基于重组蛋白TPx的羊肝片吸虫感染Dot-ELISA检测方法的建立

利用大肠杆菌原核表达系统表达的羊肝片吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶(thioredoxin peroxidase,TPx)为诊断抗原,建立羊肝片吸虫感染Dot-ELISA检测方法。结果显示:重组蛋白约为30 000;各组分的最适反应条件为:抗原最适包被量为0.28μg/片,血清最佳工作浓度和工作时间分别为1∶400和30min,酶标二抗最佳工作浓度和工作时间分别为1∶800和45 min,血清和酶标二抗最佳反应温度均为37℃,最适封闭液和封闭条件分别为2%BSA-TBS和37℃2h,最佳显色时间30min。该方法特异性较强、灵敏度高、重复性好。运用该方法对浙江海宁和桐乡共200份羊血清样本进行检测,阳性率为1.5%。结果表明:本试验应用重组蛋白TPx通过PVDF(聚偏氟乙烯微孔)膜固相载体建立了羊肝片吸虫Dot-ELISA检测方法。     

基于大片吸虫分泌排泄产物层析组分的牛片形吸虫病间接ELISA诊断方法的建立

为建立更敏感、特异的牛片形吸虫病早期诊断方法,本试验将收集的大片吸虫分泌排泄产物（Fasciola gigantica excretory-secretory products,FgESP）进行凝胶过滤层析并从中筛选出检测效果最优的UV280吸收峰,从此峰对应的组分中筛选出诊断效果最优的层析组分后将其作为抗原,通过棋盘滴定试验优化抗原包被浓度、血清稀释度、酶标二抗稀释度、显色时间等,确定临界值,建立牛片形吸虫病间接ELISA诊断方法。对建立的方法进行敏感性和特异性试验,检测试验感染0~14周的水牛血清和临床160份水牛血清样本,并与已有的诊断抗原FgESP（阴阳临界值为0.320）进行诊断效果比较。结果显示,层析组分F22具有较优的检测效果。间接ELISA的最佳反应条件为：F22抗原包被浓度0.157 μg/mL,待测血清与酶标二抗的稀释度分别为1：400和1：40 000,显色时间为25 min。应用建立的方法检测15份水牛阴性血清,确定D_{450 nm}阴阳性临界值为0.408。比较F22与FgESP发现,二者特异性相似,但F22作为抗原的敏感性高于FgESP。检测试验感染大片吸虫的水牛0~14周血清,结果表明,从感染第2周开始F22-IgG水平极显著高于FgESP-IgG水平（P<0.01）,因此,F22比FgESP诊断效果更优。对160份水牛血清检测发现,F22阳性检出率为71.25%,FgESP阳性检出率为63.75%。上述结果表明,相比于FgESP,以F22作为诊断抗原建立的大片吸虫病间接ELISA诊断方法敏感性更高,可更有效地进行牛大片吸虫病的早期诊断。     

基于NS4蛋白的蓝舌病病毒间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用

旨在建立蓝舌病病毒（BTV）血清学ELISA抗体检测方法,本研究以原核表达并纯化的BTV NS4重组蛋白为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种BTV重组NS4蛋白的间接ELISA抗体检测方法。SDS-PAGE结果显示,获得大小约52 ku的NS4重组融合蛋白,主要在上清中存在,Western blot显示,纯化后的重组蛋白具有良好的抗原性。通过方阵试验进行了ELISA反应条件优化,确定了重组蛋白抗原最佳包被量为3.0 μg·孔^-1;血清最佳稀释倍数为1：200,酶标二抗最佳工作浓度为1：4 000,临界值分别为0.29和0.35。上述以NS4蛋白作为包被抗原建立的BTV抗体间接ELISA方法检测敏感性可达1：1 600;批内和批间重复性变异系数均小于10%;检测76份重庆地区牛群血清样品,阳性符合率为98%,阴性符合率为100%。本研究建立的间接ELISA方法为临床BTV血清抗体检测及BTV血清流行病学调查奠定了基础。     

