脊尾白虾隐花色素基因cry1的克隆及其功能分析

为探究隐花色素基因(cryptochrome,cry)在甲壳类中的节律调节功能,本研究根据脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)转录组序列,利用RACE技术获得了脊尾白虾cry1基因cDNA序列全长并对其进行功能分析。脊尾白虾cry1基因全长2190bp,开放阅读框1845bp,5’端非编码区为241bp,3’端非编码区为104bp,共翻译出614个氨基酸,预测蛋白质的分子质量为70.5kDa,理论等电点为5.09。同源性分析显示,脊尾白虾cry1基因与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannameiS)的同源性最高,为71.6％。荧光定量分析结果表明,脊尾白虾cry1基因在眼柄、鳃、心脏、胃、肝胰腺、性腺、肌肉、肠道和腹索神经中均有表达,其中眼柄的表达量最高,性腺和心脏次之；不同时段的表达结果表明,其表达量在日节律(24h)中表现出先下降再上升的趋势。不同光色条件下RNA干扰(RNA interference,SRNAi)结果显示,注射后3~6h蓝光光照下脊尾白虾cry1基因的表达量显著高于白光光照,9~24h蓝色和白色光照下的表达量无显著差异,而RNA干扰组的表达量显著低于对照组,此结果显示cry1基因可能主要响应蓝光周期节律。目前对甲壳类生物钟的研究较少,该研究为深入探究甲壳类生物钟基因的调控机制提供帮助。     

氟苯尼考对脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)免疫和抗氧化功能的影响

为研究氟苯尼考对脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)免疫和抗氧化功能的影响,以低、中、高(10、20和40 mg/kg·BW)3种剂量氟苯尼考药饵连续投喂脊尾白虾5d,对照组投喂基础饲料.于停止投喂药饵后的第3、6、12、24、48、96、168和240 h取血淋巴,测定血蓝蛋白(HEM)含量、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)和总抗氧化能力(T-AOC)等指标的变化情况.结果显示,低、中剂量组HEM含量均在3h时间点显著高于对照组(P＜0.05),高剂量组在3-48 h显著高于对照组(P＜0.05);低、中剂量组ACP活性在3h和6h显著高于对照组(P＜0.05),高剂量组在3-168 h显著低于其他3组(P＜0.05);低、中剂量组AKP活性在3h均显著高于对照组(P＜0.05),6-48 h显著低于对照组(P＜0.05),高剂量组在3-48 h显著低于对照组(P＜0.05);低、中剂量组T-SOD活性整体高于对照组,分别在6h和24 h达到最高值(P＜0.05),高剂量组在24 h和48 h显著低于对照组(P＜0.05);低、中、高剂量组CAT活性均在3h和6h显著高于对照组(P＜0.05),之后在12-96 h显著低于对照组(P＜0.05),于24 h达到最低值(P＜0.05);低、中、高剂量组T-AOC活性均在3-96 h显著低于对照组(P＜0.05),于48 h达到最低值(P＜0.05),且出现剂量效应.本研究结果为氟苯尼考在海水养殖生产中使用的安全评估提供了数据支持.     

脊尾白虾抗细胞凋亡因子DAD1基因的克隆及其组织表达分析

取健康脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)成体, 体长(5.81±0.32) cm, 体质量(1.18±0.35) g。根据本实验室已构建的脊尾白虾血细胞全长cDNA文库进行EST测序分析, 获得脊尾白虾抗细胞凋亡因子DAD1基因的cDNA全长并命名为EcDAD1基因。该序列全长645 bp, 包括5′非编码区184 bp, 开放阅读框345 bp和3′非编码区116 bp, 共编码114个氨基酸, 预测分子量为12.85 kD, 理论等电点为8.75。同源性分析表明, 脊尾白虾抗细胞凋亡因子EcDAD1氨基酸序列与其他物种DAD1有高度同源性, 与斑节对虾(Penaeus monodon)的相似性最高, 为92%; 与其他无脊椎动物的相似性为73%~80%。系统进化分析表明, 脊尾白虾EcDAD1与斑节对虾的DAD1紧密聚为一支。荧光定量PCR分析结果表明, EcDAD1基因在脊尾白虾血细胞、鳃、肝胰腺、肌肉、卵巢、肠、胃和眼柄中均有表达, 其中卵巢中的相对表达量最高。感染鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和WSSV后6 h和12 h, 脊尾白虾血细胞和肝胰腺中EcDAD1的表达量较对照组均显著增加(P<0.01), 且不同时间点间差异显著, 表明EcDAD1基因可能在脊尾白虾抵抗病原体入侵机体的过程中具有重要作用。

