细胞自噬相关信号通路分子在猪卵巢黄体形成与退化过程中的表达

为了研究细胞自噬相关信号通路分子在猪卵巢黄体发育与退化过程中的表达,本试验以猪卵巢为对象,分别采集卵泡期卵巢(F)、早期黄体(E)、中期黄体(M)和晚期黄体(L),应用Western blot检测LC3-B、p-Akt、Akt、p-JAK2、JAK2、p-STAT3及STAT3的表达,应用免疫组织化学技术检测STAT3在卵巢中的细胞定位。Western blot结果显示,LC3-B在早期及中期黄体表达量较高(P0.01);p-Akt在卵泡期卵巢的表达量高于黄体期(P0.05),且黄体发育的不同时期差异不显著(P0.05);p-JAK2在早期黄体表达量较高(P0.05);p-STAT3在晚期黄体表达量显著升高(P0.01)。Akt、JAK2与STAT3的表达量在整个卵巢周期无显著差异(P0.05)。免疫组化结果显示,STAT3主要定位在猪卵巢卵泡的颗粒细胞、膜细胞和黄体的类固醇生成细胞中。结果表明,猪黄体细胞的自噬可能受多种信号通路的协同调控,为进一步研究黄体形成和退化的分子机制提供依据。     

NR4A1在猪卵巢黄体中的作用探讨

通过分析NR4A1在猪卵巢黄体中的表达与定位,探讨其在猪黄体发育与退化中的潜在作用。获取猪发情周期不同阶段卵巢组织,分离黄体(早期、中期和晚期),应用放射免疫法检测孕酮和雌二醇浓度,应用蛋白免疫印迹法检测NR4A1、CYP17A1和cleaved-Caspase-3的表达,应用免疫组织化学方法检测NR4A1和cleaved-Caspase-3的定位。结果:晚期黄体(白体)的孕酮水平显著低于早期和中期,雌二醇水平显著高于早期和中期(P0.05);早期黄体(红体)与中期黄体的NR4A1表达量无显著差异,而晚期黄体(白体)中NR4A1显著低于早期和中期(P0.05);CYP17A1在早期黄体与中期黄体无显著差异,晚期黄体显著上升;cleaved-Caspase-3在中期黄体中表达最低,而在晚期黄体中最高(P0.05)。此外,整个黄体发育与退化过程中,NR4A1主要在黄体类固醇生成细胞的细胞质中表达,而cleaved-Caspase-3在包括黄体类固醇生成细胞的所有细胞中均有表达。结果提示:猪卵巢黄体发育与退化过程中,NR4A1的蛋白表达趋势与孕酮水平一致,NR4A1可能参与调控猪黄体组织中孕酮的合成代谢,为深入研究NR4A1参与猪卵巢机能调控提供理论依据。     

JAK/STAT和PI3K/AKT信号通路介导小反刍兽疫病毒宿主细胞天然免疫的研究

为研究JAK/STAT和PI3K/AKT信号通路在小反刍兽疫病毒（PPRV）宿主细胞天然免疫中的作用,在PPRV感染山羊肾细胞24、48和72 h后,分别用MTT试验和间接免疫荧光试验（IFA）检测病毒感染细胞活力及其在细胞中的分布;用qRT-PCR和Western-blot分别检测病毒蛋白、Nectin-4受体、 JAK/STAT和PI3K/AKT信号通路及其下游信号分子表达水平的变化。结果表明,PPRV感染24、48和72 h后的细胞存活率分别为99.53%、77.12%和66.87%,病毒H和N蛋白表达水平显著增加（P<0.05）;但Nectin-4表达无显著变化（P>0.05）;p-STAT1/STAT1比值极显著升高（P<0.01）;ISG20、ISG15、IRF9、IRF3、IFNβ和IFNα表达水平显著或极显著升高（P<0.05或P<0.01）;p-AKT表达水平极显著升高（P<0.01）;p-AKT/AKT、p-NFκB/NFκB、p-GSK/GSK和p-CREB/CREB比值均显著或极显著升高（P<0.05或P<0.01...     