大片形吸虫病早期诊断夹心ELISA方法的建立及应用

为建立一种早期诊断大片形吸虫病的试验方法,本试验对5株分泌抗大片形吸虫分泌排泄抗原(ES)单克隆抗体的杂交瘤细胞进行复苏、制备单克隆抗体,配对筛选出7D1、7D2单克隆抗体,将7D2作为包被抗体,7D1作为酶标抗体,通过条件优化,建立早期诊断大片形吸虫病的夹心ELISA方法。结果显示,当包被抗体稀释度为1:6 400 (0.208 μg/mL)、采用5%脱脂奶粉封闭、酶标记抗体稀释度为1:10 000 (0.200 μg/mL)时,最早可检测到感染此病第7天小鼠的血清循环抗原,其敏感性可达到1:3 200 (0.156 μg/mL),与其他几种寄生虫抗原均无交叉反应,具有较高的特异性和稳定性。本试验成功建立了早期检测大片形吸虫病的夹心ELISA方法,为大片形吸虫病的诊治及开发早期诊断大片形吸虫病的试剂盒奠定了基础,具有临床应用价值。     

非洲猪瘟病毒p30基因的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测血清中非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体的间接ELISA方法,本试验将ASFVp30基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白进行表达鉴定和免疫原性分析,随后以纯化的重组蛋白为包被抗原,经条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种血清中ASFV抗体的检测方法。结果显示,ASFVp30基因成功克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,获得pET-32a-p30重组质粒;转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,得到P30重组蛋白,重组蛋白大小约为42ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,纯化后的蛋白具有良好的免疫原性;以纯化的P30重组蛋白为包被抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了抗原最佳包被浓度为1.2μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1∶100,最佳封闭液为1%BSA,酶标抗体最佳稀释度为1∶4 000,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.322。本方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达到1∶1 600;批内重复性和批间重复性变异系数均10%。本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可初步应用于ASFV抗体的检测。     

鹅圆环病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立鹅圆环病毒(GoCV)抗体的检测方法,本研究通过原核表达重组核衣壳(Cap)蛋白,将纯化的该重组蛋白作为ELISA检测的包被抗原,利用交叉反应性,以羊抗鸡IgG(HRP-IgG)作为二抗,经反应条件的优化,建立了检测鹅血清GoCV抗体的间接ELISA方法。确立的ELISA反应最适条件为:抗原包被浓度为2.05μg/mL,待检血清稀释度为1∶50,HRP-IgG稀释度为1∶2000,待测血清和二抗均于37℃反应1.5h,底物于室温显色10 min。经38份阴性血清检测确定阴阳性临界值为0.25。特异性试验结果显示,该方法与大肠杆菌、新城疫、禽流感H5和H9、小鹅瘟、鹅副粘病毒抗原阳性血清均无交叉反应;重复性试验结果显示,其批内和批间变异系数均小于10%。应用该方法检测了从4群GoCV PCR检测阳性种鹅群采集的血清,结果显示其血清阳性率在60.0%～90.9%。本实验建立的间接ELISA方法具有较好的特异性和重复性,为进一步开展GoCV流行病学调查提供了一种便捷可靠的手段。     

气肿疽梭菌CctA基因的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立

研究旨在原核表达气肿疽梭菌细胞毒素A （CctA）基因,用纯化的重组蛋白建立其间接ELISA检测方法,a。利用大肠杆菌密码子的偏爱性优化CctA基因序列,克隆至原核表达载体pET-28a （+）,双酶切鉴定原核表达质粒pET28a-CctA并测序。将重组质粒转入大肠杆菌,经IPTG诱导得到高表达的重组CctA包涵体蛋白。包涵体蛋白变性后经镍（Ni）柱纯化,SDS-PAGE检测其纯化效果。以豚鼠抗气肿疽梭菌抗血清为一抗,用Western blotting方法检测重组CctA蛋白的反应原性。用棋盘滴定法建立间接ELISA检测方法,以复性后的重组CctA蛋白作为检测抗原,摸索抗原包被浓度、封闭液的种类及浓度、抗体的最适稀释度和反应条件等。选用3批气肿疽灭活疫苗免疫豚鼠后采集血清,同时用攻毒和间接ELISA两种方法验证疫苗的免疫效力。质粒双酶切结果显示,得到大小约853 bp的条带,与预期相符,且测序结果正确。SDS-PAGE结果表明,成功表达并纯化大小为35 ku的重组CctA蛋白。Western blotting结果显示,豚鼠抗气肿疽梭菌抗血清与重组CctA蛋白具有良好的反应原性。建立的间接ELISA法的最适条件为：抗原的包被浓度为0.5 μg/mL,于4 ℃包被过夜;封闭液选择10%胎牛血清,37 ℃孵育2 h;二抗的稀释度为1：8 000;室温避光显色10 min后终止反应,测定D_{450 nm}值。当P/N>4.6时,间接ELISA法检测结果与豚鼠攻毒试验结果拟合度较好。本研究成功表达CctA基因并纯化了重组CctA蛋白,建立的以重组CctA蛋白为检测抗原的间接ELISA检测方法,有望成为气肿疽灭活疫苗免疫效果验证的替代方法。     

