番鸭细小病毒安徽分离株结构蛋白基因的克隆及序列分析

为研究番鸭细小病毒(MDPV)安徽分离株的遗传变异特征,通过PCR扩增获得了MDPV结构蛋白(VP)基因全长序列AH-MDPV-VP,并将该序列与GenBank中登录的12条MDPV和鹅细小病毒(GPV)VP基因序列进行比对。结果显示,AH-MDPV-VP基因全长2 199bp,包括完整的VP1、VP2和VP3蛋白编码区。MDPV与GPV的VP基因部分序列一致,但具有明显的差异。进化分析显示,MDPV安徽分离株与基因重组型MDPV上海分离株SAAS-SHNH为同一分支,亲缘关系较近。同源性分析显示二者核苷酸序列同源性最高,为99.9%,且AH-MDPV-VP与GPV毒株SHFX1201的序列同源性也有89.5%。此外安徽分离株与其他MDPV的VP1、VP2和VP3基因同源性有逐步下降的趋势,而与GPV则相反呈上升趋势。进一步显示MDPV安徽分离株与基因重组型MDPV上海分离株SAAS-SHNH相似,可能为MDPV和GPV基因重组型水禽细小病毒。     

番鸭细小病毒MDPV YZ株VP2和VP3蛋白基因的克隆和序列测定

根据国外已发表的番鸭细小病毒（MDPV）FM株基因组核苷酸序列设计了1对引物，应用PCR技术扩增了MDPV YZ株的VP2和VP3蛋白基因片段。将扩增后的VP2和VP3蛋白基因克隆到pCR3.1T载体上，MDPV YZ株基因大小为1764bp，编码528个氨基酸，并对播入片段进行序列测定。测定结果表明，我国分离的MDPV YZ株蛋白基因序列与国外发表的序列的同源性为98.5%。     

番鸭细小病毒国内分离株主要结构蛋白基因的克隆和序列分析

根据国外已发表的番鸭细小病毒(MDPV)FM株基因组核苷酸序列设计1对引物,应用PCR技术扩增MDPV FS株的VP2-VP3蛋白基因片段。将扩增后的VP2-VP3结构蛋白基因克隆到T载体上,MDPV FS株基因大小为1764bp,编码528个氨基酸,对插入片段进行序列测定。结果表明,我国分离的MDPV FS株基因序列与国外发表序列的同源性为98.6%,与已发表的YZ株同源性为99.5%,可见番鸭细小病毒结构蛋白基因较保守。     

鹅细小病毒安徽分离株NS和VP基因的克隆及序列分析

为研究安徽省鹅细小病毒（goose parvovirus,GPV）的遗传变异特征,本研究通过PCR扩增获得GPV基因AH,并与天鹅、番鸭、雁鹅等宿主的GPV相应基因序列进行了比对。序列分析可见,AH基因包括完整的NS和VP基因,长度分别为1 884和2 199 bp,分别编码2个非结构蛋白和3个结构蛋白。遗传进化分析显示,安徽分离株AH基因与重庆分离株毒株RC16及安徽分离的强毒株Y、E、Yan-2等基因序列的遗传距离较近;而与安徽分离的鸭源细小病毒株DS15和匈牙利分离株Virulent B,尤其是与疫苗株SYG61v遗传距离较远。同源性分析结果表明,AH-NS基因与毒株RC16核苷酸序列同源性最高,为99.6%;与疫苗株SYG61v同源性最低,为94.3%;AH-VP基因与毒株RC16的核苷酸序列一致,而与毒株DS15同源性仅为95.2%。安徽GPV AH基因序列与强毒株的基因位点一致,在VP3基因的第797、1 141、1 144、1 169和1 185 bp处分别为G、A、G、C、T,结合该毒株引发疾病的严重程度,符合高致病力毒株特点。本试验结果表明,GPV同源性普遍较高,宿主范围较广泛,对不同品种水禽均有较强的侵染力。     

鹅细小病毒安徽分离株NS和VP基因的克隆及序列分析

为研究安徽省鹅细小病毒(goose parvovirus,GPV)的遗传变异特征,本研究通过PCR扩增获得GPV基因AH,并与天鹅、番鸭、雁鹅等宿主的GPV相应基因序列进行了比对。序列分析可见,AH基因包括完整的NS和VP基因,长度分别为1 884和2 199bp,分别编码2个非结构蛋白和3个结构蛋白。遗传进化分析显示,安徽分离株AH基因与重庆分离株毒株RC16及安徽分离的强毒株Y、E、Yan-2等基因序列的遗传距离较近;而与安徽分离的鸭源细小病毒株DS15和匈牙利分离株Virulent B,尤其是与疫苗株SYG61v遗传距离较远。同源性分析结果表明,AH-NS基因与毒株RC16核苷酸序列同源性最高,为99.6%;与疫苗株SYG61v同源性最低,为94.3%;AH-VP基因与毒株RC16的核苷酸序列一致,而与毒株DS15同源性仅为95.2%。安徽GPV AH基因序列与强毒株的基因位点一致,在VP3基因的第797、1 141、1 144、1 169和1 185bp处分别为G、A、G、C、T,结合该毒株引发疾病的严重程度,符合高致病力毒株特点。本试验结果表明,GPV同源性普遍较高,宿主范围较广泛,对不同品种水禽均有较强的侵染力。     

