猪miR-23a靶向调控Smad3基因表达的研究

为了确定miR-23a是否靶向调控Smad3基因,试验利用NotⅠ和XhoⅠ酶构建包含Smad3-3′-UTR的野生型(psiCHECKTM-2-W-Smad3-3′-UTR)和突变型双荧光酶报告载体(psiCHECKTM-2-M-Smad3-3′-UTR),并在PK-15细胞中转染miR-23amimics、miR-23ainhibitor及其阴性对照,采用双荧光酶检测试剂盒检测荧光素酶活性,用实时荧光定量PCR和Western blotting法分别检测Smad3基因的mRNA和蛋白表达水平。结果表明,将含Smad3-3′-UTR的野生型和突变型双荧光酶报告载体与miR-23amimic共转染PK-15细胞,野生型报告质粒表达的荧光素酶活性显著低于其阴性对照组(P<0.05);转染miR-23amimics能显著下调Smad3基因mRNA及其蛋白表达水平(P<0.05);而转染miR-23ainhibitor组与miR-23ainhibitor阴性对照组相比,Smad3基因蛋白表达差异不显著(P>0.05)。综合上述结果可知,猪miR-23a可靶向作用于Smad3基因。     

猪miR-23a靶向调控Smad3基因表达的研究

为了确定miR-23a是否靶向调控Smad3基因,试验利用NotⅠ和XhoⅠ酶构建包含Smad3-3′-UTR的野生型(psiCHECKTM-2-W-Smad3-3′-UTR)和突变型双荧光酶报告载体(psiCHECKTM-2-M-Smad3-3′-UTR),并在PK-15细胞中转染miR-23amimics、miR-23ainhibitor及其阴性对照,采用双荧光酶检测试剂盒检测荧光素酶活性,用实时荧光定量PCR和Western blotting法分别检测Smad3基因的mRNA和蛋白表达水平。结果表明,将含Smad3-3′-UTR的野生型和突变型双荧光酶报告载体与miR-23amimic共转染PK-15细胞,野生型报告质粒表达的荧光素酶活性显著低于其阴性对照组(P0.05);转染miR-23amimics能显著下调Smad3基因mRNA及其蛋白表达水平(P0.05);而转染miR-23ainhibitor组与miR-23ainhibitor阴性对照组相比,Smad3基因蛋白表达差异不显著(P0.05)。综合上述结果可知,猪miR-23a可靶向作用于Smad3基因。     

猪E2F3基因3′UTR双荧光素酶报告基因质粒构建及其与miR-10a-5p的靶向验证

为了鉴定miR-10a-5p与猪E2F3基因的靶向关系,试验从生物信息miRNA Base数据库查询miR-10a-5p的相关信息,并运用MEGA 6.0软件分析其保守性,通过Target Scan生物信息学网站预测其潜在的靶基因及结合位点,然后PCR扩增E2F3基因3′非编码区(3′UTR)片段,构建E2F3的野生型(E2F3-3′UTR-wt)和突变型(E2F3-3′UTR-mut)双荧光素酶报告基因质粒,并分别与miR-10a-5p mimics、mimics NC共转染至293T细胞中,检测双荧光素酶活性变化。结果表明:miR-10a-5p在7个物种间具有高度保守性,成熟序列均为UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGU;Target Scan生物信息学网站预测到miR-10a-5p具有包括E2F3基因在内的共241个潜在的靶基因;E2F3基因片段经PCR扩增获得大小约1 288 bp的清晰条带,测序结果与预期一致;转染miR-10a-5p mimics能显著降低猪E2F3基因野生型质粒双荧光素酶活性(P0.05)。说明猪E2F3基因3′UTR双荧光素酶报告基因质粒构建成功,且其与miR-10a-5p之间存在靶向关系。     