     

脊尾白虾家系育苗试验

采用天然纳苗获得的脊尾白虾,经人工强化培育后挑选健康强壮的个体作为亲本,进行家系配对人工育苗.试验设9组,亲虾抱卵孵化后采用小水体培育幼体,幼体初期投喂螺旋藻粉.平均育成率达到67.49%,最高育成率达到73.91%.     

蒽对脊尾白虾存活和免疫的影响

以脊尾白虾(Palaemon carincauda)为研究对象进行葱的毒性试验,设置0、6、9、12、15、18、21和24 mg/L 8个处理,每个处理设3个重复,每个重复10只白虾,96小时试验结果发现,蒽对白虾的24小时半致死浓度为19.62 mg/L、48小时半致死浓度为15.61 mg/L、72小时半致死浓度为11.18 mg/L、96小时半致死浓度为7.21 mg/L,安全浓度为2.95 mg/L。之后在蒽安全浓度下胁迫脊尾白虾,设2个处理,每个处理3个重复,每个重复60只白虾,使用相关酶活性试剂盒测定脊尾白虾0、3、6、12、24、48、96和192小时的超氧化物歧化酶活性、总抗氧化能力、过氧化物酶活性和丙二醛含量,结果发现随着时间的推移,虾体内超氧化物歧化酶活性先升高然后逐渐降低,丙二醛含量上下波动无明显变化,总抗氧化能力先升高后逐渐减小,过氧化物酶活力在波动中逐渐上升。总的来说,蒽会降低脊尾白虾的免疫调节能力。     

脊尾白虾EcERR基因的克隆与表达分析

雌激素相关受体(estrogen-relatedreceptor,ERR)是一种真核转录因子,与雌激素的效应有密切关系,参与生物体的能量代谢、细胞增殖分化和性腺发育等生理过程.为了解ERR基因在脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)卵巢发育中的作用,采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆获得脊...     

脊尾白虾GAPDH基因的克隆及其内参基因稳定性分析

为比较甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、18S rRNA和β-actin基因在脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)作内参基因的优劣,本研究采用同源克隆和RACE技术,克隆了脊尾白虾GAPDH基因全长cDNA序列(GenBank登录号:KX893516),通过实时荧光定量PCR(quantative real-time PCR,qPT-PCR)技术,检测3种基因在脊尾白虾不同组织及不同蜕壳后时间点的表达量变化,在此基础上进行内参稳定性分析。结果显示,脊尾白虾GAPDH基因全长1514 bp,开放读码框1002 bp,编码333个氨基酸,二级结构预测显示GAPDH蛋白具有一个高度保守的NAD~+结合功能域(NAD binding domain)和行使糖运输和代谢的催化功能域。分析qRT-PCR结果并结合ge Norm、Norm Finder和Best Keeper 3种软件的分析发现,在不同组织和不同蜕壳后时间点,3种内参基因的稳定性由高到低依次为18S r RNA、GAPDH、β-actin。因此,在脊尾白虾不同组织和不同蜕壳后时间点的定量分析中,选取单内参基因时,推荐使用18S rRNA为内参基因,双内参时推荐18S rRNA和GAPDH,而18S rRNA、β-actin和GAPDH在其他生理条件下作内参基因的稳定性还有待进一步研究。     