鹅细小病毒HN株的分离鉴定及全基因组序列分析

为研究鹅细小病毒(GPV)基因遗传变异特征,采集海南某养鹅场疑似鹅细小病毒感染的病料,将其处理后接种番鸭胚成功分离到一株病毒,经PCR鉴定为鹅细小病毒,命名为HN株,并获得了其全基因组序列,将该序列与GenBank数据库中登录的16条鹅和番鸭细小病毒基因序列进行了比对分析。结果显示,该株病毒基因组全长为5 106bp,由ITR、NS、VP构成,其中ITR为444bp,NS1为1 844bp,VP1为2 199bp;HN株与SHFX1201株的NS1基因和VP1同源性最高,分别达到99.8%和99.7%,与番鸭细小病毒株FM的NS1基因同源性最低,为82.7%;与90-0215株VP1同源性最低,为80.1%。HN株的遗传进化树可以看出,GPV可以分成明显的2个基因亚群,HN株与鹅细小病毒匈牙利株(B)、欧洲疫苗株(VG32/1)和台湾株(82-0321V、82-0321、06-0329)均处在第I亚群,且与安徽分离株Y株以及SHFX1201株同源性最接近,番鸭源匈牙利株FM单独处于第Ⅱ亚群。本研究丰富了GPV的数据资料,为研究GPV分类地位以及遗传进化关系提供了依据,同时也为研究GPV流行趋势和疫苗的开发奠定了基础。     

番鸭细小病毒国内分离株主要结构蛋白基因的克隆和序列分析术

摘 根据国外已发表的番鸭细小病毒（MDPV）FM株基因组核苷酸序列设计1对引物，应用PCK技术扩增MDPVFS株的VP2-VP3蛋白基因片段。将扩增后的VP2-VP3结构蛋白基因克隆到T载体上，MDPVFS株基因大小为1764bp，编码528个氨基酸，对插入片段进行序列测定。结果表明，我国分离的MDPVFS株基因序列与国外发表序列的同源性为98．6％，与已发表的YZ株同源性为99．5％，可见番鸭细小病毒结构蛋白基因较保守。     

番鸭细小病毒XX株VP2基因的克隆和序列分析

根据国内外已发表的番鸭细小病毒(MDPV)FM株和GD株基因序列,应用DNAstar分子生物学软件设计1对引物,应用PCR技术扩增MDPV XX株的结构蛋白基因VP2全基因片段。将扩增得到的VP2全基因克隆到PGEM-T easy载体上,经菌液PCR鉴定后的重组子进行序列测定。结果表明,MDPV XX株基因大小为1764bp,编码587个氨基酸,其基因序列与国内外发表的FM株、GD株核苷酸序列同源性分别为98.4%和99.8%,而与同属的小鹅瘟病毒B株核苷酸同源性仅为78.2%。可见编码番鸭细小病毒结构蛋白的VP2基因较保守,且和同属的小鹅瘟病毒明显不同,这也是该病毒目前只有一个血清型的分子基础。     

基因重组型番鸭细小病毒FJM3的全基因组特征

从1例未免疫雏番鸭细小病毒活疫苗与鹅细小病毒活疫苗的临床病死雏番鸭脏器中成功分离到1株番鸭细小病毒(FJM3株)。为明确其基因组特征,运用PCR方法,扩增出番鸭细小病毒FJM3株全基因组。结果表明,FJM3株基因组全长为5017nt,其基因组结构和经典番鸭细小病毒参考毒株一致。序列比对结果表明,FJM3株全基因组序列与GenBank中登录的经典MDPV参考株(FM株)核苷酸序列同源性为94.0%,与番鸭源GPV参考株(Y株)核苷酸序列同源性为85.6%。全基因组遗传进化分析表明,FJM3株处于MDPV遗传进化分支;VP1基因遗传分析表明,FJM3株处于经典MDPV遗传进化分支;VP3遗传进化表明,FJM3株处于GPV遗传进化分支。对FJM3株和参考株(FM株、Y株和SYG61v)进行遗传重组分析表明,该毒株于存在2处MDPV与GPV的基因重组现象。     

番鸭细小病毒和鹅细小病毒广东株VP1基因的克隆与序列分析

参考GenBank中的MDPV FM株和GPV B株全基因序列,设计并合成一对引物,分别对MDPV GD株和GPV GD株的结构蛋白基因(VP1)进行PCR扩增,并克隆到pMD18-T载体,筛选到重组质粒并测序.通过对MDPV GD株和GPVGD株的VP1基因的核苷酸序列分析,这两种病毒VP1基因大小均为2 199 bp,核苷酸序列同源性为87%,而位于VP1基因上的VP2至VP3基因起始密码子之间的核苷酸序列的差异较大,同源性仅为64%.另外对MDPV GD株和GPV GD株与各地方毒株的VP1和VP3基因核苷酸序列的同源性比较,显示它们之间差异较小.     