猪miR-135a-5p预测靶基因APC的鉴定

本研究旨在鉴定猪miR-135a-5p靶向脂肪发育的相关基因。首先,利用生物信息学软件分析发现,结肠腺瘤性息肉病(APC)基因的3′非翻译区(3′UTR)具有两个与猪miR-135a-5p结合的潜在位点。其次,构建APC基因野生型(APC3′UTR)和突变型(APC3′UTR m1、APC3′UTR m2、APC3′UTR m3)3′UTR双荧光素酶载体,并分别将其与miR-135a-5p mimics、阴性对照(NC)共转染PK-15细胞后检测荧光活性。结果显示:miR-135a-5p mimics显著降低APC3′UTR和APC3′UTR m2载体的荧光活性(P0.05),而APC3′UTR m1和APC3′UTR m3载体的荧光活性得到完全恢复,表明miR-135a-5p主要结合在预测的第一个位点。进一步的分析表明,miR-135a-5p抑制猪前体脂肪细胞内源APC基因的mRNA和蛋白质表达水平。研究结果证实,猪miR-135a-5p靶向APC基因,且调控其表达。本试验为深入研究猪miR-135a-5p的生物学功能及其调控脂肪形成的作用机制提供了基础。     

牛GHR基因与miR-139靶向关系的验证

旨在构建牛生长激素受体(Growth hormone receptor,GHR)基因3′非翻译区(Untranslated region,UTR)双荧光素酶载体,并确定miR-139与牛GHR基因的靶向关系。本研究采用生物信息学方法预测miR-139与牛GHR基因3′UTR的结合位点;人工合成牛GHR基因3′UTR及突变型片段并克隆至双荧光素酶载体psiCHECK-2上,构建野生型(psiCHECK2-GHR-W 3′UTR)及突变型(psiCHECK2-GHR-M 3′UTR)双荧光素酶报告质粒。将培养的Hela细胞分为4组,分别共转染miR-139mimic或阴性对照和psiCHECK2-GHR-W 3′UTR重组质粒或psiCHECK2-GHR-M 3′UTR重组质粒,然后用双荧光素酶检测试剂盒检测4组细胞中荧光素酶活性。之后培养奶牛乳腺上皮细胞,分别设对照组、阴性对照组、miR-139 mimic及miR-139inhibitor组,对阴性对照组、miR-139mimic组及miR-139inhibitor组分别转染阴性对照、miR-139mimic或miR-139inhibitor,利用qPCR(Realtime quantitative PCR)进一步检测各组miR-139及GHR基因的mRNA表达。结果,通过双酶切试验证实成功构建了野生型及突变型重组双荧光素酶报告质粒psiCHECK2-GHR-W 3′UTR和psiCHECK2-GHR-M 3′UTR;当野生型重组质粒psiCHECK2-GHR-W 3′UTR和miR-139mimic共转染Hela细胞后,双荧光素酶报告质粒表达的荧光素酶活性显著低于其他处理组(P0.05)。qPCR进一步证实miR-139能显著下调奶牛乳腺上皮细胞中GHR基因mRNA的表达(P0.05)。本研究成功构建了牛野生型及突变型GHR基因3′UTR双荧光素酶报告质粒;双荧光素酶试验及qPCR证实miR-139与牛GHR基因3′UTR存在靶向关系。     

猪ITGB1与mi R-181a靶向关系的验证

实验旨在探讨猪miR-181a与整合素β1(ITGB1)基因mRNA的靶向关系。通过生物信息学预测miR-181a与ITGB1-3'UTR的结合位点,人工合成猪ITGB1-3'UTR及突变型片段连接到双荧光素酶载体(psiCHECK-2)上,构建野生型(psiCHECK-2-W-ITGB1-3'-UTR)和突变型(psiCHECK-2-M-ITGB1-3'-UTR)双荧光酶报告载体。培养PK15细胞分别转染miR-181amimics、negativecontrol和psiCHECK-2-WITGB1-3'-UTR、psiCHECK-2-M-ITGB1-3'-UTR,用双荧光酶检测试剂盒检测荧光素酶活性,qRT-PCR检测ITGB1基因mRNA表达水平,Western blot检测ITGB1蛋白表达水平。将含psiCHECK-2-W-ITGB1-3'-UTR、psiCHECK-2-M-ITGB1-3'-UTR分别与miR-181amimic共转染PK-15细胞。结果表明:psiCHECK-2-W-ITGB1-3'-UTR组的荧光素酶活性极显著低于其阴性对照组(P0.01);转染miR-181a mimics能极显著下调ITGB1基因mRNA的表达量(P0.01),显著下调ITGB1蛋白表达量(P0.05),而转染miR-181a Inhibitor组和Inhibitor-NC组相比,ITGB1基因mRNA和蛋白表达量差异均不显著(P0.05)。本研究成功构建了猪野生型及突变型ITGB1-3'-UTR双荧光素酶报告质粒,并证实miR-181a与猪ITGB1-3'-UTR存在靶向关系。     

