山羊ATF6基因重组慢病毒干扰载体的构建及鉴定

为了研究ATF6通路介导的山羊胎盘滋养层细胞(goat trophoblast cell,GTC)凋亡的作用机制,需要构建激活转录因子6(ATF6)基因慢病毒干扰载体用于试验。采用RNA干扰技术,设计合成以山羊ATF6基因CDS区为靶点的shRNA,构建重组慢病毒载体、慢病毒包装、慢病毒转染、RT-qPCR和Western blot等方法,筛选出干扰效率达60%的shRNA干扰片段,构建出可用于今后ATF6通路相关研究的重组慢病病毒干扰载体,为山羊妊娠相关研究提供材料。     

靶向SynDIG1的shRNA慢病毒载体的构建及功能鉴定

为了构建靶向突触分化诱导基因1(SynDIG1)的shRNA慢病毒表达载体,设计出SynDIG1的siRNA的靶点序列,并合成含干扰序列的双链DNA发卡结构shRNA,合成的Oligo经过退火分别与双酶切处理后的pLKO.1-GFP载体连接.将构建的重组质粒pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA转化到DH5a...     

绵羊Myostatin基因shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

针对绵羊Myostatin基因特异性序列,设计4对shRNA,并合成高表达载体。将干扰质粒和高表达载体瞬时共转染HEK293细胞,应用Real-time PCR鉴定干扰效率,将筛选到最有效的shRNA表达载体和pDONR221载体进行BP重组反应,以获得含干扰序列的入门载体。然后将含干扰序列的入门载体和慢病毒表达的目的载体pLenti6/BLOCK-iT-DEST进行LR重组反应,以获得含干扰序列的慢病毒表达载体。qPCR检测病毒物理滴度。结果本试验成功构建绵羊Myostatin基因RNAi慢病毒载体,病毒的滴度为：9.3×109 TU/mL。为研究Myostatin基因对肌肉生长的影响提供了稳定感染细胞载体。     

慢病毒载体及慢病毒介导的RNA干扰

慢病毒载体是高效的基因转导工具,能将外源基因序列稳定导入分裂期细胞和非分裂期细胞.将慢病毒载体与RNA干扰结合能在哺乳动物的各类细胞中特异性抑制同源基因的表达,它将是基因功能研究和基因治疗的有力手段.应用慢病毒载体进行转基因动物的制备,转基因的效率将得到显著提高.慢病毒介导的RNA干扰具有高效、稳定、特异性强的特点,它能在哺乳动物的各类细胞、多种疾病的离体细胞中实现稳定的RNA干扰.该技术被广泛用于基因功能的研究,在疾病的基因治疗上也具有良好的前景.     

慢病毒载体及慢病毒介导的RNA干扰

慢病毒载体是高效的基因转导工具,能将外源基因序列稳定导入分裂期细胞和非分裂期细胞.将慢病毒载体与RNA干扰结合能在哺乳动物的各类细胞中特异性抑制同源基因的表达,它将是基因功能研究和基因治疗的有力手段.应用慢病毒栽体进行转基因动物的制备,转基因的效率将得到显著提高.慢病毒介导的RNA干扰具有高效、稳定、特异性强的特点,它能在哺乳动物的各类细胞、多种疾病的离体细胞中实现稳定的RNA干扰.该技术被广泛用于基因功能的研究,在疾病的基因治疗上也具有良好的前景.     

慢病毒介导的小鼠生长抑素shRNA序列的设计和筛选

生长抑素(SS)是一种多功能的脑肠肽,在动物生长轴中主要作为生长激素(GH)的负性调控因子。本研究通过慢病毒表达质粒介导shRNA,瞬时转染自身表达SS的BHK-21细胞,筛选出了靶向小鼠SS的最有效的siRNA序列。首先,分别在小鼠SS基因mRNA的246、433和539bp处找到潜在靶位点,合成3条siRNA转录模板的发夹结构以及1条阴性对照,体外退火后插入pshRNA-copGFP lentivector构建重组质粒。然后,通过对转染BHK-21细胞的荧光观察、Real-time PCR、免疫组化以及RIA等检测,转染细胞SS在mRNA水平及蛋白水平均检测到不同程度的抑制(P<0.05)。其中,psh2(SS 433～451)表现出了最高的沉默效率(转染效率68.9%时,mRNA水平的沉默效率达59.3%,P<0.05;蛋白质水平的沉默效率达55.6%,P<0.05)。本研究为降低SS在动物体内的分泌,相应提高GH的浓度,进而为促进动物生长的研究奠定了基础。     

