五种培养液对萱藻丝状体生长发育的影响

提要 本文以实验室保存的萱藻丝状体为材料,采用实验生态学方法,探讨了L1、PES、F1、f/2以及ESNW等五种培养液对萱藻丝状体生长发育的影响,并以去除氮或磷成分的L1培养液为基础,研究了不同外加浓度氮和磷对萱藻丝状体生长发育的影响。结果显示:(1)五种培养液中,L1培养液最有利于萱藻丝状体的生长发育,培养28天后,丝状体生物量增重倍比可达560.48%,孢子囊枝比例高达46.88%,孢子囊直径为18.95μm;(2)萱藻丝状体生长发育最适添加NO3--N浓度为6.00mg/L,在此NO3--N浓度条件下,萱藻丝状体生长速度最快,培养20天后,孢子囊枝比例高达46.78%,孢子囊直径可达18.78μm。在添加NO3--N浓度为0.00mg/L和高氮(96.00mg/L、192.00mg/L)条件下,萱藻丝状体生长速度均相对较慢,培养20天后,孢子囊枝比例分别仅为0.00%、9.06%和7.65%,孢子囊直径仅9.00~10.00μm;(3)萱藻丝状体生长发育的最适外加PO43--P浓度为1.32mg/L,在此PO43--P浓度条件下,萱藻丝状体生长速度最快,培养20天后,孢子囊枝比例高达47.12%,孢子囊直径可达18.89μm。外加PO43--P为0.00mg/L时,培养20天后,孢子囊枝比例仅为10.12%,孢子囊直径仅有9.78μm。外加PO43--P高于15.84mg/L时,均没有孢子囊枝的形成。研究证明,在萱藻丝状体的生长发育过程中,选择一种合适的培养液以及适时地控制硝酸盐与磷酸盐的浓度,使其维持在一定范围内,从而促进萱藻丝状体的快速生长,提高其孢子囊枝比例、增大孢子囊直径。     

萱藻丝状体的种质保存技术

采用液体保存法和胶囊化低温保存法对萱藻丝状体进行保存,探讨了液体培养法中温度、光照强度以及胶囊化低温保存法中胶球含水量对萱藻丝状体种质保存的影响。结果显示:(1)在液体保存法中,温度对萱藻丝状体的保存影响较小,当光强为5.4μmol/(m2·s)时,6~18℃均可实现萱藻丝状体的长期保存;(2)光照强度对萱藻丝状体的液体保存影响显著,16.2μmol/(m2·s)及以上的光强不利于种质的保存,5.4μmol/(m2·s)对萱藻丝状体的液体保存最有利;(3)在6~18℃,5.4μmol/(m2·s)条件下保存萱藻丝状体60 d后,萱藻丝状体细胞状态良好且存活率仍在97%以上;(4)胶球含水量过高或过低均会降低萱藻丝状体胶囊化低温保存后的存活率,15%是萱藻丝状体胶球的最适含水量,在该条件下,萱藻丝状体保存1个月后的存活率仍在50%以上。研究证明,在适宜条件下,液体保存法和胶囊化低温保存法均可实现萱藻丝状体的种质保存。     

抗生素对共培养的萱藻丝状体和膨胀色球藻生长的影响

为抑制萱藻丝状体扩增过程中出现的膨胀色球藻的生长,采用实验生态学方法,研究了链霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、庆大霉素和氯霉素等5种常用抗生素对共培养条件下的萱藻丝状体和膨胀色球藻生长的影响。结果显示,(1)链霉素浓度为100μg/mL时可以显著抑制膨胀色球藻生长,而不影响萱藻丝状体的生长;(2)氨苄青霉素和庆大霉素对膨胀色球藻产生明显抑制作用的浓度均为100μg/mL,对萱藻丝状体产生抑制作用的浓度分别为100和500μg/mL;(3)10μg/mL卡那霉素可强烈抑制膨胀色球藻生长,而萱藻丝状体没有出现被抑制的现象;(4)氯霉素对膨胀色球藻和萱藻丝状体均有较强的抑制作用,10μg/mL可以对膨胀色球藻的生长产生显著抑制,浓度达到50μg/mL后,萱藻丝状体生长受到抑制。研究表明,链霉素(100μg/mL)、卡那霉素(100μg/mL)和氯霉素(10μg/mL)可以用于降低萱藻种质保存和扩增过程中萱藻丝状体被膨胀色球藻污染的风险。     