脊尾白虾甘露糖结合凝集素(MBL)基因在抗镉胁迫中的生物学功能分析

为研究Cd2+胁迫下脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)甘露糖集合凝集素(MBL)在肝胰腺中表达量的变化特征,本研究利用重金属镉(Cd2+)对脊尾白虾进行96 h急性毒性实验。实验共设置5组Cd2+浓度胁迫(0、0.01、0.0175、0.021和0.0278 mmol/L),分别在Cd2+胁迫后0、3、6、12、24、48、72和96 h共8个时间点取样。实时荧光定量结果显示,高浓度Cd2+(0.0175、0.021和0.0278 mmol/L)胁迫下,脊尾白虾MBL基因的表达量先呈上升趋势,在72 h达到峰值后随后下降,但各时间点表达量均与对照组存在显著性差异(P<0.01);Cd2+浓度为0.01 mmol/L时,脊尾白虾MBL基因的表达量整体呈下降趋势。进一步采用RNA技术干扰该基因表达后,发现Cd2+胁迫后的脊尾白虾个体死亡率显著增加。本研究表明,脊尾白虾MBL在应答Cd2+胁迫过程中可对机体起到一定的保护作用。     

脊尾白虾养殖技术研究

综述了脊尾白虾池塘养殖、秋冬季养殖、混合养殖和低盐度养殖等各种模式的养殖技术以及对脊尾白虾营养生理的研究情况,指出了目前我国脊尾白虾养殖中存在的主要问题,并提出了以后的研究方向。     

脊尾白虾血蓝蛋白基因cDNA的克隆与表达分析

应用RACE技术克隆了脊尾白虾血蓝蛋白基因全长cDNA序列,并对该序列进行了分析.结果显示,该基因全长2 158 bp,开放式阅读框长1 992 bp,5’非编码区长26 bp,3’非编码区长140 bp,将该基因命名为EcHc.EcHc编码663个氨基酸,前15个氨基酸组成信号肽,推测成熟肽的分子量为75.05kDa.Blast比对结果显示,由脊尾白虾血蓝蛋白cDNA序列推导的氨基酸序列与日本沼虾、信号小龙虾血蓝蛋白氨基酸序列的同源性分别为86％、68％,由此推断该cDNA序列可能属于血蓝蛋白家族.利用Real-time PCR方法,分别研究了鳗孤菌和白斑综合征病毒(WSSV)感染脊尾白虾后,肝胰腺组织中EcHc基因在不同时间点的表达变化.实验结果表明,细菌或病毒感染后,EcHc基因在肝胰腺组织中的表达量显著增加,且均在感染后6h达到最高值,揭示脊尾白虾血蓝蛋白基因EcHc在脊尾白虾的免疫防御中具有重要作用.     

凡纳滨对虾ARMC8基因的克隆及表达

为了研究含Armadillo重复蛋白8在凡纳滨对虾抗病感染过程中所起的免疫作用,本实验采用RACE-PCR技术首次克隆得到凡纳滨对虾ARMC8基因(LvARMC8,Gen Bank注册号:KX058562)的c DNA序列全长,并利用在线软件进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR(Rt-PCR)技术对LvARMC8基因在凡纳滨对虾不同组织及感染白斑综合征病毒和副溶血弧菌过程中的表达变化特征进行分析。结果显示,LvARMC8基因全长为2917bp,其中开放阅读框长2046 bp,编码681个氨基酸,5′非编码区长49 bp,3′非编码区长822 bp。预测分析显示LvARMC8编码的蛋白质含有6个ARM结构域。同源性分析发现,LvARMC8基因与内华达古白蚁ARMC8基因的相似度最高,为71%。系统进化分析结果显示,LvARMC8和多种无脊椎动物ARMC8聚为一支,其中与昆虫类动物赤拟谷盗、致倦库蚊和柑橘凤蝶的亲缘关系最近。Rt-PCR分析发现,LvARMC8基因在凡纳滨对虾多个组织中均能检测出,在表皮中表达量最高,眼柄中表达量最低。WSSV感染后12 h,LvARMC8基因在凡纳滨对虾血液中的表达量显著降低,但48 h后显著升高,72 h达到最高水平。除副溶血弧菌感染后24 h外的时间点,LvARMC8基因在凡纳滨对虾血液中的表达量均显著升高。研究表明,LvARMC8基因可能参与凡纳滨对虾抗病免疫应答途径。     