PEDV感染过程中TRIM5α介导的自噬对病毒复制的影响

旨在研究三结构域蛋白5α(tripartite motif protein 5α,TRIM5α)能否通过调控细胞自噬来影响猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea viru, PEDV)在非洲绿猴肾细胞(Vero-E6)中的复制。利用Western blot(WB)检测自噬标志蛋白LC3Ⅱ的表达，明确PEDV感染Vero-E6细胞后不同时间点自噬的发生情况。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测TRIM5α在自噬模型中的表达水平。设计并合成3条TRIM5α的干扰片段并筛选干扰效率最高的干扰片段，将其转染至Vero-E6细胞，PEDV感染后48 h,通过WB检测LC3Ⅱ蛋白的表达水平；RT-qPCR检测PEDV的N、ORF3基因的表达水平，同时检测PEDV滴度变化，以明确TRIM5α对自噬和PEDV复制的影响。结果表明：PEDV成功感染Vero-E6细胞并诱导细胞自噬。WB结果显示感染24、36和48 h时，试验组的LC3Ⅱ的表达量呈上升趋势，在48 h时表达量最高，且差异极显著(P<0.01),自噬被激活；RT-qPCR结果显示，TRIM5α的表...     

自噬在镉致BRL 3A细胞损伤中的保护作用

以大鼠肝细胞系(BRL 3A)为模型,不同浓度的镉处理细胞,用免疫印迹法和免疫荧光法检测自噬标记分子LC3表达;通过添加雷帕霉素(自噬促进剂)和氯喹(自噬抑制剂)来升高和降低自噬水平,MTT法检测自噬水平的变化对细胞活性的影响。结果显示:与对照组相比,随着镉浓度的升高,细胞LC3-Ⅱ含量先上升后下降,8μmol/L时,LC3-Ⅱ含量最高,差异显著或极显著(P0.05或P0.01)。与镉处理组相比,自噬水平的上升可以显著提高细胞活性(P0.05),自噬水平的下降显著降低细胞活性(P0.05)。结果表明:镉可以引起BRL 3A细胞自噬水平的上升,激活的自噬对镉致细胞损伤具有一定的保护作用。     

Notch家族及其配体在绵羊卵巢黄体组织和颗粒细胞中的表达及对激素合成的影响

为了明确Notch家族及其配体在绵羊卵巢黄体组织和颗粒细胞中的表达及对激素合成的影响,试验采用实时荧光定量PCR、免疫荧光染色等方法,对绵羊卵巢不同时期黄体组织及颗粒细胞中Notch家族及其配体的表达差异,以及在添加Notch抑制剂后类固醇激素的变化进行了研究。结果表明：在体外成功培养了绵羊卵巢颗粒细胞。Notch2基因在颗粒细胞中相对表达量显著或极显著高于不同时期的黄体(P<0.05或P<0.01),而Notch1和Notch3基因在不同时期黄体中的相对表达量显著或极显著高于颗粒细胞(P<0.05或P<0.01);配体中Jag1基因在中期黄体及晚期黄体中的相对表达量极显著高于颗粒细胞(P<0.01),Jag2、Dll1基因在各时期黄体中的相对表达量均显著或极显著高于颗粒细胞(P<0.05或P<0.01)。在添加Notch抑制剂后,孕酮含量显著上调(P<0.05),而雌二醇含量没有明显变化(P>0.05)。说明Notch不同受体及其配体在绵羊卵巢黄体组织和颗粒细胞中的表达不尽相同,并且Notch信号通路对孕酮的合成发挥负调控作用。     

