猫疱疹病毒Ⅰ型、猫杯状病毒、支气管败血波氏杆菌多重荧光定量PCR检测方法的建立与应用

旨在建立检测猫疱疹病毒Ⅰ型(Feline herpesvirus 1,FHV-1)、猫杯状病毒(Feline calicivirus, FCV)、支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)多重TaqMan荧光定量PCR方法。基于FHV-1的胸苷激酶(TK)基因、FCV的衣壳蛋白VP1基因、Bb的皮肤坏死毒素基因(DNT1)序列保守区域设计并合成TaqMan荧光定量PCR引物和探针,以FHV-1、FCV、Bb、猫细小病毒、沙门菌、金黄色葡萄球菌为模板验证引物和探针的特异性。制备重组质粒pMD18T-FHV-TK、pMD18T-FCV-VP1、pMD18T-Bb-DNT1作为标准品,经矩阵法确定最佳反应体系。以10倍梯度稀释的标准品为模板检测方法的灵敏性。应用建立的方法对32份临床具有上呼吸道感染症状的猫眼、口、鼻拭子检测,以评估该方法的可行性。结果显示：该方法可特异性检出FHV-1、FCV、Bb,且与猫细小病毒、沙门菌、金黄色葡萄球菌无交叉反应;灵敏度试验表明该方法对FHV-1、FCV、Bb的最低检出限分别为10、10和100拷贝/μL;应用该方法从3...     

一例猫泛白细胞减少症病毒和猫疱疹病毒1型混合感染的诊治

1只2月龄雄性金吉拉(流浪猫)因出现呕吐、血痢、眼结膜炎及呼吸系统疾病而就诊,采取血常规,猫泛白细胞减少症病毒(FPV)抗原快速诊断试纸,猫疱疹病毒1型(FHV-1)、猫杯状病毒(FCV)、支原体(Myc)和衣原体(Chl)抗原荧光定量PCR,猫血清淀粉样蛋白-A(fSAA)及眼鼻分泌物的染色镜检等一系列检查进行诊断,并根据诊断结果进行治疗。结果表明：患猫确诊为FPV、FHV-1及眼鼻细菌的混合感染。通过抗病毒、抗菌、营养支持、定期监测相关指标变化连续追踪治疗6 d后,该病例FPV和FHV-1抗原均转为阴性,身体各项指标基本回归至正常水平,出院后第15天电话回访,患猫已痊愈。说明针对本病例采取的诊治方案有效可行。     

上海市宠物猫杯状病毒、疱疹病毒及流感病毒的分离与鉴定

为了解上海市猫上呼吸道疾病病例中猫杯状病毒(FCV)、猫疱疹病毒1型(FHV-1)和猫流感病毒(FIV)的感染比例及其遗传变化特点,对上海市冬季53份表现上呼吸道症状宠物猫的眼结膜、口咽和鼻黏膜拭子,进行FCV、FHV-1和FIV分离与鉴定,并对分离的病毒进行遗传进化分析.结果显示:53份样品中,FCV分离率为58.4...     

一株猫疱疹病毒Ⅰ型的分离与鉴定

采集哈尔滨某猫舍中表现为上呼吸道感染的患病猫眼、鼻拭子，PCR初步确诊为猫杯状病毒(FCV)和猫疱疹病毒(FHV-1)混合感染。利用猫肾细胞(CRFK)对样本进行病毒分离，前两代细胞培养物的核酸检测结果为FHV-1和FCV阳性，第三代开始只有FCV阳性，由此分离出FCV。制备此株FCV的鼠源多克隆抗体，并中和混合培养物中的FCV,从而分离出FHV-1,命名为HRB2019株。通过病毒粒子形态观察、间接免疫荧光试验(IFA)和基因序列分析等方法鉴定HRB2019株，并研究其体外生长动力学。结果显示，HRB2019株可在CRFK细胞上产生典型病变，测得其第四代病毒滴度为1×10^8.43TCID₅₀·mL^-1;电镜下可观察到球形、有囊膜、直径约为200 nm的病毒粒子；IFA结果显示，分离株可与FHV-1阳性血清结合，出现特异性荧光；扩增分离株的gD基因，其与国内外流行株高度同源。病毒一步生长曲线表明，HRB2019株感染细胞12 h后开始复制增殖，12～36 h为快速增殖期，48～72 h进入增殖平台期且滴度达到高峰，84 ...     