萱藻丝状体对无机碳的利用

应用pH漂移技术和pH电极法并结合相关抑制剂对萱藻丝状体无机碳的利用进行了研究,并探索了不同浓度CO_2对萱藻丝状体碳酸酐酶(CA)的影响。结果显示,(1)萱藻丝状体pH补偿点为9.21,CO_2补偿点为0.74μmol/L。抑制剂乙酰唑胺(AZ,acetazolamide)对萱藻丝状体pH补偿点无显著影响,作用的前3个小时对无机碳的利用量无抑制作用。抑制剂乙氧苯丙噻唑磺胺(EZ,ethoxyzolamide)和钒酸盐(Van)使萱藻丝状体的pH补偿点均下降到8.82,2种抑制剂作用的前3个小时对无机碳利用量的抑制率分别为55.93%和56.72%。自然条件下萱藻丝状体以游离CO_2和HCO_3~-作为无机碳源,且HCO_3~-的利用依赖于ATP酶和胞内CA。(2)0.35%、0.70%和1.20%的CO_2使萱藻丝状体胞内CA活性分别降低6.29%、17.44%和27.15%,CO_2浓度越高对萱藻丝状体胞内CA活性抑制作用越强。     

四种抗生素对共培养的萱藻丝状体和膨胀色球藻的影响

为抑制或消除萱藻丝状体扩增阶段出现的膨胀色球藻,本研究探讨了头孢噻肟钠、阿莫西林、四环素和红霉素4种抗生素对共培养的萱藻丝状体和膨胀色球藻产生的影响。结果显示,浓度为50和100 mg/L的头孢噻肟钠均显著抑制膨胀色球藻的生长,进而保证萱藻丝状体正常生长与发育;浓度为50~1 000 mg/L的阿莫西林对膨胀色球藻和萱藻丝状体均无抑制作用,阿莫西林不适于去除共培养体系中的膨胀色球藻;浓度为100和200 mg/L的四环素对膨胀色球藻有显著的抑制作用,但此浓度下萱藻丝状体细胞质萎缩,生长状况较差;浓度为0.10~1.00 mg/L的红霉素对膨胀色球藻的生长均有显著的抑制作用,但当其浓度超过0.50 mg/L时,萱藻丝状体的生长亦受到抑制,甚至死亡。     

二氧化锗对共培养萱藻丝状体和硅藻生长的影响

为抑制萱藻丝状体保存和扩增过程中出现的小伪菱形藻与碎片菱形藻的生长,本实验应用实验生态学方法,分别建立了丝状体与小伪菱形藻、丝状体与碎片菱形藻、丝状体与小伪菱形藻和碎片菱形藻的共培养体系,研究了1.00～4.00μg/mL二氧化锗(GeO_2)对共培养条件下丝状体生长发育及附生硅藻生长的影响。结果显示:(1)处理萱藻丝状体和硅藻共培养体系的适宜GeO_2浓度为1.00～2.50μg/mL,各实验组14 d的硅藻抑制率均高于67.33%±5.18%,且丝状体生长发育良好,2.00μg/mL为最适浓度,此浓度下丝状体日均增长率最高,在各培养体系中均大于11.00%,且诱导后孢子囊枝比例和孢子囊直径分别为57.47%±5.31%和(24.55±1.01)μm,与对照组差异不显著;(2) 3.50和4.00μg/mL GeO_2虽对硅藻抑制效果更佳,但同时也会抑制丝状体生长和后期孢子囊的形成与发育,其中4.00μg/mL GeO_2可导致丝状体死亡;(3)碎片菱形藻较小伪菱形藻对GeO_2更敏感。实验14 d,各浓度GeO_2对碎片菱形藻的抑制率为(82.10%±2.40%)～(96.35%±0.79%),均高于同浓度GeO_2对小伪菱形藻的抑制率;同时在丝状体与小伪菱形藻和碎片菱形藻的共培养体系中,碎片菱形藻占硅藻比例随GeO_2浓度升高而相应下降。     