牦牛LC3B蛋白多克隆抗体制备及在生殖器官表达检测中的应用

旨在克隆牦牛微管相关蛋白1轻链3B(microtubule associated protein 1 light chain 3B, LC3B)基因，制备牦牛LC3B多克隆抗体，为探究自噬在牦牛生殖生理过程中的作用奠定基础。本研究通过基因克隆方法获得牦牛LC3B基因序列，利用原核表达、亲和层析法纯化牦牛LC3B重组蛋白，使用纯化的蛋白为抗原免疫10月龄日本大耳白兔，Sepharose4B柱层析法纯化制备牦牛LC3B多克隆抗体，利用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗体效价，并使用蛋白质免疫印迹(WB)、免疫组织化学法(IHC)和免疫荧光技术(IF)检测牦牛生殖器官中LC3B蛋白的表达。结果显示，本研究成功克隆了牦牛LC3B基因(登录号：OP572227),构建的重组质粒pET-32a-LC3B能够诱导产生重组蛋白，并且在包涵体和上清中均有表达；所纯化的牦牛LC3B重组蛋白大小为34 ku(含Trx和His标签),符合预期结果。通过免疫日本大耳兔后得到的兔抗牦牛LC3B蛋白血清，抗体效价分别为1∶640 000和1∶320 000,特异性良好，表明牦牛LC3B蛋白多克隆抗体制备成功。纯化...     

自然感染OPA的羔羊肺组织中自噬相关因子的表达分析

为研究细胞自噬现象在绵羊肺腺瘤(ovine pulmonary adenocarcinoma,OPA)发生发展过程中的作用,本试验以自然感染OPA的羔羊肺组织为材料,以健康羔羊肺组织为对照组,利用免疫组织化学(IHC)染色、实时荧光定量PCR(qPCR)和Western blot等方法综合检测了自噬基因MAP1LC3B、BECN1、SQSTM1及其对应的自噬蛋白LC3、Beclin1、P62的表达情况。结果显示:在对照组中,LC3、Beclin1、P62主要表达于细支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞中;在OPA肺组织中,LC3、Beclin1、P62主要表达于肿瘤化增生的细支气管上皮细胞、增生的Ⅱ型肺泡上皮细胞和浸润的巨噬细胞中。与对照组相比,OPA肺组织中MAP1LC3B基因表达量极显著升高(P0.01),BECN1基因表达量显著升高(P0.05),而SQSTM1基因表达量则极显著降低(P0.01)。在蛋白水平上,OPA肺组织中LC3和Beclin1表达量均显著高于对照组(P0.05),而P62表达量则极显著低于对照组(P0.01)。结果表明自然感染OPA的羔羊肺组织中自噬水平明显高于健康羔羊肺组织,提示当病毒入侵机体时机体为了抵抗病毒带来的伤害并维持内环境的稳态,细胞自噬水平升高。本试验为深入探讨自噬在OPA发生发展过程中的作用提供了依据。     

Wortmannin抑制Wnt/β-Catenin通路对猪卵巢颗粒细胞发育的影响

为探究PI3K通路与Wnt/β-Catenin通路在猪卵巢颗粒细胞发育中的互作关系以及调控功能,以不同浓度(DMSO,0.1,1,1.5,3,5μM)PI3K通路抑制剂Wortmannin处理体外培养猪卵巢颗粒细胞48 h,CCK-8法检测猪卵巢颗粒细胞细胞活力,Western Blot法检测β-Catenin蛋白水平;5μM Wortmannin处理体外培养猪卵巢颗粒细胞48 h,实时定量PCR检测猪卵巢颗粒细胞内类固醇生成、激素受体和细胞凋亡相关基因的表达。结果表明,Wortmannin处理猪卵巢颗粒细胞可抑制颗粒细胞细胞增殖活力,其中3μM和5μM Wortmannin,相对其他处理组,显著地(P0.05)降低细胞增殖活力;对应的,不同浓度的Wortmannin也阻遏Wnt/β-Catenin通路,对比其他组,3μM和5μM Wortmannin处理组抑制效果最显著(P0.05);实时定量PCR检测结果表明,5μM Wortmannin处理显著下调猪卵巢颗粒细胞CYP19A1(P0.001)和CYP11A1(P0.01)mRNA水平,抑制激素受体基因FSHR和LHCGR基因表达(P0.05),促进Caspase3(P0.05)和PTSG2(P0.01)表达。综上所述,Wortmannin抑制猪卵巢颗粒细胞Wnt/β-Catenin通路,诱导细胞活力下降,促进细胞凋亡,并且阻碍激素受体表达和类固醇激素合成。     