猪VEGFA 3′UTR生物信息学分析及其与miR-361-5p的靶向验证

为了扩增并分析猪卵泡颗粒细胞中血管内皮生长因子A(VEGFA)基因3编码区(3′UTR)序列、构建VEGFA 3′UTR荧光素酶报告质粒以及利用双荧光素酶报告基因验证miR-361-5p与VEGFA 3′UTR的靶向关系,试验通过RT-PCR扩增VEGFA 3′UTR,并用生物信息学方法分析预测其保守性及潜在的互作miRNA,最后将扩增的VEGFA 3′UTR序列克隆至荧光素酶报告载体中,与miR-361-5p mimics(试验组)或NC mimics(对照组)共同转染293细胞,通过双荧光素酶报告系统检测两组细胞的荧光素酶活性,从而鉴定miR-361-5p与VEGFA 3′UTR的靶向关系。结果表明:在猪卵泡颗粒细胞中成功扩增了VEGFA基因3′UTR序列,其在哺乳动物中保守性较高,有多个潜在miRNA结合位点;成功构建了VEGFA基因3′UTR荧光素酶报告质粒,证明了miR-361-5p可以直接作用于VEGFA基因3′UTR,抑制其荧光素酶活性。     

miR-145a-3p通过靶向ATG14调控布鲁氏菌诱导的RAW264.7自噬

【目的】探究miR-145a-3p对布鲁氏菌诱导的巨噬细胞(RAW264.7)自噬及其对布鲁氏菌胞内生存的影响。【方法】首先合成自噬相关miRNA miR-145a-3p的模拟物(miR-145a-3p mimics)和抑制剂(miR-145a-3p inhibitor)及对照模拟物(NC mimics),转染至GFP-RFP-RAW264.7细胞中,然后用布鲁氏菌侵染该细胞24 h,通过激光共聚焦显微镜观察miR-145a-3p对自噬的影响;运用TargetScan、miRBase等生物信息学软件预测miR-145a-3p的靶蛋白;通过构建PmirGLO-ATG14-3′UTR和PmirGLO-ATG14-3′UTR-mutation重组质粒,用SacⅠ和KpnⅠ进行双酶切鉴定,并利用双荧光素酶报告系统验证miR-145a-3p与自噬相关基因(autophagy-related gene 14,ATG14)的靶向关系;将RAW264.7细胞培养至60%汇合时,分别转染miR-145a-3p mimics、miR-145a-3p inhibitor和NC mimics,转染7 h后用布...     

肉牛DKK3基因3'UTR双荧光素酶报告质粒构建及与miR-25的靶向验证

实验旨在鉴定miR-25与肉牛DKK3基因之间的靶向关系，为开展miR-25调控肉牛肌内脂肪生成的分子机制研究奠定基础。利用生物信息学分析软件TargetScan预测miR-25的潜在靶基因及结合位点，然后PCR扩增包含miR-25结合位点的肉牛DKK3基因3’非编码区（3’UTR）片段，构建DKK33’UTR野生型、突变型及删除型双荧光素酶报告基因质粒，并分别与miR-25 mimics和mimics NC共转染牛肾细胞（MDBK），检测双荧光素酶活性；此外，miR-25 mimics、mimics NC、miR-25 inhibitor、inhibitor NC分别转染MDBK细胞，荧光定量PCR和Western blot检测DKK3表达量。结果表明：TargetScan软件预测到miR-25具有包括DKK3在内的共944个潜在靶基因，且与DKK3结合的靶位点位于DKK3基因3’UTR的25～32 bp处；构建的3种质粒经双酶切后释放出大小约321 bp的条带，测序结果与预期一致，表明质粒构建成功；miR-25mimics可显著降低DKK3野生型质粒的双荧光素酶活性；过表达miR-...     