脊尾白虾丝氨酸蛋白酶抑制剂基因克隆及表达分析

采用RACE方法获得了脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin基因的cDNA序列。该基因全长1 516 bp, 开放阅读框1 245 bp, 编码414个氨基酸, 其预测分子量为45.06 kD, 理论等电点为5.694, 并含有两个糖基结合位点。同源性分析发现其与斑节对虾(Penaeus monodon)同源性最高, 达到49%。组织表达分析表明, serpin基因在脊尾白虾血细胞中表达量最高, 其次是肝胰腺和鳃组织, 在肌肉中表达量最低。不同盐度胁迫后脊尾白虾的血细胞serpin基因表达量在盐度胁迫8 h时显著高于对照组(P<0.05), 肝胰腺组织中serpin基因表达量在盐度胁迫后2 h和24 h出现明显峰值, 且显著高于对照组(P<0.05)。上述结果表明, 脊尾白虾serpin基因参与了急性盐度胁迫下机体的应激反应。本研究通过克隆脊尾白虾酚氧化酶原激活系统中的丝氨酸蛋白酶抑制剂基因cDNA全长, 分析盐度胁迫后其在血细胞和肝胰腺组织中的表达变化规律, 以期为脊尾白虾的健康养殖提供理论基础和参考依据。

     

脊尾白虾E75基因克隆及E75、ECR和RXR在不同蜕皮分期的表达分析

本研究在克隆脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)E75基因(EcE75,GenBank No.KY471317)的基础上,探讨了其在蜕皮过程中的作用,同时也探讨了克隆脊尾白虾的蜕皮激素受体基因(EcECR)和维甲酸X受体基因(Ec RXR)在不同蜕皮分期的表达特征。克隆的EcE75基因全长为3944 bp,包括2520 bp的开放阅读框(ORF)。该开放阅读框编码一个由839个氨基酸组成的蛋白质,分子量为92.307 k Da,理论等电点为7.48。EcE75蛋白包含1个C4锌指结构,1个配体结合结构域,并且有1个明显的跨膜螺旋。EcE75基因在进化上具有一定的保守性,与甲壳动物聚为一支,与三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)、黑背地蟹(Gecarcinus lateralis)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)等亲缘关系最近。EcE75基因在脊尾白虾的各组织中均有表达,其中,眼柄中的表达量最高,卵巢次之。在不同蜕皮分期中,EcRXR与EcECR、EcE75的表达规律基本一致,生殖蜕皮前期和后期表达量都比生长蜕皮高。生长蜕皮和生殖蜕皮因为卵巢发育而存在明显不同,蜕皮激素对卵巢发育的刺激作用,通过EcECR、EcRXR和EcE75基因的表达上调可以体现出来。对EcECR、EcRXR和EcE75基因在不同蜕皮分期的表达研究,为了解虾蟹类蜕皮机制提供了参考信息。     

脊尾白虾翻译控制肿瘤蛋白基因TCTP克隆及自噬调控相关基因在卵巢发育期的表达

为深入了解脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)卵巢发育和卵黄蛋白原发生的分子机制,本研究克隆得到脊尾白虾翻译控制肿瘤蛋白基因TCTP,并结合自噬调控基因TCTP、Hif-1α、Beclin1和Bcl-2在卵巢发育期的表达水平,阐释脊尾白虾卵黄蛋白原合成过程中的分子调控特征。研究显示,脊尾白虾TCTP基因c DNA全长为732 bp,编码168个氨基酸,具有典型的TCTP1和TCTP2功能域以及PKC和TKⅡ等mTOR信号通路相关的磷酸化位点。同时发现,甲壳动物TCTP普遍缺乏在其他动植物中高度保守的C末端的cys残基。进化分析显示,脊尾白虾TCTP与中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)亲缘关系最近。4种自噬调控基因在脊尾白虾卵巢发育期的表达结果显示,肝胰腺TCTP基因从增殖期到产后恢复期呈递减趋势;肝胰腺Hif-1α、Beclin1和Bcl-2基因表达趋势相似,即从增殖期到小生长期高表达,大生长期极显著下降,表达量最低(P0.01),这与外源性卵黄蛋白原的合成趋势大致相反。这些自噬调控基因可能通过自噬作用共同调节外源性卵黄蛋白原的合成。卵巢TCTP基因在小生长期表达量最高;卵巢Hif-1α基因从增殖期到产后恢复期持续升高,这与内源性卵黄蛋白原表达趋势相似;卵巢Beclin1基因在大生长期表达量最高,与脊尾白虾卵巢Ec R表达趋势相似,与卵巢Bcl-2基因表达趋势相反,这些自噬调控基因可能通过自噬作用共同促进内源性卵黄蛋白的合成。本研究表明,自噬调控基因TCTP、Hif-1α、Beclin1和Bcl-2在脊尾白虾卵巢发育时期相互协调共同作用,可能通过自噬作用调节脊尾白虾卵黄蛋白原的合成和卵巢发育。     