湖羊黄体期注射PGF2α对黄体组织形态、PGF2α受体和程序性坏死相关基因表达的影响

旨在研究不同黄体期注射前列腺激素(PGF2α)对湖羊育成母羊黄体组织形态、PGF2α受体及程序性坏死通路基因表达的影响。本研究选择健康、体况良好、体重相近经同期发情处理的母羊48只，随机均分为6组，分别为黄体前期试验组和对照组、中期试验组和对照组和末期试验组和对照组母羊，试验组在发情周期第6天(黄体前期)、11天(黄体中期)、16天(黄体末期)注射1 mL PGF2α(0.1 mg),对照组在相同时间注射1 mL生理盐水，每次注射后3 h采集黄体组织，用于基因表达检测及HE组织染色检测黄体组织形态变化。结果表明，注射PGF2α后试验羊黄体组织形态发生了变化，出现炎症细胞浸润与细胞凋亡，其中黄体中期退化程度最高。未注射PGF2α的母羊，黄体前期、中期FPA mRNA表达水平显著高于黄体末期(P<0.05);黄体前期FPB表达水平显著高于黄体末期(P<0.05),与黄体中期无显著差异(P>0.05);黄体中期TNFR1表达水平显著高于黄体前期和末期(P<0.05);黄体中期RIPK3表达水平显著高于黄体末期(P<0.05),黄体中、末期与黄体前期差异均不显著(...     

猪黄体不同发育时期活性氧水平及多种抗氧化酶mRNA表达量变化规律的研究

试验旨在研究活性氧(ROS)及抗氧化酶基因表达在猪黄体组织发育及退化过程中的变化规律,为诠释猪黄体抗氧化机制补充理论基础并提供新的思路。试验所用卵巢采自延吉屠宰场,将黄体从卵巢剥离后,通过其形态大小将黄体初步分为初期、中期、后期以及白体,然后通过检测孕酮水平准确区分中期及后期黄体;通过冰冻切片及DHE荧光染色技术检测各时期黄体ROS水平,通过实时荧光定量PCR对各时期黄体内锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、过氧化氢酶(CAT)以及谷胱甘肽过氧化氢酶(GPx)的mRNA表达量进行检测。结果表明:猪黄体内ROS水平随猪黄体周期性发育进程出现规律性升高,即后期ROS水平显著高于其他时期(P<0.05);中期显著高于初期与白体(P<0.05);而初期与白体间差异不显著(P>0.05)。Mn-SOD、GPx1及GPx4基因的表达水平随黄体的发育进程则出现规律性的下降:初期及白体中这几个基因的表达水平显著高于中期与后期(P<0.05),中期显著高于后期(P<0.05)。对于GPx3基因,其在白体的表达量显著高于其他时期(P<0.05),初期表达水平显著高于中期与后期(P<0.05),中期显著高于后期(P<0.05)。CAT基因表达量不随黄体的发育而变化(P>0.05)。综合上述试验结果,ROS、Mn-SOD及GPx与猪黄体发育及退化有关;而ROS水平与Mn-SOD及GPx的表达水平呈现出相反的规律。     