猪附红细胞体α-烯醇化酶基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

为建立以猪附红细胞体α-烯醇化酶(ENO)重组蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法。本实验将猪附红细胞体ENO基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达质粒pGEX-4T-ENO,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,并对其表达产物纯化及western blot鉴定。以ENO重组蛋白为包被抗原,优化反应条件,建立了猪附红细胞体ENO基因的间接ELISA检测方法。结果显示,经原核表达获得了分子量约为69 ku的重组蛋白,主要以可溶性形式存在;经western blot鉴定,纯化后的蛋白具有良好的反应原性。以纯化的ENO重组蛋白为包被抗原建立间接ELISA检测方法,优化后的反应条件为:抗原的最适包被浓度为20.5μg/mL;最佳封闭条件为3%的脱脂乳封闭2 h;待检血清最适稀释倍数为1:80;兔抗猪HRP-IgG最佳稀释倍数为1:1 000;OPD显色时间为15 min;特异性试验结果显示,所建立的间接ELISA检测方法与猪弓形虫、猪大肠杆菌、猪肺炎支原体、猪链球菌等均无交叉反应;该方法检测猪附红细胞体阳性血清的灵敏度为1:320;批内和批间重复性变异系数均低于5%;应用所建立的间接ELISA检测方法与IFA检测方法平行检测50份采自延边地区某猪场的猪血清样本,两种方法的总符合率为90%。本研究建立的间接ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可初步应用于猪附红细胞体血清学检测。     

大豆抗原蛋白血清抗体间接ELISA检测方法的建立

旨在建立检测血清大豆抗原蛋白抗体的间接ELISA方法。经琼脂糖凝胶层析纯化大豆抗原蛋白,以不同剂量皮下注射免疫小鼠,采用方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度,并对其他条件进行优化,最终建立检测血清大豆抗原蛋白抗体的间接ELISA方法,利用该方法检测小鼠免疫后血清抗体水平。通过方阵滴定法确定11S蛋白最佳包被浓度为5.0μg/mL,血清稀释倍数为1∶800;7S蛋白抗原最佳包被浓度为2.5μg/mL,血清稀释倍数为1∶1 600;两者的批内、批间系数均小于10%,重复性较好,通过ELISA法确定11S和7S蛋白的最佳免疫次数为2次,免疫剂量为1 000μg/kg。结果表明本试验初步建立大豆抗原蛋白抗体检测间接ELISA方法,具有很强的特异性、敏感性和重复性,可用于大豆抗原蛋白过敏反应的临床检测。     

欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

本研究利用原核表达并纯化的重组蛋白pCold TF-HA1作为包被抗原,建立欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒抗体的间接ELISA检测方法。通过反应条件的优化,确定了间接ELISA最佳工作条件:抗原最佳包被浓度为800 ng/孔,血清稀释度为1:200,封闭时间为1 h,一抗血清最佳作用时间为2 h,酶标二抗最佳稀释度为1:40 000,二抗最佳作用时间为1 h,TMB显色时间为7 min。阴/阳性血清的判断结果分别为OD_(450)≤0.255和OD_(450)≥0.292,介于两者之间为可疑。符合性试验结果显示,建立的间接ELISA方法与血凝抑制(haemagglutination inhibition,HI)检测的阳性率分别为53.27%和49.53%,两者总复合率达96.27%。特异性试验结果显示,该方法与古典H1N1亚型和H3N2亚型猪流感阳性血清无交叉反应。通过重复性试验表明,同一批制备的重组蛋白包被96孔酶标板,检测OD_(450)值的批内变异系数为1.97%~7.85%,批间变异系数为1.94%~6.93%。总之,本研究建立的禽源H1N1亚型猪流感病毒抗体间接ELISA方法,具有敏感性较高、特异性强、重复性好的特点,为猪流感抗体检测提供了一种准确、快捷、简便、有效的技术手段,可用于禽源H1N1亚型猪流感抗体检测和流行病学调查。     