引起凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死病的副溶血弧菌MLST新序列型

针对12株引起凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的致病性副溶血弧菌,运用多位点测序技术,分析致病菌株的遗传特征。实验选择副溶血弧菌的7个管家基因dnaE、gyrB、recA、dtdS、pntA、pyrC及tnaA,对12株AHPND致病菌扩增测序。将核酸序列上传至PubMLST数据库进行比对后获得每株菌的序列型。收集其他地区AHPND致病性副溶血弧菌的多位点序列分型(MLST)数据,采用eBURSTV3及MEGA5.0软件进行遗传进化分析。结果显示,2014年中国广东分离的AHPND致病株属于一个新序列型ST1710(42、134、99、79、141、41、51),仅与库中ST415及ST975同源性较高。目前,急性肝胰腺坏死致病株的9种ST型可归为2个克隆组和5个单体。经系统发育树进一步分析可知新序列型ST1710与单体ST975遗传关系相近。本研究首次报道中国AHPND分离株的序列型,丰富了PubMLST数据库,并为其遗传进化研究奠定了理论基础。     

脊尾白虾14-3-3 基因cDNA 全长的克隆和表达分析

利用本实验室构建的脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)血细胞cDNA文库中脊尾白虾14-3-3巨球蛋白基因EST序列,采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术,克隆获得脊尾白虾14-3-3基因c DNA全长,命名为Ec14-3-3。该基因全长2905 bp,包含744 bp的开放阅读框,编码247个氨基酸组成的蛋白质,分子量为27.95 kD,理论等电点为4.65。同源性分析表明,脊尾白虾Ec14-3-3氨基酸序列与斑节对虾(Penaeus monodon)14-3-3的同源性最高,达到98%。荧光定量PCR分析结果表明,Ec14-3-3基因在血细胞、卵巢、肝胰腺等组织中均有表达,其中血细胞中Ec14-3-3相对表达量最高。感染鳗弧菌和WSSV后6 h,脊尾白虾血细胞和肝胰腺中Ec14-3-3基因的表达量较对照组均显著增加(P0.05),且具有明显的时间差异性。本研究结果表明,Ec14-3-3基因在脊尾白虾免疫反应中发挥重要作用。     

脊尾白虾养殖研究进展

为确定2018年冬季以来江苏省沿海地区养殖脊尾白虾患“僵尸病”的病原及流行病学特点,实验采用LB培养基和PDA培养基从病虾血淋巴中分离得到直径为1~3 mm、边缘整齐、米黄色隆起菌落;人工回感实验结果显示,回感后的脊尾白虾表现出与自然患病脊尾白虾相同的症状,并在回感脊尾白虾体内也分离出了相同的菌株,符合科赫氏法则。对该菌株进行形态观察结合18S rRNA序列对比及系统发育分析,发现分离菌株MQ2101具有酵母的典型形态,且与二尖梅奇酵母相似度达99.82%,结果表明菌株MQ2101为二尖梅奇酵母。致病性结果初步分析显示,MQ2101对脊尾白虾的半致死浓度 (LD₅₀)为1.39×10⁷ CFU/尾。病理学观察发现,患病脊尾白虾鳃、肌肉和肝胰腺均发生不同程度的病变,其中肝胰腺病变最为严重,肝小管呈现空泡化,管腔体积变大;在鳃和肝胰腺组织中均存在大量定殖的菌体。流行病学调查结果显示,每年2—5月发病迅速,发病率为5%~30%,死亡率为3%~10%。本研究确定了二尖梅奇酵母为江苏沿海地区脊尾白虾“僵尸病”的病原,其对脊尾白虾具有较强致病性,主要侵染组织为肝胰腺和鳃。以上研究结果为脊尾白虾“僵尸病”的防控提供了相关科学依据。\t\t\t\t