猪skMLCK基因RNAi慢病毒载体的构建及干扰效率测定

为了构建猪骨骼肌肌球蛋白轻链激酶(sk MLCK)基因有效短发夹RNA(shRNA)的慢病毒载体,筛选出最佳干扰效率的序列,采用RNAi技术,设计并合成3条siRNA干扰序列,插入到慢病毒穿梭质粒(h U6-CMV-puror-Ploy A)上,与慢病毒包装系统共转染293T细胞,收集病毒上清并进行病毒滴度的测定,将其转染小鼠C2C12细胞,分别用实时定量PCR和Western blot方法检测细胞中sk MLCK基因mRNA和蛋白的表达。结果显示:PCR扩增和测序分析结果显示靶向sk MLCK RNAi慢病毒载体构建成功;转染小鼠C2C12细胞后,sk MLCK基因mRNA和蛋白均受到不同程度抑制,实时定量PCR显示,抑制率分别为(29.2±4.43)%、(76.4±7.33)%、(20.0±1.8)%;Western blot显示,抑制率分别为(29.6±5)%、(42.4±1.6)%、(34.3±1.2)%。结论:成功构建猪sk MLCK基因有效shRNA的慢病毒载体,确定干扰载体-2(sk MLCKRNAi-2)具有最佳干扰效果,证实sk MLCK基因RNAi慢病毒载体能有效抑制目的基因mRNA和蛋白的表达,为进一步研究该基因与肌肉肉质性状的关系奠定了基础。     

猪Sirt2慢病毒干扰载体的构建

为了研究猪Sirt2基因在脂肪细胞增殖和分化中的作用,试验针对Sirt2基因设计并合成了3对siRNA序列,经退火、酶切后连接于慢病毒表达载体LentiH1上,然后与慢病毒包装质粒混合共转染293T细胞,48 h后收集细胞,浓缩病毒,并检测病毒效价和感染效率.结果表明:3个shRNA慢病毒干扰载体经包装浓缩后获得的病毒...     

小鼠Zbtb38基因慢病毒过表达质粒的构建与鉴定

本研究旨在构建Zbtb38（zinc finger and BTB domain containing 38）基因慢病毒过表达质粒载体。以小鼠脊髓组织为材料,采用重叠延伸PCR方法扩增小鼠Zbtb38基因的CDS序列,分别设计Zbtb38 CDS序列前段扩增引物1和后段扩增引物2,再以上述两对引物的扩增产物作为模板,设计引物3并进行融合PCR扩增,由此得到Zbtb38 CDS全序列。将获得的Zbtb38基因CDS全序列连接到质粒pGM-T,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,采用直接PCR鉴定阳性克隆并进行测序验证。利用XhoⅠ和BamHⅠ双酶切方法将Zbtb38 CDS序列连接至慢病毒载体Plvx-puro,获得穿梭质粒Plvx-puro-Zbtb38,再与慢病毒包装质粒共转染293T细胞生产慢病毒颗粒。结果显示,引物1扩增产物包含Zbtb38 CDS全序列的第1-1 794 bp,扩增产物实际测序长度为1 772 bp,引物2扩增产物包含Zbtb38 CDS全序列的第1 762-3 594 bp,扩增产物实际测序长度为1 818 bp,说明分段扩增目的片段已成功。引物3扩增的预期融合产物及菌落PCR扩增产物均包含Zbtb38 CDS全序列（3 594 bp）,与NCBI数据库Zbtb38基因的CDS序列比对后的重合率达99.99%,表明Zbtb38 CDS序列扩增成功。实时荧光定量PCR检测结果显示,病毒滴度达3.25×10⁸ Tu/mL,达到普通动物注射标准要求,提示慢病毒载体构建成功。综上所述,本试验成功构建了小鼠Zbtb38基因慢病毒过表达质粒载体。     

家兔DEPTOR基因过表达和shRNA干扰慢病毒载体的构建与验证

为了构建DEPTOR基因的过表达载体和shRNA干扰慢病毒载体,并验证载体的有效性,试验采用RT-PCR方法扩增兔DEPTOR基因编码区(CDS)序列,得到DEPTOR基因片段,同时合成DEPTOR基因的shRNA干扰序列。将DEPTOR基因片段分别连接到慢病毒真核表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1和融合表达载体pEGFP-N1上,获得过表达载体pLVX-DEPTOR-IRES-ZsGreen1和pEGFP-DEPTOR;将shRNA干扰序列连接到慢病毒干扰载体pSicoR-Ef1a-mCh上,获得shRNA干扰慢病毒载体pSicoR-shRNA-508。用过表达载体转染HEK 293T细胞,72 h后观察荧光蛋白的表达情况并收集细胞,RT-PCR检测细胞水平上DEPTOR基因的表达情况。使用多质粒共同转染法,将过表达载体pEGFP-DEPTOR与shRNA干扰慢病毒载体pSicoR-shRNA-508按照1∶1比例转染HEK 293T细胞,72 h后观察荧光蛋白的表达情况并收集细胞,采用实时荧光定量PCR方法检测shRNA干扰序列对DEPTOR基因表达的干扰效率。结果表明：...     