猫疱疹病毒Ⅰ型PCR检测方法的建立与初步应用

建立猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)PCR检测方法,应用于临床样品中FHV-1的快速检测。根据猫疱疹病毒Ⅰ型的gI基因序列设计了一对特异性引物,以疑似猫疱疹病毒Ⅰ型感染猫的眼鼻分泌物总DNA为模板,建立了PCR检测方法,对所建立的方法进行特异性、敏感性和重复性验证,并对26份临床样本进行检测。结果表明,所建立的PCR诊断方法与犬细小病毒(CPV)、犬瘟热病毒(CDV)、绵羊肺炎支原体(M.ovis)、牛支原体(M.bovis)、牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)均无交叉性反应,最低检测DNA模板浓度为3.23×10~3 copies/μL。对26份临床病例进行检测,阳性率61.54%。说明建立的FHV-1PCR检测方法具有特异性强、敏感度高、方便快捷等优点,适合于临床FHV-1感染的快速检测。     

上海市门诊宠物猫和动物园流浪猫的猫疱疹病毒1型中和抗体检测

为了解临床中猫疱疹病毒1型（FHV-1）疫苗的免疫效果和流浪猫的FHV-1感染状况,利用临床分离株建立了FHV-1中和抗体检测方法,并对20份宠物门诊FHV-1免疫猫血清和10份未免疫的动物园流浪猫血清进行中和抗体检测。结果显示,免疫宠物猫和未免疫流浪猫的抗体阳性率均为60%。结果表明,上海市FHV-1疫苗免疫效果不佳,未免疫流浪猫FHV-1感染较严重。结果提示,需加强猫科动物的FHV-1免疫抗体监测,及时补免,同时加强流浪猫的管理、收容、免疫和监测。本研究为防控猫科动物FHV-1感染提供了参考。     

猫传染性鼻气管炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

猫传染性鼻气管炎(FIR)病毒是引起猫传染性鼻气管炎的病原,属于猫疱疹病毒1型(FHV-1)。选择FHV-1gD基因设计1对引物FHV-1F、FHV-1R和探针FHV-1Probe,建立FHV-1实时荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法可以特异地检测出FHV-1的DNA,敏感性达到75fg/μL,反应效率达到107%,R²值为0.9965,Ct值的变异系数低于2%。FHV-1实时荧光定量PCR检测方法敏感性高于普通PCR,特异性好、稳定性好,适用于FHV-1的临床诊断、检测和流行病学调查。利用该方法对上海地区宠物门诊送检的疑似FHV-1感染的样品进行检测,其阳性率达到27.78％,表明上海地区宠物猫FHV-1的发病率处于较高水平。     