番鸭源鹅细小病毒ZQ株VP2基因的克隆和序列分析

根据国内外已发表的鹅细小病毒(GPV)B株和GD株基因序列,应用DNA Star分子生物学软件设计一对引物,应用PCR技术扩增GPV ZQ株的结构蛋白基因VP2全基因片段。将扩增得到的VP2全基因克隆到pMD18-T载体上,获得的重组质粒经PCR鉴定后进行序列测定。结果表明ZQ株基因大小为1 764 bp,编码587个氨基酸,其基因序列与GPV参考毒株推导的氨基酸序列同源性在89.1%~99.3%之间,差异较大;与番鸭细小病毒(MDPV)参考毒株相比同源性在92.0%~92.5%之间,超过与部分GPV毒株的同源性,推测可能与该毒株来源于番鸭而不是鹅有关,另外也在基因水平上解释了GPV与MDPV在血清学上存在交叉反应的部分原因。     

番鸭细小病毒弱毒株VP2基因的序列分析

将番鸭细小病毒强毒株MDPV－Q经番鸭胚传代，获得致弱株MDPV－26，应用PCR技术扩增MDPV－26株的VP2基因片段，将扩增后的VP2基因重组到pMD 18-T质粒载体上，并对插入片段进行序列测定，将测定结果及由该结果推导的氨基酸序列分别与MDPV－Q株及国外已发表的MDPV相应序列进行同源性比较及分析，结果表明，MDPV－26与强毒株MDPV－Q的VP2基因序列及与国外分离株均具有很高的同源性。     

2008年-2009年广东番鸭细小病毒分子流行病学研究

VP2基因是番鸭细小病毒(MDPV)的主要免疫原性基因,其编码的VP2蛋白能够诱导机体产生中和抗体。本文对2008年～2009年从广东各县市分离、鉴定的11个MDPV野毒株VP2基因进行克隆测序,并对获得的VP2基因序列进行比较和分析。结果表明:11个不同分离株之间核苷酸序列同源性为98.7%-100%;与6个国内外参考毒株同源性为97.7%-99.6%;所有毒株都含有4个完全相同的潜在糖基化位点;说明该病毒保守度高,仅有个别的点突变。将分离株SL2连续传70代获得致弱毒株SL-70,动物实验结果表明SL70株对雏鸭无致病力;经测序发现SL-70与其祖代分离株SL2的VP2基因序列同源性高达99.9%,仅发生了18个碱基的点突变。     

番鸭细小病毒弱毒株VP2基因的分子克隆与序列测定

将番鸭细小病毒（MDPV）强毒Q株经番鸭胚连续传代，获得致弱株MDPV－26，根据已发表的MDPV的全基因序列，设计了1对引物LHMP7／LHMP8，同时在这2条引物中分别加入2种限制性核酸内切酶Sac Ⅱ和KpnⅠ的酶切位点，应用PCR技术扩增了MDPV0－26株的VP2基因片段，将扩增后的基因片段重组到pMD18-T质粒载体上，并对插入片段进行序列测定，测序结果表明，弱毒株MDPV－26与强毒株MDPV－Q的VP2基因序列相同率达99．7％，与国外分离株的同源性为98．3％，说明强，弱毒株的VP2基因序列变化不大。     

番鸭细小病毒的分离及其VP1基因序列分析

广东省肇庆市某番鸭场1周龄雏鸭发生以腹泻、软脚为主要症状的疾病,结合流行病学调查、剖检变化等初步诊断为番鸭细小病毒(MDPV)感染。为进一步探明病原,本研究采集死亡鸭肝脏和胰脏处理后接种鸭胚上皮细胞,细胞出现变圆、脱落等典型的细胞病变。用番鸭细小病毒VP1基因特异性引物对病毒进行PCR扩增并测序。结果显示,VP1基因大小为2 199 bp,与GenBank已发表的6株MDPV参考毒株的VP1基因序列同源性达98%以上,其中与福建株同源性最高,达99.4%。利用鸭胚上皮细胞成功分离到一株番鸭细小病毒,将其命名为MDPV-ZQ株。本研究为掌握番鸭细小病毒的流行病学及其变异趋势提供参考依据。     