山羊myostatin基因慢病毒RNA干扰载体的构建及效果验证

myostatin基因是肌肉生长和发育的关键负调控因子之一,该基因突变或失活的物种都呈现肌肉增大的双肌表型,暗示在家畜中使该基因失活可以增加其产肉量。为了进一步揭示myostatin在山羊胎儿成纤维细胞中的生物学功能以及制备可有效失活myostatin基因的工具,将筛选的myostatin基因潜在RNA干扰靶位点连接到慢病毒干扰载体的转移质粒中,构建慢病毒介导的RNA干扰载体,验证其干扰效果。结果表明,干扰序列与转移质粒连接正确,成功构建myostatin基因慢病毒干扰载体,慢病毒三质粒共转293T细胞,获得的慢病毒颗粒可高效转染山羊胎儿成纤维细胞,Real-time PCR检测发现慢病毒干扰载体Lv322有效减少山羊胎儿成纤维细胞中myostatin基因mRNA 75%的表达(P<0.01),Western blotting检测显示myostatin蛋白则有效降低了94%(P<0.01)。本试验为研究myostatin基因的功能及制备失活转基因动物提供有效工具以及理论基础。     

慢病毒载体的研究进展及应用

慢病毒载体是近年来受到广泛关注的一种逆转录病毒载体,具有更安全、转移效率高、可将目的基因整合入宿主基因组和可感染非分裂期细胞等优点,因此有望成为理想的基因转移载体,并在临床和生产实践中广泛应用。作者主要以HIV-1为代表对慢病毒载体的构建及其在基因治疗和转基因动物生产中的应用作一综述。     

慢病毒载体构建策略及生物安全性研究进展

慢病毒可以感染分裂细胞和非分裂细胞,是较有前途的病毒载体,来源于HIV-1型载体,能阻止形成有复制能力的HIV-1病毒,构建一个更为安全的模式是慢病毒载体构建策略的焦点。该文介绍了慢病毒载体应用过程中的不同载体系统及构建策略,对载体的生物安全性进行了分析,展望了慢病毒在基因治疗、RNA干扰及转基因领域的应用前景。     

慢病毒载体的构建及其应用于转基因动物的研究进展

为提高慢病毒载体构建水平,提高转基因整体效率,作者综述了慢病毒载体结构及围绕改善生物安全性、提高目标基因装载量、扩大宿主范围而进行的慢病毒载体改造研究发展历程,指出新型慢病毒载体去除了病毒所有辅助基因,引入了外源调控序列,替换了包膜蛋白,大大提高了慢病毒载体的安全性、基因转移效率和表达效率,使宿主细胞类型更广范,而下游表达载体转染方法的研究又为转基因方法的集成与优化奠定了基础。慢病毒载体制备与多种转基因技术的优化集成,将有助于发展简便、高效、经济的转基因新技术,提高转基因技术的整体水平。     

转基因动物中慢病毒载体包装的优化

慢病毒载体作为基因治疗载体发展起来,现已用于转基因动物制备.本实验用磷酸钙沉淀法将转移质粒(pCCL-hCMV-eGFP)、包装质粒(pCMVΔR8.9)、包膜蛋白质粒(pMDG(VSV-G))三质粒共转染来源于人胚肾细胞系的包装细胞-293T,转染48 h后收集病毒上清,采用6孔板培养感染细胞,荧光显微镜计数EGFP阳性细胞法测定病毒滴度.载体滴度达2×107 TU/ml左右.     

慢病毒载体系统研究及应用进展

近年来,慢病毒载体系统(lentivirus vector system)研究发展迅速,作为基因改造的有效手段在生命科学领域中得到广泛运用.该系统携带基因片段大,整合效率高,能够感染多种分裂期与非分裂期的细胞,实现基因在宿主体内的长期稳定表达.现就慢病毒载体系统的基本结构、发展历程以及临床应用等方面的研究情况进行综述,...     