猫疱疹病毒1型RPA-Cas12a-LFD检测方法的建立及初步应用

猫疱疹病毒1型(feline herpesvirus-1，FHV-1) 为水痘病毒属的双链DNA包膜病毒，是引起猫上呼吸道感染的主要病原之一。本研究以重组聚合酶扩增(RPA)、Cas12a反式酶切反应和侧流层析试纸条(LFD)显示技术为基础，旨在建立靶向FHV-1 TK基因的RPA-Cas12a-LFD快速可视化检测方法。根据FHV-1 TK基因的保守片段序列设计RPA引物和合成crRNA的引物，并通过反应体系验证、RPA-Cas12a-LFD检测灵敏度和特异性分析，以及临床样本的符合检测，评价FHV-1 RPA-Cas12a-LFD方法的有效性。结果显示，建立的FHV-1 RPA-Cas12a-LFD方法可以特异性地检出FHV-1(与其他猫相关病原无交叉反应)，灵敏度极高(最低检测限为2.35×10^-1 copies·μL^-1)，检测时间短，结果可视化。该方法对20份表现明显症状的患猫呼吸道样本的FHV-1检出率(35%，7/20)高于现有的TB Green qPCR方法(25%，5/20)，对其中5份阳性样本的检测符合率为100%。综上表明，成功建立的FHV-1 RPA-Cas12a-LFD检测方法的特异性好和敏感性极高，不需要特殊的检测设备，可以作为FHV-1现场快速检测的有效工具。     

猫免疫缺陷病的诊断及防制

猫免疫缺陷病(feline immunodeficiency disease,FID)是由猫免疫缺陷病毒(FIV)感染引起的慢性病毒性传染病,以消瘦、严重的牙龈炎、口腔炎和神经系统紊乱以及容易继发感染为特征.由于FIV主要在CD4+辅助性T细胞内增殖并杀伤该细胞,导致其数量逐渐降低,最初又称为猫嗜T淋巴细胞病毒(feline T cell lymphotropic virus)[1].该病发病机理和临床症状与艾滋病相似,故又称猫艾滋病(feline acquired immune deficiency syndrome,FAIDS).     

猫传染性鼻-结膜炎疫苗研究进展

<正>猫杯状病毒(feline calicivirus,FCV)能引起猫的多发性口腔和呼吸道传染病,还可引起结膜炎,故又称为猫传染性鼻-结膜炎病毒。FCV是杯状病毒科疱疹病毒属(Vesivirus)的成员之一,其基因组为单股正链RNA,无囊膜,核衣壳呈二十面体对称。目前FCV感染已呈世界性分布。几乎所有的猫科动物均易感,一岁以下的猫最易感,也有感染狗的报道。FCV感染猫通常仅局限于口腔和上     

猫疱疹病毒Ⅰ型荧光定量聚合酶链式反应检测方法的建立

研究旨在建立实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测猫疱疹病毒Ⅰ型(Feline herpesvirus type Ⅰ,FHV-1)的方法,用于检测临床上猫的上呼吸道传染病样本。据Gen Bank已发表的猫疱疹病毒的gE基因序列的保守区域设计并合成一对特异性引物及探针,建立FHV-1的实时荧光定量PCR检测方法,对此方法进行特异性、灵敏度及重复性的验证,并对广东佛山某流浪猫基地猫疱疹病毒的流行情况进行调查,即对该基地的94份临床样品进行检测。结果表明：研究成功建立了FHV-1实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法,此方法特异性强,与大多流行的犬猫病毒均未出现交叉反应;敏感性高,最低检出限为10 copies·μL^-1;重复性好,批内变异系数为0.29%～0.71%,批间变异系数为0.88%～1.38%。应用此方法在94份临床样品中检出28份FHV-1核酸阳性样品。综上所述,研究建立的FHV-1荧光定量聚合酶链式反应方法具有较好的特异性、敏感性和重复性,为临床上FHV-1...     

猫获得性免疫缺陷综合征

猫获得性免疫缺陷综合征(feline acquired immunodeficiency syndrome, FAIDS)又叫猫艾滋病,是由猫免疫缺陷病毒(feline immunodeficiency virus, FIV)引起的危害猫科动物的一种慢性接触性传染病.临床上以免疫功能障碍、体质极度虚弱、消化系统、呼吸系统、泌尿系统、淋巴系统病变、恶性肿瘤,以及神经系统紊乱为特征.由于该病毒侵害免疫系统导致特异性免疫缺陷,故称为获得性免疫缺陷综合征.1987年Pedersen在美国猫中首次分离获得FIV.到目前为止,已有美国、加拿大、英国、法国、德国、瑞士、荷兰、奥地利、意大利、日本、澳大利亚、新西兰等12个国家的猫群中存在FIV感染.我国很少见到本病的报道,对FAIDS的研究工作还处于起步阶段.美国Pederson博士证实,采自广东地区猫的血清样本中存在FIV抗体,并分离到FIV.表明我国的一些猫群中已存在FIV多年,只是在近几年才对其有所认识和重视.现根据临床诊治所见和有关资料,概述如下.     