过氧化氢对成肌细胞的氧化损伤作用研究

旨在以体外培养的小鼠成肌细胞(C2C12)为研究对象,探讨氧化损伤可能的路径。本试验分为3个处理组,每个处理组6个重复。处理组分别为:对照组(Control),以DMEM培养基培养的细胞作为空白对照,培养24 h;吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)组(PDTC),以每个孔1 mL的PDTC(20μmol·L^-1)孵育细胞24 h;H_2O_2组(H_2O_2),加入0.5 mmol·L^-1的H_2O_2处理细胞24 h。检测各组细胞的存活率、ROS水平与凋亡率,采用荧光定量PCR和蛋白免疫印记法检测细胞凋亡和自噬相关基因的表达以及NF-κB信号通路相关因子的表达。结果表明,与对照组相比,PDTC可显著提高细胞的总凋亡率(P<0.05),可显著上调细胞半胱天冬蛋白酶-3(caspase-3)、caspase-6、caspase-9的mRNA表达量以及caspase-3蛋白表达水平(P<0.05),显著上调Beclin 1的mRNA表达量和微管相关蛋白1轻链3(LC3)-II/I的值以及LC3-II蛋白表达水平(P<0.05),显著下调核因子kappa B副族1(p50)、B型白细胞/2型淋巴细胞样蛋白(Bcl-2)、v-rel禽网状内皮增生病病毒癌基因同源物A(RelA)和环氧合酶(Cox)-2的mRNA表达量以及NF-κB蛋白表达水平(P<0.05);H_2O_2可显著提高细胞的ROS水平和细胞总凋亡率(P<0.05),可显著上调caspase-3、caspase-6、caspase-8、caspase-9的mRNA表达量以及caspase-3蛋白表达水平(P<0.05),显著上调Beclin 1和LC3-II/LC3-I的mRNA表达量以及LC3-II蛋白表达水平(P<0.05),显著提高Bcl-2相关X蛋白(Bax)的mRNA表达量(P<0.05),显著下调p50、Bcl-2、RelA和Cox-1、Cox-2的mRNA表达量以及核因子kappa B(NF-κB)蛋白表达水平(P<0.05)。结果提示,H_2O_2会引起C2C12细胞的ROS升高,并且能够通过抑制NF-κB信号通路介导细胞凋亡和自噬的发生,这与NF-κB因子的特异性抑制剂PDTC的作用相类似。     

大豆异黄酮对肥胖大鼠肠道瘦素介导Janus激酶/信号转导及转录激活因子信号转导通路的影响

本试验旨在研究大豆异黄酮(SIF)对肥胖大鼠肠道瘦素介导Janus激酶(JAK)/信号转导及转录激活因子(STAT)信号转导通路的调控作用,探讨SIF对肥胖大鼠的干预机制。选取80只5周龄SD雄性大鼠,适应环境1周后,随机分为基础饲粮组(12只)和高脂饲粮组(68只),分别饲喂基础饲粮和高脂饲粮,饲喂8周后高脂饲粮组大鼠成功建立食源型肥胖大鼠模型。将40只肥胖大鼠随机分为SIF干预低、中、高剂量组和肥胖对照组,每组10只。低、中、高剂量组大鼠分别灌胃50、150、450 mg/kg BW的SIF提取物,基础饲粮组和肥胖对照组灌胃不含SIF提取物的溶媒剂。SIF连续干预肥胖大鼠5周,监测大鼠体重,并采用免疫组织化学链霉亲和素-生物素复合物(SABC)染色法研究大鼠肠道中长型瘦素受体(OB-Rb)、Janus激酶2(JAK2)、磷酸化的信号转导与转录激活因子3(p-STAT3)、细胞因子信号3抑制因子(SOCS3)和神经肽Y(NPY)的分布和表达。结果显示:试验各时期基础饲粮组大鼠体重均极显著低于肥胖对照组(P0.01)。SIF干预5周后,与肥胖对照组相比,各SIF干预组大鼠体重均下降,并表现出剂量依赖性,其中中、高剂量组极显著低于肥胖对照组(P0.01)。各组大鼠OB-Rb、JAK2、p-STAT3、SOCS3和NPY在十二指肠、空肠、回肠、结肠和直肠均有表达;同基础饲粮组相比,肥胖对照组大鼠上述5种因子在各肠段的表达量均显著降低(P0.05);SIF干预组中OBRb、JAK2、p-STAT3和NPY的表达量在各肠段均较肥胖对照组增多,总体呈现剂量依赖性。由此得出,SIF可通过增加肠道中OB-Rb的表达,激活JAK,加速STAT的磷酸化,改善能量代谢,减弱肥胖大鼠瘦素抵抗状态,来起到减重作用。     