布鲁氏菌侵染对类泛素SUMO-1表达的影响及类泛素SUMO-1慢病毒表达载体的构建

研究布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7后类泛素SUMO-1的表达变化,并构建小鼠类泛素SUMO-1基因过表达的慢病毒载体。本试验分别利用布鲁氏菌16M、M5-90侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,利用实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测细胞中类泛素SUMO-1的表达;利用DNA重组技术将类泛素SUMO-1基因片段插入到慢病毒表达载体pLEX-MCS 中,获得重组慢病毒质粒pLEX-SUMO-1,测序鉴定成功后转染293T 细胞,包装好的慢病毒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,并利用实时荧光定量PCR、Western blotting方法分别检测细胞中类泛素SUMO-1 mRNA及蛋白表达水平。结果表明,布鲁氏菌16M、M5-90侵染细胞后,在感染早期类泛素SUMO-1的表达受到抑制,12 h内呈现下降趋势,在12 h后开始上升,极显著高于正常水平(P < 0.01);测序结果证明,类泛素SUMO-1基因正确插入到pLEX-MCS 质粒中;实时荧光定量PCR方法检测表明,类泛素SUMO-1 mRNA转录水平上调。由此可见,布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7能够引起细胞内类泛素SUMO-1表达的改变;成功构建了类泛素SUMO-1慢病毒过表达载体,为进一步研究类泛素SUMO-1的功能奠定基础。     

家兔Zfx基因shRNA干扰载体构建及验证

研究主要是为了构建出针对家兔Zfx基因的shRNA重组载体及效果验证。根据家兔Zfx基因mRNA序列特征,设计出3条shRNA片段,再与线性化的pLL 3.7载体进行连接重组,最后经过qRT-PCR检测Zfx基因mRNA表达量筛选出有效重组表达载体并通过体内试验进行效果验证。结果表明:试验组shRNA-c和shRNA-f干扰效率分别为74%和67%,与空白对照组相比差异极显著(P<0.01);试验组shRNA-e干扰效果为17%,与空白对照组相比差异不显著(P>0.05)。用shRNA-c和shRNA-f进行体内试验,结果显示,两试验组雄性率分别为44.92%(P>0.05)和33.16%(P<0.01)。本试验成功构建针对家兔Zfx基因的重组载体,体内试验显示子一代出现性别偏移,说明Zfx基因对动物的性别决定有一定作用,关于导致体内验证出现反转的原因仍需进一步验证。     

猪神经介素B受体基因慢病毒过表达载体的构建与鉴定

【目的】构建猪神经介素B受体(NMBR)基因慢病毒过表达载体,并检测其在猪Leydig细胞中的表达,为研究NMBR基因过表达在猪睾丸间质(Leydig)细胞中的功能提供参考。【方法】根据猪NMBR基因(GenBank登录号：KM058699)CDS序列设计并合成特异性酶切引物,通过RT-PCR扩增获得猪NMBR CDS全长序列,构建pMD19-T-NMBR质粒;通过XbaⅠ和EcoRⅠ对pCD513B-1和pMD19-T-NMBR质粒双酶切,构建pCD513B-1-NMBR重组质粒;将pCD513B-1-NMBR重组质粒与辅助质粒共转染人胚肾细胞(HEK-293T),转染48 h后通过荧光倒置显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)情况,收集细胞培养液上清获得猪NMBR基因过表达慢病毒,并通过倍比稀释法测病毒效价;然后将猪NMBR基因过表达慢病毒转染猪Leydig细胞,转染48 h后观察细胞中GFP表达,收集细胞并通过实时荧光定量PCR检测NMBR mRNA的表达情况。【结果】通过RT-PCR成功扩增获得猪NMBR CDS全长序列,大小为1 173 bp; pMD19-T-NMBR重组质...     

Beclin-1基因shRNA慢病毒载体的构建及其对B16F10细胞自噬及活力的影响

利用RNA干扰技术构建稳定沉默Beclin-l基因的B16F10小鼠黑色素瘤细胞系，分析稳转细胞系的自噬水平和活力，为探讨Beclin-1基因、自噬与肿瘤三者关系奠定基础。构建小鼠Beclin-l基因干扰载体，转染至293T细胞，获得慢病毒颗粒，将病毒颗粒感染B16F10细胞，通过加压筛选、有限稀释、细胞驯化得到稳定转染m-Beclin-1-shRNA1的B16F10细胞系。采用RT-PCR和免疫荧光技术检测对Beclin-l的干扰效果，Western blot和透射电镜分析稳转细胞系中自噬标志物LC3蛋白表达及自噬小体形成情况，CCK-8法检测稳转细胞系的活力。结果表明，成功构建了靶向抑制Beclin-l基因表达的shRNA，纯化的慢病毒滴度为1×10⁸ TU·mL^-1，建立的细胞系中Beclin-1 mRNA和蛋白表达都受到不同程度的抑制，mRNA的沉默效率约为75%（P<0.01），发现干预Beclin-1表达能够抑制LC3-Ⅱ蛋白的表达及自噬小体的形成数量，降低B16F10细胞活力。以上结果表明，干扰Beclin-1表达能够有效降低B16F10细胞自噬活性，促进B16F10细胞死亡，这为探讨Beclin-1基因功能及自噬在抗肿瘤中的作用奠定重要基础。