抗犬细小病毒单链抗体库构建及其亲和力检测

为获得高亲和力抗犬细小病毒单链抗体,构建抗犬细小病毒(CPV)细菌展示单链抗体文库。研究提取犬脾脏总RNA,反转录c DNA,以此为模板,分别扩增犬抗体VH和VL编码序列,插入克隆载体p Tlinker。利用SfiⅠ酶切位点将sc Fv基因构建至细菌展示载体p BSD中,将重组质粒电转化入E.coli DH5α构建p BFD-sc Fv细菌展示库。通过标记FITC的VP2蛋白,利用流式细胞术筛选12株阳性sc Fv。将12株sc Fv基因分别插入p ET-28a,构建重组表达质粒p ET28a-sc Fv。转化到E.coli Rosetta中诱导表达,获得约28 ku目的蛋白。经ELISA检测,纯化sc Fv对VP2蛋白P/N值均大于2.1,其中sc Fv-23、sc Fv-33、sc Fv-34对VP2蛋白亲和力较强。研究通过免疫本动物源动物,在获得高价抗体同时,避免传统单克隆抗体的免疫排斥现象;结合流式细胞术和细菌展示技术可对单链抗体文库高效、快速筛选。抗犬细小病毒同源单链抗体研究在填补市场同源基因工程抗体空白的同时,可为研制具有中和活性全长抗体奠定基础。     

抗利巴韦林单链抗体基因构建及其结构分析

【目的】克隆构建利巴韦林(RBV)单链抗体(scFv)基因,对其理化特性进行分析并对蛋白质结构进行模拟,为后期检测方法的建立及分子改造提供参考依据。【方法】以分泌利巴韦林抗体的杂交瘤细胞株总RNA为模板,通过RT-PCR技术扩增抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),然后以柔性连接短肽(Gly_4Ser)_3为接头拼接完整的scFv-RBV。利用生物信息学方法对scFv-RBV的理化性质及蛋白结构功能进行预测分析。【结果】构建的scFv基因编码240个氨基酸,相对分子质量为26 162.27 Da,理论等电点(pI)为8.57。在二级结构中,β-折叠(39.17%)和无规卷曲(45.41%)占主导地位,α-螺旋(5.42%)和β-转角(10%)相对较少。在三级结构中,VH和VL区域被Linker相互牵拉靠近,形成典型的口袋样形状的空间构象,符合单链抗体的结构特征,理论上可以与RBV抗原特异性结合。【结论】成功构建scFv-RBV基因,并利用生物信息学方法预测分析scFv的二级、三级结构,该结果可为后期进行单链抗体的表达、纯化及定向进化提供理论支撑。     

特异性抗IBDV单链抗体基因的构建及序列分析

从抗 IBDV杂交瘤细胞系 SJS中分离总 RNA,经 RT-PCR体外扩增重、轻链可变区基因 ,通过一连接肽 (Giy4 Ser) 3基因拚接形成 Sc Fv基因 ,经 IBDV抗原亲和筛选出特异性阳性克隆进行核苷酸序列测定及氨基酸序列推导。所获得的特异性抗 IBDV单链抗体基因为 VH-Linker-VL 结构 ,其含有编码 (Giy4 Ser) 3的连接肽基因及维持抗体结构所必须的半胱氨酸残基 ,编码产物具有与亲本抗体相同的抗原结合活性和特异性 ,从而为研制具有应用潜力的高表达工程化抗体奠定了基础。     

抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的制备及单链抗体基因的构建

 【目的】制备抗PthA-NLS多肽单克隆抗体并构建其单链抗体（single chain variable fragment,ScFv）基因,为从PthA角度进一步研究柑橘溃疡病致病机理创造条件,并为构建单链抗体基因植物表达载体,尝试利用转基因和植物抗体技术创制抗溃疡病柑橘新种质奠定基础。【方法】利用PthA-NLS重组多肽免疫Balb/c小鼠,制备抗PthA-NLS多肽单克隆抗体,从分泌抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA,采用RT-PCR和重叠延伸PCR（splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR）法构建其单链抗体基因,并克隆到pGEM-T载体和原核表达载体pET32a(+)中,重组原核表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导重组蛋白的表达。【结果】获得了3株能稳定分泌抗PthA-NLS多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞株1C8H1、2D12B6、3D8A10。成功构建了单链抗体基因ScFv,获得的ScFv基因大小约750 bp,其中重链可变区（VH）基因有360 bp,轻链可变区（VL）基因有342 bp,中间连接肽基因45 bp,经过IPTG诱导ScFv原核表达,获得了大小为44.5 kD的ScFv重组蛋白。【结论】试验获得了3株能稳定分泌抗PthA-NLS多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞株,成功构建了ScFv基因,并实现了原核表达,为进一步探索PthA的致病机理和下一步利用抗体技术获得抗溃疡病柑橘种质的研究打下了基础。     