光照对中国南北方萱藻丝状体生长发育影响的比较

通过分离、培养我国北方海域(烟台、青岛)和南方海域(舟山、温州)的萱藻丝状体,比较研究了不同光强[7.2、21.6、36.0、50.4、64.8、86.4、108.0和129.6μmol/(m2·s)]和不同光周期(8L:16D、10L:14D、12L:12D、14L:10D和16L:8D)对我国南北方萱藻丝状体生长及发育的影响。结果表明:(1)过高[≥108.0μmol/(m2·s)]或过低[≤21.6μmol/(m2·s)]光强条件均不利于我国南北方萱藻丝状体的快速生长;(2)我国南北方萱藻丝状体生长的最适光强条件相同,在64.8μmol/(m2·s)条件下培养20 d后,其丝状体的增重倍比和日均增长率均达到最大值;(3)我国南北方萱藻丝状体发育的最适光强条件均为36.0μmol/(m2·s),培养20 d后,烟台、青岛、舟山和温州的萱藻丝状体的孢子囊枝比例均达到最大值,分别为34.72%±0.91%、35.06%±1.17%、35.37%±0.59%和34.33%±0.41%;(4)我国南北方萱藻丝状体生长的最适光周期条件不同,培养20 d后,北方萱藻丝状体的增重倍比和日均增长率均在14L:10D条件下达到最大值,分别为82.75%±2.39%、3.00%±0.36%和81.28%±4.53%、3.04%±0.49%,而南方均在16L:8D条件下达到最大值,分别为89.52%±0.88%、3.18%±0.30%和88.66%±7.09%、3.22%±0.26%;(5)经过20 d的培养观察,我国北方萱藻丝状体发育的适宜光周期范围为8L:16D~10L:14D,而南方的适宜光周期范围为10L:14D~12L:12D。     

萱藻生活史中盘状体阶段生长特性

于2006年3-5月在大连沿海萱藻[Scytosiphon lomentaria(Lyngbye)Link]的繁殖期内,采集具有多室配子囊的成熟萱藻,采用阴干刺激方法获得配子并在室内培育形成盘状体.观察结果显示,在20℃和15℃下,盘状体表面细胞生长出丝状体和叶状体.叶状体经生长后沿藻体纵轴裂开又形成了丝状体.丝状体上与基质接触的细胞进行放射状分裂形成盘状体,未与基质接触的细胞在继续分裂增加藻体长度的同时,在丝状体上形成了许多节状细胞团,节状细胞团与基质接触后向周边分裂又形成了盘状体.由丝状体形成的盘状体在15℃和10℃下培养2个月后形成了单室孢子囊.单室孢子囊成熟后经阴干刺激可放出游孢子,游孢子附着后萌发为直立管状萱藻幼苗.实验结果表明,在萱藻生活史中的盘状体阶段还存在盘状体→丝状体→盘状体与盘状体→叶状体→丝状体→盘状体2个循环.盘状体阶段这2个循环的存在,改变了从配子或合子获得盘状体的单一途径.利用丝状体游离培养生长速度快以及节状细胞团切碎后能在短时间内形成盘状体的特性,在室内进行人工增殖丝状体,当节状细胞团出现后将丝状体切碎,可以获得大量盘状体,通过室内培养使盘状体形成孢子囊并放出孢子,经孢子采苗后在室内培育出萱藻幼苗.本研究旨在为萱藻人工育苗探索一条新路.     

坛紫菜自由丝状体的扩增与保存

自由丝状体是紫菜生活史中的一个重要阶段.对坛紫菜自由丝状体的扩增和保存技术进行了阐述.     

坛紫菜自由丝状体响应琼胶寡糖的激发

为了研究琼胶寡糖对坛紫菜自由丝状体藻丝生长和壳孢子囊枝形成的激发的影响,实验采用琼胶寡糖激发坛紫菜自由丝状体,以液相氧电极检测坛紫菜丝状体净光合放氧速率的变化;以对羟基苯乙酸(POHPAA)化学发光法检测坛紫菜丝状体的H_2O_2释放量;利用LC-MS检测红藻糖苷含量变化;利用实时定量PCR技术检测坛紫菜丝状体H_2O_2产生相关基因(Phrboh、Ph SOD)和红藻糖苷合成相关基因(Phnho1、Phgpdh、Phtps)的表达情况;并利用显微镜观察法检测壳孢子囊枝数量的变化。结果发现,琼胶寡糖能够激发坛紫菜自由丝状体的系列响应,表现在净光合放氧速率以及光合同化产物红藻糖苷的含量和生物合成出现增加;H_2O_2释放量持续增加,与产生H_2O_2相关的2个酶基因Phrboh和Ph SOD的表达增强。此外,琼胶寡糖也能够促进在坛紫菜自由丝状体的发育,在培养第30天时,琼胶寡糖处理组的壳孢子囊枝形成率达到59%,显著高于对照组46%。综上所述,琼胶寡糖能够增加坛紫菜自由丝状体的光合速率和光合同化产物,并通过形成H_2O_2的酶的表达来诱导活性氧的释放;琼胶寡糖还能促进坛紫菜自由丝状体的繁殖发育。     