番鸭细小病毒YL08分离株NS1基因的克隆及序列分析

为了了解番鸭细小病毒(MDPV)非结构蛋白(NS1)基因的分子生物学特性,试验根据GenBank中发布的其他MDPV基因序列,设计并合成可扩增NS1基因的特异性引物,利用PCR方法从MDPV阳性病料中获得MDPV YL08株NS1基因,将其克隆至载体p ET-32a(+)中,构建重组质粒p ET-32a-NS1,并进行同源性分析和构建系统发育进化树。结果表明:MDPV YL08分离株NS1基因全长为1 884 bp,编码627个氨基酸;MDPV YL08分离株NS1基因与国内外已发表的MDPV分离株核苷酸序列同源性为98.5%~99.4%,该分离株与福建株亲缘关系最近。     

番鸭细小病毒国内分离株主要结构蛋白基因的克隆和序列分析

根据国外已发表的番鸭细小病毒 (MPV) FM株基因组核苷酸序列 ,设计了 1对引物 ,分别对国内 2株番鸭细小病毒分离株 MPV扬州 (YZ)株和 MPV佛山 (FS)株主要结构蛋白 (VP2和 VP3)基因进行 PCR扩增 ,并克隆到p CR3.1T载体 ,经酶切鉴定筛选出阳性克隆质粒并进行核苷酸序列分析比较。结果表明 ,MPV YZ和 MPV FS的VP2 - VP3基因大小均为 176 4bp,编码 5 88个氨基酸。 MPV YZ、MPV FS与 MPV FM核苷酸序列同源性分别为98.5 %和 98.6 % ,氨基酸序列同源性为 97.1%和 97.8% ;MPV YZ与 MPV FS核苷酸序列的同源性为 99.5 % ,氨基酸序列同源性为 98.8%。     

鸭甲肝病毒VP1基因克隆及序列分析

通过PCR技术,从自行分离的鸭甲肝病毒JS株基因组中扩增出病毒衣壳蛋白VP1完整基因片段,并对该片段进行序列测定及分析。结果显示JS-VP1与DHAV-A的VP1基因序列酸核苷酸同源性在62.0%~64.4%之间,与DHAV-B的VP1基因序列酸核苷酸同源性在63.6%~63.8%之间,与DHAV-C的VP1基因序列酸核苷酸同源性在92.3%~98.5%之间,分析表明JS株为鸭甲肝病毒基因C型,血清型分型为韩国新型。进化树表明JS株与SD02株的亲缘关系较进,进一步说明VP1基因的核苷酸序列是DHAV基因组中的高度可变区,可作为DHAV基因型研究的标记,分离毒株为DHAV的防治及疫苗的设计奠定了基础。     

鹅细小病毒VP1-VP3非重叠区基因的克隆与序列分析

通过克隆鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)分离株VP1-V3非重叠区基因,并对其进行序列分析,为鹅细小病毒感染与疫苗免疫的鉴别诊断奠定理论基础.进行鹅胚病毒增殖,收集尿囊液,提取基因组,参考发表的B株序列,设计合成一对引物,经PCR扩增,克隆VP1-VP3基因,筛选阳性克隆,对其进行序列测定及同源性分析.结果表明,克隆的基因片段为901 bp,VP1-VP3基因共594 bp,编码198个氨基酸;弱毒株之间亲缘关系很近,核苷酸同源性99.5％～100％,氨基酸同源性98.5％～100％;强毒株与B株亲缘关系较近,核苷酸同源性96.6％,氨基酸同源性97.5％;弱毒株与强毒株亲缘关系较远,核苷酸同源性92％～93％,氨基酸同源性96％～97.5％;弱毒株与B株亲缘关系最远,核苷酸同源性92.5％～93％,氨基酸同源性93.9％～95.5％.说明强毒株与弱毒株之间核苷酸序列存在差异.     

鹅细小病毒JLDA株主要结构蛋白VP3基因的克隆及序列分析比较

以分离得到的鹅细小病毒JLDA株基因组DNA为模扳,根据GPVB株的基因序列设计一对扩增GPV VP3基因的特异引物,利用PCR技术,从病毒基因组DNA中扩增出病毒衣壳蛋白VP3完整基因片段,与pMD18 T simple vector连接,转化到感受态大肠杆菌DH5α中,提取重组质粒经PCR鉴定后,对插入片段进行序列测定及分析。分析结果：JLDA病毒株的VP3基因全长1605bp,编码534个氨基酸。与国内外已经发表的鹅细小病毒Goose parvovirus virulent B strain,completegenome（vp3）、GDFSH株、QTH株、Gooseparvovirus capsid protein VP3 gene-YZ、SY株、GD-01株、SCH株和DY株的核苷酸、氨基酸序列同源性在90．90％～98．10％之间,表明这9个毒株之间同源性很高,有共同的保守序列,为开发新型基因疫苗提供依据。