抗黄曲霉毒素B1单链抗体基因克隆及其结构分析

[目的]克隆构建黄曲霉毒素B1(AFB1)单链抗体(scFv)基因,并对其编码蛋白序列和结构进行分析预测,为scFv分子修饰改造及在免疫学检测中的应用提供参考依据.[方法]以抗AFB1单克隆抗体杂交瘤细胞株为原料,通过PCR扩增重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),以(Gly4Ser)3为柔性接头(Linker)拼接构建抗AFB1 scFv基因,并采用在线生物信息学分析软件对其氨基酸序列、理化性质及蛋白结构进行分析预测.[结果]抗AFB1 scFv基因全长744 bp,编码248个氨基酸,分子量为26312.05 Da,理论等电点(pI)5.70,其二级结构中含有35个α-螺旋(占14.11%)、28个β-折叠(占11.29%)、85个延伸链(占34.28%)和100个随机卷曲(占40.32%),在三级结构中连接肽卷曲将VH和VL区域牵拉而相互靠近,形成典型的抗体结构——沟槽结构,是scFv的抗原结合区域.[结论]构建的抗AFB1 scFv其VH含有117个氨基酸、VL含有116个氨基酸,具备典型抗体结构——沟槽结构,能与抗原特异性结合.     

抗 ICOSL 核糖体展示单链抗体库的构建

[目的]构建出鼠源抗ICOSL核糖体展示抗体库。[方法]通过RT—PCR从人B淋巴瘤细胞Daudi的总RNA中扩增出ICOSL胞外区基因,并将此基因插入到原核表达载体pET28a中进行表达。以表达纯化的ICOSL蛋白为抗原免疫Balb／c小鼠,取小鼠脾脏提取总RNA,通过RT—PCR扩增小鼠的重链可变区和Linker（VH—linker）序列,以及轻链可变区和Linker（VK—linker）序列。经重组PCR将两段基因连接起来,将VH／K与pMD19一T载体链接产物转化E．coliDH50L,PCR鉴定并测序。[结果]VH和κ链得到正确的扩增,长度分别为421和689bp,V14／κ连接产物正确,连接产物长度为1079bp。[结论]所采用的引物及反应条件能够扩增出目的基因,成功构建了鼠源抗ICOSL核糖体展示抗体库,为进行核糖体展示体外筛选抗IcosL特异性单链抗体奠定基础。     

抗磺胺二甲嘧啶单链抗体基因的克隆与序列分析

采用RT-PCR方法成功克隆出抗磺胺二甲嘧啶（SM2）单抗的杂交瘤细胞中396 bp的VH和339 bp的VL可变区基因,再通过重叠延伸PCR方法,由引入的（Gly4Ser）3柔性肽体外组装抗717bp的SM2-ScFv基因。测序经NCBI Blast比较分析和Expasy预测分析。结果表明：所得ScFv具有重组功能性鼠抗体可变区基因的特征,单链抗体的结构符合抗体可变区的功能区的框架区和可变区的结构特点,是抗磺胺二甲嘧啶的可变区基因,且经lingker连接后为影响轻重链的结构。     

抗恩诺沙星噬菌体单链抗体库的构建及鉴定

本研究以兽药恩诺沙星为对象,构建噬菌体抗体库,为低成本、快速制备目的抗体提供新的途径。以恩诺沙星-鸡卵清蛋白(ENR-OVA)为免疫原对Balb/c小鼠进行免疫,取其脾细胞提取总RNA,并分别扩增全套抗体轻、重链基因,通过重叠延伸PCR技术,以编码柔性多肽(Gly3Ser)4的基因为接头,将轻重链基因组装为完整的scFv基因,将之克隆入pCANTAB5E载体,转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体M13KO7对其进行超感染,构建噬菌体抗体库并进行富集、筛选和鉴定;构建了库容量约为2.2×106的抗恩诺沙星噬菌体单链抗体库,并筛选出26株阳性克隆,为表达单链抗体、建立免疫检测方法奠定基础。     