猪Beclin1基因调控伪狂犬病病毒诱导细胞自噬和凋亡的机制分析

旨在研究伪狂犬病病毒(PRV)感染后细胞自噬和凋亡情况,进一步分析鉴定PRV感染条件下与Beclin1互作的猪宿主凋亡家族蛋白。利用免疫印迹(WB)方法检测PRV感染细胞的自噬水平;利用流式细胞术探讨凋亡水平;最后利用免疫共沉淀试验分析PRV感染PK-15细胞中Beclin1与Bcl-2和Bcl-xL的结合水平。结果显示,PRV感染导致LC3-Ⅱ的表达明显增多,而P62显著下降,且AKT(S473)磷酸化水平显著减少;其次,PRV感染诱导细胞凋亡且显著上调剪切型Caspase-9/8的表达水平;最后,免疫共沉淀结果显示PRV感染条件下Beclin1能与Bcl-2和Bcl-xL结合,但结合的水平明显降低。PRV感染诱导的细胞自噬可能依赖于PI3K-Ⅰ/AKT信号通路,PRV感染可能同时激活了线粒体凋亡途经和死亡受体途经从而诱导细胞凋亡,而PRV感染诱导的细胞自噬和细胞凋亡可能通过抑制Beclin1和Bcl-2、Bcl-xL结合而相互关联。     

Toll样受体2(TLR2)参与猪链球菌诱导的自噬作用

为证实Toll样受体2(TLR2)是否参与2型猪链球菌诱导的细胞自噬作用,通过阻断TLR2,并建立2型猪链球菌感染J774A.1细胞模型,分别应用荧光定量PCR分析不同处理组细胞TLR2和NF-κB mRNA水平、ELISA检测细胞上清中TNF α和IL-6含量变化以及Western blot检测细胞内LC3蛋白的表达量.结果显示,TLR2和NF-κBmRNA水平在感染后3h明显高于对照组；与对照组相比,感染组TNF-α含量及LC3Ⅱ表达均明显升高(P＜0.01)；与感染组相比,阻断TLR2后TNF-α含量及LC3Ⅱ表达均明显降低(P＜0.05).结果表明,2型猪链球菌可激活TLR2及其信号通路,并且该通路的活性影响细胞自噬作用.     

P58IPK通过PERK/eIF2α通路调控猪圆环病毒2型所诱导的细胞自噬

旨在研究猪圆环病毒2型(PCV2)感染激活的PERK/eIF2α通路是否与细胞自噬相关,以及过表达分子伴侣蛋白P58IPK在其中的作用。首先通过PERK特异性抑制剂GSK2606414和siRNA及蛋白免疫印迹检测磷酸化eIF2α(p-eIF2α)、LC3-Ⅱ和ATG5-ATG12蛋白表达,研究PCV2感染PK-15细胞24h后PERK/eIF2α通路与细胞自噬的关系;然后通过构建和瞬时转染P58IPK真核过表达质粒及蛋白免疫印迹研究过表达P58IPK对PCV2感染PK-15诱导的PERK/eIF2α通路及细胞自噬的影响。结果显示,PERK特异性抑制剂GSK2606414和siRNA干扰PERK可极显著抑制PCV2诱导的p-eIF2α(P0.01)和LC3-Ⅱ(P0.01)表达;而过表达P58IPK同样可以极显著下调PCV2诱导的p-eIF2α(P0.01)、ATG5-ATG12(P0.01)及LC3-Ⅱ(P0.01),且能极显著下调PCV2拷贝数(P0.01)。结果表明,PCV2感染PK-15通过激活PERK/eIF2α通路诱导细胞自噬,过表达P58IPK通过抑制PERK通路抑制PCV2诱导的细胞自噬,从而抑制病毒复制。     

IFN-α对山羊副流感病毒3型的抗病毒活性

旨在探讨原核表达纯化的山羊α干扰素(IFN-α)对山羊副流感病毒3型(CPIV3)的抗病毒活性。通过分析山羊IFN-α的序列特点,比对不同种属IFN-α的同源性,进而构建山羊IFN-α成熟蛋白编码基因(去除信号肽基因序列)的原核表达载体pET-30a-gIFN-α,将其转化至感受态细胞Rosetta (DE3),IPTG诱导后镍柱及亲和纯化获得山羊IFN-α。利用RT-qPCR测定山羊IFN-α作用于牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney cell, MDBK cell)后6种干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes, ISGs)的相对表达水平;同时,利用TCID₅₀及Western blot测定其对CPIV3的抗病毒活性。结果表明,原核表达的山羊IFN-α蛋白含量为0.20 mg·mL^-1,Western blot结果表明表达产物相对分子质量约为20 ku,与预期结果相符。RT-qPCR结果显示,山羊IFN-α孵育MDBK细胞后,可显著刺激RSAD2、STAT1及ISG15等6种ISGs基...     