非洲猪瘟病毒p30基因的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测血清中非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）抗体的间接ELISA方法,本试验将ASFV p30基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白进行表达鉴定和免疫原性分析,随后以纯化的重组蛋白为包被抗原,经条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种血清中ASFV抗体的检测方法。结果显示,ASFV p30基因成功克隆到原核表达载体pET-32a （+）中,获得pET-32a-p30重组质粒;转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞进行诱导表达,得到P30重组蛋白,重组蛋白大小约为42 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,纯化后的蛋白具有良好的免疫原性;以纯化的P30重组蛋白为包被抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了抗原最佳包被浓度为1.2 μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1：100,最佳封闭液为1% BSA,酶标抗体最佳稀释度为1：4 000,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.322。本方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达到1：1 600;批内重复性和批间重复性变异系数均<10%。本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可初步应用于ASFV抗体的检测。     

猪源粪肠球菌Ace蛋白间接ELISA方法的建立与应用

根据GenBank已发表粪肠球菌Ace基因(AF260879)的核苷酸序列设计1对引物,通过PCR扩增Ace基因保守序列A片段部分序列,将其克隆到pET-32a(+)裁体中,构建了原核表达载体pET-32a(+)-Ace,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,成功表达并纯化了重组蛋白;以此重组蛋白作为抗原建立了检测粪肠球菌Ace抗体的间接ELISA方法。经反复试验,确定该间接ELISA的最佳反应条件为:抗原包被浓度为1mg/L,被检血清稀释度为1∶800,1%BSA为封闭液,血清和二抗的作用时间均为60min,底物TMB反应时间为15min,反应的阳性判定值为0.126。交叉试验、批内重复和批间重复试验证明,所建立的间接ELISA方法具有特异性高、重复性好的特点,可用于粪肠球菌Ace蛋白血清抗体的检测。     

犬冠状病毒核衣壳蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

以犬冠状病毒(CCV)TN449株为对象,对CCV核衣壳蛋白(N蛋白)编码基因进行克隆和原核表达,通过使用纯化的重组N蛋白,建立了CCV抗体间接ELISA检测方法。结果显示,重组N蛋白具有良好的CCV抗原反应性;经优化ELISA反应条件,确定重组N蛋白最佳包被浓度为1.0μg/m L、待检血清的最佳浓度为1∶100、阴阳性判定临界值为0.418;通过对比检测犬瘟热等多种犬病阳性血清,未发生交叉反应,证实该间接ELISA方法特异性好;用建立的间接ELISA方法对本室保存的50份CCV阳性血清和阴性血清进行复检,证实其符合率为100%。     

基于重组EP153R蛋白的检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA方法的建立

为探究非洲猪瘟病毒(ASFV)EP153R蛋白的功能和建立ASFV抗体间接ELISA方法,本试验构建了EP153R蛋白杆状病毒表达系统,采用Western blot与IFA鉴定rEP153R蛋白的表达和免疫原性。结果显示,杆状病毒能高效表达rEP153R蛋白且可被小鼠多克隆抗体识别,具有良好的免疫原性。以此重组蛋白为抗原进行间接ELISA方法的建立,经方阵ELISA确定当抗原包被量2.5 μg/mL,ASFV阳性血清稀释比1∶1000时为最佳反应条件;以优化后的条件确定了抗体阳性临界值为0.259;特异性试验结果表明,该方法仅与ASFV阳性血清发生反应,具有较强的特异性;重复性试验结果显示变异率小于10%,重复性良好。利用该方法对46份猪血清进行检测,与商品化试剂盒检测结果对比显示,符合率为91.3%,能较好的区分ASFV阴性血清与阳性血清。本研究的结果为后续EP153R功能研究和ASFV临床血清学诊断奠定了基础。     

肝片吸虫免疫显性抗原基因的筛选及鉴定

为筛选出特异的肝片吸虫诊断候选抗原,拓展诊断靶标,利用肝片吸虫阳性血清筛选肝片吸虫cDNA表达文库,获得肝片吸虫特异性抗原基因,采用RT-PCR技术扩增目的基因,连接表达载体pET-32a(+),构建重组质粒,转化入感受态细胞BL21(DE3)中,利用IPTG对重组蛋白进行诱导表达,通过SDS-PAGE及Western blot技术对蛋白表达情况进行鉴定。结果显示:经筛选获得了17个肝片吸虫免疫显性抗原基因,其中假定蛋白Fh010935为肝片吸虫特异性抗原基因;扩增得到的Fh010935核苷酸序列大小为144 bp,编码48个氨基酸,A+T含量为55.56%;Fh010935蛋白由1个α-螺旋,2个β-折叠和3个β-转角构成,具有3个抗原表位,推测该蛋白可能具有较好的抗原性;重组蛋白主要以包涵体形式表达,分子量大小约24 ku,可以被肝片吸虫感染阳性血清特异性识别,具有较好的反应原性。提示:假定蛋白Fh010935可作为肝片吸虫病诊断候选抗原,为疾病诊断制剂的开发提供前期基础。     