抗O型口蹄疫病毒猪源单链抗体的筛选

为获得抗O型口蹄疫病毒(FMDV)高亲和力猪源单链抗体(scFv),建立抗原抗体(Ag-Ab)共表达细菌展示文库,抗原为FMDV结构蛋白VP1、抗体为高免猪抗体文库。采用细菌展示与流式细胞术结合方法,筛选出14株抗FMDV的scFv。将筛选获得scFv构建至pET28a载体中,经E. coli Rosetta表达,目的蛋白长度约为30ku,与scFv分子质量相符。Western blot结果表明,14株scFv均可与VP1特异性结合。ELISA结果表明,14株scFv均可与灭活O型FMDV特异性结合。应用共表达细菌展示技术,可避免抗原制备,简化操作流程,适用范围广泛;应用流式细胞仪筛选抗体库,可实现准确、快速、高通量筛选。抗FMDV猪源scFv研究可填补同源基因工程抗体空白,为进一步筛选中和抗体奠定基础。     

抗C反应蛋白单域抗体噬菌体库的构建与初步鉴定

以CRP为免疫原免疫双峰驼后分离外周血淋巴细胞,提取总RNA后经逆转录制备cDNA,通过巢式PCR实验获得目的基因片段并克隆至噬菌体T7载体臂上,构建原始噬菌体库。随后进行4轮生物淘选,通过Phage-ELISA鉴定淘选后的噬菌体库,BamHⅠ、HindⅢ双酶切构建了pET-28a与阳性克隆的重组质粒,转化入BL21菌株中进行低温诱导表达。经过His-镍离子亲和层析柱纯化获得单域抗体,然后再用间接ELISA鉴定单域抗体与CRP的反应性。研究结果显示,试验成功构建了库容为1.08×10~8 cfu的抗CRP单域抗体噬菌体库,基因插入率为96.43%(27/28)。生物淘选获得了4株与CRP特异性结合的阳性克隆,4株阳性克隆表达载体构建成功,并在BL21细胞中成功表达单域抗体,分子质量约为22 ku。经ELISA鉴定,4个抗体均显示出高亲和力与特异性,其中V2与V3的抗体效价高达1∶3 200,证明该抗体能够适用于实际检测方法开发。     

白桦伸展素蛋白结构分析及同源建模

以白桦伸展素蛋白序列为研究材料,利用生物信息学方法分析该蛋白的氨基酸组成、等电点、疏水/亲水性、跨膜区、二级结构和三级结构等性质,并将其同黑杨、棉花、大豆的伸展素蛋白进行比对和同源分析。结果表明,该蛋白的分子式为C680H1099N195O195S11,为亲水性、不稳定的非跨膜蛋白,主要构件为α-螺旋和无规则卷曲,与黑杨有较高的同源性。     

口蹄疫病毒3D基因的克隆及其编码蛋白的结构和功能预测

采用RT-PCR技术,对AsiaⅠ型口蹄疫病毒的3D基因进行克隆,并对其序列进行比对,同时利用Ex-pasy等生物软件对3D蛋白的二级、三级结构及生物学特性进行预测和分析.结果表明:3D蛋白在口蹄疫各血清型间高度保守,分子中含有一个糖基化位点及多个酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸位点,并存在一个单股正链RNA病毒依赖RNA多聚酶的催化区;结构特点显示3D蛋白为口蹄疫病毒复制所需的多聚酶.     