猪急性腹泻综合征冠状病毒诱导细胞自噬并增强病毒复制的研究

为研究猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)感染细胞是否诱导自噬及自噬对病毒复制的影响,本研究将SADS-CoV (MOI 0.1)接种Vero E6细胞培养36 h后,经透射电子显微镜观察可见,SADS-CoV感染的细胞中出现了包裹胞浆的自噬体样双层膜结构,证实SADS-CoV可以诱导Vero E6细胞发生自噬。构建pEGFP-LC3的真核表达质粒并经双酶切及测序鉴定正确后转染Vero E6细胞,24 h后以SADS-CoV感染,24 h后经激光共聚焦显微镜观察可见,与阴性对照组细胞相比,感染SADS-CoV的细胞出现绿色荧光的点状聚集。进一步将SADS-CoV(MOI 0.1)感染Vero E6细胞不同时间后通过western blot检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和p62表达水平的变化,结果显示,与阴性对照组相比,SADS-CoV感染组LC3-Ⅱ的表达水平升高,LC3-Ⅱ/GAPDH比值呈上升趋势,而p62蛋白表达水平则显著降低(P<0.05),表明SADS-CoV感染能够诱导Vero E6细胞产生完整的自噬应答。为了探究自噬对病毒复制的影响,本研究分别采用自噬抑制剂3-...     

香猪睾丸间质细胞TAS1R3基因干扰后对自噬相关因子的影响

旨在探究TAS1R3基因通过mTOR对从江香猪自噬相关基因表达的影响。本试验选择30日龄健康雄性从江香猪3头，采集睾丸组织并培养出睾丸间质细胞。将构建成功的干扰载体和空载体转染至细胞中，利用qRT-PCR检测其对TAS1R3基因表达影响，运用qRT-PCR和Western blot检测TAS1R3基因干扰后对味觉受体第一家族一号受体(TAS1R1)、细胞外信号调节激酶1(ERK1)、细胞外信号调节激酶2(ERK2)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、BECN1和微管相关蛋白1轻链3β(MAP1LC3B)表达的影响。结果表明，当TAS1R3基因被干扰后，相较于shRNA-NC对照组，TAS1R1、ERK1、ERK2、mTOR基因mRNA表达量均极显著降低(P<0.01),自噬因子BECN1和MAP1LC3B表达量极显著升高(P<0.01)。Western blot结果表明当TAS1R3基因被干扰后，与shRNA-NC对照组相比，蛋白T1R3、T1R1、p-mTOR、p-S6K1、p-ERK12均极显著降低(P<0.01),而自噬蛋白Beclin 1表达量极显著升高(P<...     

绵羊发情周期中类固醇激素在卵巢中的表达

动物正常的发情周期中,黄体周期性的循环退化过程严格受P4调控。本实验在秋季经公羊试情后,于0、3、6、9、12 d选取不同发情阶段的蒙古绵羊,收集74个带黄体的卵巢,每个发情周期3个,分别获取黄体和卵巢非黄体组织。通过Western Blot和RT-q PCR技术,研究了绵羊卵巢周期性变化中黄体形成类固醇因子STAR、3β-HSD和CYP11A与能量代谢通路ERK1/2调控的关系。结果表明:黄体组织较非黄体组织m RNA的表达变化显著(P0.05),在第9天在黄体上的表达量达到最高,CYP11A成逐渐升高的趋势;3β-HSD蛋白及基因的表达一致;在绵羊发情周期中,p-ERK1/2在卵巢非黄体组织从第0天到第9天显著上升,黄体组织明显弱于非黄体组织。类固醇合成酶参与了绵羊卵巢周期性变化并与孕酮的分泌协调一致,与此同时ERK1/2通路参与黄体周期性变化的调控,进一步证实了能量代谢平衡与黄体的周期性变化密切相关。