养殖水电化学同步脱氮响应面优化与验证

本研究先通过单因子实验分析了电流密度、极板面积比、极板间距和初始pH对总氨氮(TAN)和硝态氮(NO3–-N)去除率的影响。采用Design-Expert软件中Box-Behnken的中心组合原则设计四因素三水平响应面实验,考察不同影响因子对脱氮效率的影响,并建立响应面模型优化反应条件,最后对优化的反应条件进行验证。结果显示,电流密度、极板面积比、极板间距和初始pH的变化对TAN去除影响不大,在所选反应条件下,TAN去除率均高于80%,但反应条件的改变显著影响硝酸盐(NO3?)的去除,NO3?去除率在29.8%~80.9%范围内变化。响应面模型的回归系数R2为0.9340,校正系数R2为0.8681,说明该模型具有较好的准确性。NO3?去除最优反应条件：电流密度为25.6 mA/cm2,阴阳极板面积比为1.6∶1,极板间距为2.5 cm,初始pH为6.6,对该反应条件下的脱氮效果展开实验验证发现,TAN去除率为87.3%,NO3?去除率为81.5%。研究表明,电化学处理可实现对TAN和NO3–-N的同步去除,同时,响应面模型的运用有助于优化电化学法在养殖水处理中的脱氮效率。     

响应面法优化鲅鱼抗氧化肽发酵条件

为减少加工废弃物蛋白所造成的环境污染,提高水产品的利用率,探索了回收利用鲅鱼(Spanish mackerel)加工后富含蛋白质的废弃物,以寻找制备鲅鱼抗氧化肽的最佳生产条件。借助Design-Expert数据处理软件对苏云金芽孢杆菌Hy-4发酵产抗氧化肽的条件进行优化;在单因素试验的基础上,利用PlackettBurman试验设计法对影响发酵制备鲅鱼抗氧化肽的培养条件进行筛选。确定了影响发酵液总抗氧化活性的3个主要影响因素(P0.5)为发酵温度、培养基初始p H和料液比;在此基础上,利用最陡爬坡实验逼近3个关键因素的最大响应区域,再利用Box-Behnken试验设计及响应面分析法进行回归分析,通过求解回归方程得到产抗氧化肽的最优条件为:发酵时间48 h,发酵温度30℃,培养基初始p H 6.8,接种量2%,料液比1.45 g/50 m L,菌龄24 h。经过验证,发酵液总抗氧化活性达到537.73 U,较优化前提高了57.2%,与回归方程的预测值570.11 U相比,相对误差为5.7%,说明模型能够较好地预测菌株Hy-4发酵产抗氧化肽发酵液的总抗氧化性。     

响应面法优化鱿鱼皮酶解工艺研究

为研究木瓜蛋白酶酶解鱿鱼皮的最佳酶解条件,通过单因素试验研究了酶添加量、酶解时间和酶解温度对鱿鱼皮水解度的影响。结果显示,3个因素对鱿鱼皮水解度均有不同程度的影响。在单因素试验的基础上,以水解度为响应值,酶添加量、酶解时间和酶解温度为自变量,采用Box-Benhnken响应面法设计3因素3水平优化试验,通过响应面分析,建立了二次多项数学模型对酶解条件进行优化,获得木瓜蛋白酶酶解鱿鱼皮的最佳条件:酶添加量4 560 U/g,酶解时间3.2 h和酶解温度50℃。在该条件下木瓜蛋白酶酶解鱿鱼皮的水解度可达15.53%,与模型预测值基本一致。研究表明,通过响应面法获得的数学预测模型能较好地预测木瓜蛋白酶酶解鱿鱼皮的效果,试验结果为鱿鱼加工副产物高值化利用提供了参考。     

响应面法优化爱德华菌口服微球疫苗制备工艺及其特性分析

为优化渔用口服微球疫苗制备工艺,实验以海藻酸钠及爱德华菌灭活疫苗为原材料,采用乳化离子交联法制备爱德华菌口服微球疫苗。通过单因素实验研究海藻酸钠浓度、水油相比例、乳化剂浓度以及乳化时间对微球疫苗包封效率的影响,根据Box-Behnken中心组合实验设计,采用4因素3水平响应面法优化爱德华菌海藻酸钠微球疫苗的制备工艺。结果表明最佳制备工艺条件为海藻酸钠浓度3.5%,水油相比例2.4∶7.6,乳化剂浓度5.4%,乳化时间13 min。研究表明,在最佳工艺条件下制备的爱德华菌口服微球疫苗成球性好,粒径分布均匀,粒径(8.88±1.26)μm,跨距0.38,包封效率96.37%,具有较好抗酸性、肠溶性以及高安全性的特点。