蝉拟青霉类枯草杆菌蛋白酶基因的克隆及其序列和蛋白质分析

蝉拟青霉是一种常见的昆虫病原真菌,被广泛应用于生物防治。本研究根据GenBank中已登录的淡紫拟青霉、粉拟青霉、球孢白僵菌和金龟子绿僵菌的类枯草杆菌蛋白酶基因序列的同源性比较,以它们高度保守的核苷酸序列设计一对引物,采用RT-PCR和3'/5'-RACE相结合的方法,从蝉拟青霉中克隆出完整的类枯草杆菌蛋白酶(subtilisin-like protease)cDNA基因序列。cDNA全序列为2 031 bp,该序列5'-端和3'-端的非编码序列长度分别为170 bp和262 bp,开放阅读框为1 599 bp,编码532个氨基酸,信号肽长度为18个氨基酸,前肽长度为133个氨基酸。该基因编码的蛋白序列与虫草棒束孢(Isaria farinosa)、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、蛹虫草(Cordyceps militaris)和哈茨木霉(Trichoderma harzianum)类枯草杆菌蛋白酶有较高的同源性,同源性分别为88%、88%、89%和71%。成熟蛋白具有典型的丝氨酸蛋白酶活性位点,同时有5个半胱氨酸,4个潜在的N-糖基化位点,位于细胞的液泡中与分泌途径相关,二级结构中以α-螺旋和无规则卷曲为主。     

高价铁肠杆菌素受体蛋白FepA表面抗原决定簇基因的克隆及序列同源性分析

用PCR技术获取高价铁肠杆菌素受体蛋白FepA表面抗原决定簇基因,分析其在大肠杆菌种内的序列同源性。以提取的大肠杆菌基因组DNA为模板,设计一对基因特异引物,用PCR扩增的方法获得目的基因。将PCR扩增后得到的片段纯化并克隆至pMD19-T Simple Vector载体,用菌落PCR及酶切鉴定阳性菌落,对阳性菌落进行测序,并与Gene Bank公布的大肠杆菌区段进行序列同源性分析。扩增出598bp的含有受体蛋白FepA表面抗原决定簇基因的目的片段,经测序分析其种内的序列同源性为95%～99%,为今后制备针对该区段的抗体奠定了基础。     

禽呼肠孤病毒血清学相关性及S3基因序列同源性分析

采用血清学交叉中和试验方法,分析了4株禽呼肠孤病毒株CL(鸡源禽呼肠孤病毒)、YH和YB(鸭源禽呼肠孤病毒)及S1133(禽呼肠孤病毒标准株)之间抗原的相互关系;并对CL株的S3基因进行克隆测序,用DNAsis和Prosis等分析软件进行序列比较及推导氨基酸序列分析.结果表明:4株禽呼肠孤病毒株之间具有共同的群特异抗原,但不同病毒株间存在中和抗原位点的不对称性;血清学相关性与S3基因序列及其推导的σB蛋白氨基酸序列同源性不一致,表明禽呼肠孤病毒诱导机体产生特异性中和抗体的病毒蛋白不止σB蛋白一个,σB氨基酸序列同源性与血清学相关性没有必然的直接联系.     

基于Smart3D无人机倾斜摄影三维建模方法研究

[目的]无人机倾斜摄影三维建模具有低成本、高效率和精度高等优点,成为实景三维建模的主流方法,进一步提高大范围实景三维建模效率和精细度,可为实景三维中国建设提供数据支撑和技术支持.[方法]文章以山东省泰安市岱岳经济开发区为研究区,借助哈瓦无人机获取倾斜摄影测量数据,通过Smart3D软件构建实景三维模型,并提出了针对研究...     

3D volumetric modeling of grapevine biomass using Tripod LiDAR

Tripod mounted laser scanning provides the means to generate high-resolution volumetric measures of vegetation structure and perennial woody tissue for the calculation of standing biomass in agronomic and natural ecosystems. Other than costly destructive harvest methods, no technique exists to rapidly and accurately measure above-ground perennial tissue for woody plants such as Vitis vinifera (common grape vine). Data collected from grapevine trunks and cordons were used to study the accuracy of wood volume derived from laser scanning as compared with volume derived from analog measurements. A set of 10 laser scan datasets were collected for each of 36 vines from which volume was calculated using combinations of two, three, four, six and 10 scans. Likewise, analog volume measurements were made by submerging the vine trunks and cordons in water and capturing the displaced water. A regression analysis examined the relationship between digital and non-digital techniques among the 36 vines and found that the standard error drops rapidly as additional scans are added to the volume calculation process and stabilizes at the four-view geometry with an average Pearson's product moment correlation coefficient of 0.93. Estimates of digital volumes are systematically greater than those of analog volumes and can be explained by the manner in which each technique interacts with the vine tissue. This laser scanning technique yields a highly linear relationship between vine volume and tissue mass revealing a new, rapid and non-destructive method to remotely measure standing biomass. This application shows promise for use in other ecosystems such as orchards and forests.