肝片吸虫免疫显性抗原基因的筛选及鉴定

为筛选出特异的肝片吸虫诊断候选抗原,拓展诊断靶标,利用肝片吸虫阳性血清筛选肝片吸虫cDNA表达文库,获得肝片吸虫特异性抗原基因,采用RT-PCR技术扩增目的基因,连接表达载体pET-32a(+),构建重组质粒,转化入感受态细胞BL21(DE3)中,利用IPTG对重组蛋白进行诱导表达,通过SDS-PAGE及Western blot技术对蛋白表达情况进行鉴定。结果显示:经筛选获得了17个肝片吸虫免疫显性抗原基因,其中假定蛋白Fh010935为肝片吸虫特异性抗原基因;扩增得到的Fh010935核苷酸序列大小为144 bp,编码48个氨基酸,A+T含量为55.56%;Fh010935蛋白由1个α-螺旋,2个β-折叠和3个β-转角构成,具有3个抗原表位,推测该蛋白可能具有较好的抗原性;重组蛋白主要以包涵体形式表达,分子量大小约24 ku,可以被肝片吸虫感染阳性血清特异性识别,具有较好的反应原性。提示:假定蛋白Fh010935可作为肝片吸虫病诊断候选抗原,为疾病诊断制剂的开发提供前期基础。     

边缘无形体MSP2的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立可检测边缘无形体（Anaplasma marginale）的血清学检测方法,该研究根据GenBank收录的边缘无形体MSP2基因序列（登录号：EU526889）,构建重组质粒pET28a-MSP2,原核表达获得pET28a-MSP2重组蛋白,将纯化后的蛋白作为抗原,建立间接ELISA检测方法。结果显示,该研究建立的间接ELISA方法,抗原最佳包被浓度、血清最佳稀释度和酶标二抗最佳工作浓度分别为8μg/mL、1∶400和1∶2 000,特异性、灵敏性和重复性良好。本试验成功表达并纯化了边缘无形体的MSP2蛋白,并建立了边缘无形体抗体间接ELISA方法,为边缘无形体的监测和诊断提供参考。     

水牛肝片吸虫病间接ELISA诊断方法的建立及应用

以肝片吸虫的分泌－排泄物作为抗原（ES抗原），建立水牛肝片吸虫病间接ELISA诊断方法，并用此方法与粪便检查法检测江苏和安微2省10县（市）302户的307头水牛的血清和粪便；间接ELISA诊断法的最佳工作条件，每乳包被0．2μg抗原，血清稀释度为1：960，二抗稀释度为1：600。结果粪便检查出虫卵的阳性水牛43头，阳性率为14．01％，其中安徽省为11．61％（18／155），江苏省为16．45％（25／152）；用间接ELISA法检测299头水牛血清，阳性87头，阳性率为29．19％，其中安徽省为23．53％，江苏省为34．92％，两种方法的符合率为86．05％。     

布鲁菌Rev.1株eryA基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

通过对布鲁菌优势抗原eryA基因进行原核表达,在获得目的蛋白的基础上建立以该蛋白为包被抗原的间接ELISA方法。构建原核表达载体pET-30a-eryA,并将其转入大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达,镍柱亲和纯化eryA重组蛋白,SDS-PAGE 鉴定纯化蛋白,Western-Blotting检测反应原性后建立间接ELISA方法。反应条件优化后,抗原包被浓度为0.312 5 μg/mL,37 ℃包被2 h;封闭液为5%猪源明胶,37 ℃作用2 h;血清稀释度为1∶100,37 ℃作用1 h;酶标抗体稀释度为1∶8 000,37 ℃作用45 min。血清稀释度为1∶1 600时,仍然检测为阳性,证明建立的间接ELISA方法灵敏性良好;其他菌种及病毒经过特异性检测,均为阴性,证明建立的间接ELISA方法特异性良好;通过重复性检测,批间及批内变异系数均小于10%,证明建立的间接ELISA方法重复性良好。检测临床血清样品,建立的方法与试管凝集试验总符合率为95.7%,证明该方法可初步应用于临床诊断。     

猪脑心肌炎病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

以猪脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)VP1重组蛋白为包被抗原,建立了检测EMCV血清抗体的间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA).经优化,获得间接ELISA的最佳反应条件为抗原包被浓度0.625 μg/mL,待...