一例流浪猫免疫缺陷病毒感染的诊断

猫免疫缺陷病毒(feline immunodeficiency virus,FIV)在自然情况下感染多种猫科动物,在世界范围内广泛存在,尤其是日本、欧美等国家的家猫、流浪猫、非洲狮感染比例极高,而我国目前关于该病鲜有报道。试验对一例临床疑似FIV感染的流浪猫进行了抗原和PCR检测,结果表明:该流浪猫为FIV阳性。     

北京地区猫杯状病毒和疱疹病毒流行病学调查

为了调查猫杯状病毒(FCV)和疱疹病毒(FHV)在家养猫中的流行情况,对中国农业大学动物医院进行FCV和FHV PCR检测的412例病例进行流行病学调查,结果显示,有呼吸道症状的患猫FCV和/或FHV感染的总发生率为60.2%,其中FHV和FCV的阳性率分别是26.3%和46.3%,混合感染的发生率为11.8%。对性别、品种、年龄因素与FHV和FCV感染的相关性分析显示,家养长毛猫与FHV感染呈显著正相关(P<0.05,OR=3.25),波斯血统猫与FHV感染呈显著负相关(P<0.05,OR=0.32)。其他因素与FCV和FHV感染均无相关性(P>0.05)。症状与FCV或FHV感染的相关性统计显示,FCV感染与打喷嚏和口腔溃疡呈显著相关(P<0.05),而与眼、鼻分泌物、结膜炎和咳嗽等症状无显著相关性(P>0.05);FHV与上述所有临床症状均无显著相关性(P>0.05)。猫的FHV和FCV感染率在北京地区的发病率相对较高,临床中应提高预防意识。     

山东省青岛市猫病毒性鼻气管炎流行情况调查

为了解山东省青岛市猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)的流行情况,2019年6月至2021年6月共采集猫眼鼻拭子样本218份,提取样本DNA后利用PCR方法进行FHV-1核酸检测,共检出阳性样本22份,阳性率为10.1%(22/218)。宠物救助站猫的FHV-1阳性率(16.7%)略高于其他来源猫,2~6月龄幼猫的FHV-1阳性率(13.6%)略高于成年猫(7.0%),成年公猫阳性率(7.3%)稍高于成年母猫(6.7%),但各组间均无显著性差异(P>0.05)。对2021年3月采集的60份猫血清进行了FHV-1中和抗体检测,共检出阳性样本40份,抗体阳性率为66.7%。结果表明,青岛市猫群中存在一定的FHV-1流行,抗体保护水平不高,应加快国产FHV-1相关疫苗的研制,及时对猫进行免疫预防。     

猫泛白细胞减少症病毒的分离鉴定及VP2基因遗传变异分析

为了探究呼和浩特地区猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus, FPV)的流行毒株及其VP2基因的遗传变异情况,试验采用病毒分离、形态学观察、PCR方法及间接免疫荧光试验对疑似感染FPV猫的粪便进行检测,通过动物致病性试验检测病毒的致病性,采用PCR方法扩增病毒的VP2基因并测序,分析其遗传变异情况。结果表明：分离毒株在F81细胞中培养96 h后出现细胞病变;电镜观察到直径为25 nm左右的病毒粒子;PCR检测可扩增得到大小约为1 555 bp的特异性条带;间接免疫荧光检测可观察到绿色荧光;分离株对猫具有致病性;测序后确定分离株为FPV,将其命名为HHHT-1株。HHHT-1株与GenBank中18株FPV参考毒株的同源性为98.8%～99.7%,与FPV-Beijing-01株、FPV-Shenyang-05株位于同一分支,遗传距离较近,同源性在99.4%～99.7%之间。HHHT-1株的VP2基因序列中只是个别碱基发生变化,编码的氨基酸未发生缺失。说明FPV的VP2基因变异率较低。     

