调整等因素,苹果病毒病的发生特点有了不同程度的变化。为了解目前我国苹果病毒病的发生情况,在我国北方苹果主产区山东、陕西、山西、辽宁、北京和黑龙江6个省市的部分地区采集苹果样品共计267份,经RT-PCR检测和扩增产物的克隆与测序分析表明在上述地区采集的样品中,苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果茎痘病毒(ASPV)、苹果锈果类病毒(ASSVd)的发生率分别为66.7%~100.0%、38.1%~94.1%、4.8%~85.7%和4.8%~48.6%;苹果凹果类病毒(ADFVd)仅在山东的两个果园零星发生;6个省市样品中病毒复合侵染率分别为67.1%、92.1%、75.0%、88.2%、94.1%和76.2%。     

同时检测樱桃绿环斑驳病毒和桃潜隐花叶类病毒的二聚cRNA探针制备和应用

<正>樱桃绿环斑驳病毒(Cherry green ring mottle virus,CGRMV)和桃潜隐花叶类病毒(Peach latent mosaic viroid,PLMVd)是桃树上的主要病原。在检测中发现,我国桃树病毒多以CGRMV与PLMVd复合侵染为主,侵染率较高。通过分子克隆,串联几个病毒核酸序列合成多聚探针,能同时检测多个病毒和类病毒(Torchetti et al.,2012)。目前尚无关于CGRMV单一探针和同时检测CGRMV与PLMVd二聚探针的报道。本研究通过设计带酶切位点的特异引物制备二聚cRNA探针,以期建立适用于田间果树样品中CGRMV和PLMVd的快速检测技术,为桃树病毒病害的防治提供理论基础。     

建兰花叶病毒厦门分离物的提纯及RT-PCR检测

以蔓陀罗为建兰花叶病毒(CyMV)厦门分离物的繁殖寄主,通过一次差速离心、一次PEG沉淀结合超速离心提纯建兰花叶病毒,病毒得率约400 mg/kg。根据已经报道的建兰花叶病毒外壳蛋白基因序列设计引物,分别以该病毒RNA及病叶总RNA为模板,建立了建兰花叶病毒RT-PCR快速检测体系,其检测灵敏度可达1.8 pg病毒和11 mg/mL的病叶组织。     

微滴数字RT-PCR检测南芥菜花叶病毒

为建立一种快速、灵敏、特异的定量检测南芥菜花叶病毒(arabis mosaic virus,ARMY)的微滴数字RT-PCR方法,根据ArMV外壳蛋白基因保守序列设计了特异性引物和探针,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行评估.结果 表明,该数字RT-PCR检测方法的特异性好,与其他对照病毒均无交叉反应;检测灵敏度可...     

多重RT-PCR同时检测6种马铃薯病毒及1种类病毒

病毒病是限制我国马铃薯生产的重要因子之一。本研究通过引物设计和体系优化建立了一套多重RT-PCR检测方法,可以在一个反应体系中同时检测6种马铃薯病毒和1种马铃薯类病毒以及1个马铃薯内参基因,包括马铃薯Y病毒(potato virus Y, PVY)、马铃薯M病毒(potato virus M, PVM)、马铃薯S病毒(potato virus S, PVS)、马铃薯X病毒(potato virus X, PVX)、马铃薯A病毒(potato virus A, PVA)、马铃薯卷叶病毒(potato leaf curl virus, PLRV)、马铃薯纺锤块茎类病毒(potato spindle tuber viroid, PSTVd)和细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome c oxidase subunitⅠ,CoxⅠ)基因的特异片段,产物大小依次为181、226、275、565、630、681、359、500 bp,符合理论预期。采用建立的方法以相应病毒和类病毒的质粒作模板进行检测,其检测灵敏度在1.6×10^-3～1.8×10^-1 ...     

中国锦紫苏类病毒的检测及其分子生物学特征研究

 从无明显症状表现的11株锦紫苏叶片中抽提低分子量的RNA,经Return-PAGE、RT-PCR和Dot-blot hybridization检测,结果表明11株锦紫苏全部带有锦紫苏类病毒(Coleus blumei viroid,CBVd)。将部分PCR产物克隆到pGEM-3Zf(+)载体上并进行DNA序列测定。序列分析结果,所克隆的序列(GenBank登录号分别为DQ178395、DQ178396、DQ178397、DQ178398和DQ178399)与GenBank中报道的锦紫苏类病毒1号(CBVd-1)序列同源性为85.23%~99.20%。从市场上购买的锦紫苏种子经Return-PAGE和RT-PCR检测不携带锦紫苏类病毒。这是中国发生的锦紫苏类病毒的首次报道。     

甘蔗花叶病毒第IV组分离物RT-PCR检测体系的建立及应用

 甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)是引起我国玉米矮化叶病的主要病毒。根据其基因组序列,SCMV可以分为4个组,其中第IV组分离物属于新出现的强毒株系。为了快速检测SCMV尤其是IV组分离物的发生情况,我们针对SCMV I-IV组及IV组分离物设计了6对引物,从中筛选出特异性最强的2对引物(I-IV-2F/I-IV-2R和IV-1F/IV-1R),进行PCR体系的优化。优化后的PCR体系为:退火温度51℃,dNTP终浓度为0.1 mM,引物终浓度为0.20 μM,TaqDNA聚合酶终浓度为0.015 U·μL^-1。利用该体系, 引物对I-IV-2F/I-IV-2R和IV-1F/IV-1R均能够从50 ng感病叶片或0.05 ng病毒RNA中检测出SCMV。通过优化两对引物浓度比例建立了能同时检测SCMV所有分离物及第四组分离物的双重PCR体系。利用该体系从山东、河南及云南均检测出SCMV第IV组分离物的发生。本研究为SCMV尤其是SCMV第IV组分离物的快速检测提供了技术支持。     

利用RT-PCR方法检测甜瓜种子中南瓜花叶病毒

通过设计特异性引物SQCPF/SQCPR,扩增南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus,SqMV)CP基因的保守序列,进行RT-PCR,对扩增得到的特异性片段进行序列测定,测序结果显示扩增产物序列与GenBank中登录的SqMV外壳蛋白基因存在87%～96%的一致性;建立了适用于检测甜瓜种子中南瓜花叶病毒的RT-PCR结合ELISA方法,通过在酶联板的反应孔中直接进行反转录合成cDNA,能扩增到预期大小的DNA条带,且检测灵敏度高于DAS-ELISA方法10倍以上。用建立的RT-PCR结合ELISA方法检测进境甜瓜种子携带的SqMV,在42份样品中检出4份阳性样品。