猫泛白细胞减少症病毒的研究进展

猫泛白细胞减少症(feline panleukopenia,FP)也叫猫瘟热、猫传染性肠炎、猫细小病毒感染,简称猫瘟.此病是由猫泛白细胞减少症病毒(feline panleukopenia virus,FPV)引起的,猫特别是幼龄猫易感的一种发热性、高度接触性、致死性传染病.     

北京地区猫泛白细胞减少症病毒VP2基因的遗传进化分析

猫泛白细胞减少症病毒(FPV)对猫科动物危害较大，病毒VP2基因在决定其抗原性和宿主范围中起重要作用。为了解FPV的流行状况及其VP2基因遗传变异和进化方向，本研究对北京地区宠物医院疑似感染FPV的猫采样，共采集到16份粪便样品；对FPV VP2基因进行PCR扩增和测序，得到12条长度1 755 bp的VP2序列；利用软件将获得的VP2基因序列与国内外报道的流行株进行同源性比对、遗传进化分析，结果显示，12条VP2序列均属于G1基因群，与参考株M38246相比亲缘关系较远。本研究为北京地区猫泛白细胞减少症的有效防控提供理论依据。     

虎源猫泛白细胞减少症病毒VP2基因的原核表达及其抗原特性

利用PCR技术从虎源猫泛白细胞减少症病毒(FPV)HLJ株细胞培养物中扩增VP2基因,测序后插入原核表达载体pGEX-6p-1构建pGEX-6p-VP2重组质粒,转化BL21(DE3)中进行诱导表达。表达蛋白经切胶法纯化,所得产物用Western blot法检测其抗原活性。以纯化的重组VP2蛋白作为抗原,通过建立检测家猫FPV自然感染抗体的间接ELISA方法来研究该蛋白作为猫科动物猫泛白细胞减少症通用诊断抗原的特性。测序结果显示:该基因全长1755bp,编码584个氨基酸。SDS-PAGE和Western blot显示表达产物以包涵体形式存在,大小约为84000(其中目的蛋白58000,GST标签26000),并具有抗原性。间接ELISA抗体检测法的应用结果显示表达的重组VP2蛋白可以作为诊断抗原用于家猫FPV自然感染抗体的间接ELISA检测。并初步证明该蛋白具有作为猫科动物猫泛白细胞减少症通用诊断抗原的特性。     

一株猫疱疹病毒Ⅰ型（FHV-1）的分离鉴定及攻毒模型建立

从一只临床表现为流脓涕、打喷嚏的猫身上分离出一株猫疱疹病毒Ⅰ型(Feline herpesvirus typeⅠ,FHV-1),使用F81细胞进行分离,并通过PCR、透射电镜和糖蛋白D(gD)基因序列分析来鉴定病毒。通过PCR方法从猫的鼻分泌物中扩增出1125 bp的gD基因。序列分析表明,该分离株与从GenBank获得的其他FHV-1毒株属于同一家族。随后在接种猫鼻分泌物的F81细胞的培养上清中观察到有包膜和直径约120 nm左右的疱疹样病毒颗粒。将分离获得的FHV-1病毒感染2～3月龄蓝猫,成功建立动物实验模型,感染后的猫出现脓性的眼鼻分泌物,打喷嚏等临床症状,且一周内持续排毒。该分离株为FHV-1的病原学研究提供了重要的数据,也为猫鼻气管炎疫苗候选株的筛选和疫苗的研发奠定了基础。