KLF3基因3′-UTR区双荧光素酶报告载体及其突变载体的构建与活性鉴定

试验旨在构建锌指蛋白3(KLF3)基因3′-UTR区双荧光素酶基因报告载体及其突变载体,初步分析可能调控KLF3基因表达的miRNAs。首先通过PCR方法扩增KLF3基因的3′-UTR序列,将其克隆到经XhoⅠ、NotⅠ双酶切的双荧光素酶报告载体中;运用Targetscan软件预测可能与KLF3基因3′-UTR相互作用的miRNA;使用脂质体2000转染试剂将miRNAs mimics与构建好的KLF3基因3′-UTR段双荧光素酶报告载体或突变载体共转染于常规培养的293T细胞中,检测荧光素酶活性。结果表明,KLF3基因3′-UTR可能是miR-21的作用靶位点;双荧光报告显示,miR-21 mimics组(0.6900±0.0144)比突变组(1.000±0.0688)和空白对照组(1.000±0.0159)KLF3基因3′-UTR双荧光素酶基因报告载体和突变载体的活性降低了31%(P0.01)。本试验成功构建了含有KLF3基因3′-UTR段双荧光素酶基因报告载体与突变载体,初步证实miR-21对KLF3基因有调控作用。     

β-miR-33a特异调控HADHB基因3′UTR靶标位点验证

为验证β-miR-33a与候选基因HADHB3′UTR是否存在特异性识别的靶标关系,本试验将β-miR-33amimics、β-miR-33ainhibitor及NC质粒分别转染至奶牛乳腺上皮细胞,通过Real-time(qPCR)验证β-miR-33a与HADHB基因mRNA水平表达量的关系。利用PCR获得奶牛HADHB3′UTR 201bp DNA片段,将其克隆到pmiR-RB-REPORTTM双荧光素酶报告载体中,获得野生型载体,利用定点突变技术将HADHB3′UTR种子区-CAATGCA定点突变-CATGTAGC,获得突变型载体。将野生型载体和突变型载体分别与β-miR-33a-mimics组成双荧光素酶报告系统,转染至奶牛乳腺上皮细胞,48h后测定其荧光活性。结果显示,奶牛乳腺上皮细胞中转染的野生型与突变型载体的双荧光活性存在显著性差异(P<0.05),由此证明,在奶牛乳腺上皮细胞中β-miR-33a可以与HADHB3′UTR的靶位点-CAATGCA特异性结合。     

牦牛Smad 4基因3′UTR区双荧光素酶载体构建及与bta-miR-146a的靶向验证

旨在鉴定牦牛Smad4基因与bta-miR-146a的靶向关系,为探究它们在牦牛卵巢卵泡发育过程中的可能分子调控机制提供理论基础。利用miRBase数据库和MEGA 6.0软件分析miR-146a在不同物种中的保守性,同时利用TargetScan软件预测其潜在靶基因,通过构建psiCHECK2双荧光素酶报告基因载体进行靶向验证。生物信息学分析结果显示,miR-146a成熟序列在脊椎动物中具有高度的保守性,并预测到178个与卵巢卵泡发育相关的潜在靶基因,从中选取Smad4基因分析发现其3′非编码区域(3′UTR)与bta-miR-146a存在结合位点;进一步成功构建牦牛Smad4基因3′UTR野生型及突变型psiCHECK2双荧光素酶报告质粒,荧光素酶活性检测结果显示,bta-miR-146amimic对牦牛Smad4基因3′UTR野生型报告质粒荧光活性有明显的下调作用,分别与突变型及NC对照组差异显著(P0.05)。本研究初步证实,牦牛Smad4基因是bta-miR-146a的靶基因,从而提示btamiR-146a可能通过调控Smad4基因在牦牛卵巢卵泡发育过程中的表达发挥作用。     

miR-132-3p靶向UCP2调节绵羊前体脂肪细胞分化的研究

旨在研究miR-132-3p对绵羊前体脂肪细胞中UCP2基因的表达调控机制。本研究以绵羊皮下脂肪细胞为研究对象,检测miR-132-3p与UCP2在绵羊前体脂肪细胞中的作用机制;利用生物信息学软件预测miR-132-3p与UCP2的结合位点,并通过双荧光素酶报告试验验证miR-132-3p与UCP2的靶标关系;在绵羊前体脂肪细胞中过表达miR-132-3p,用RT-qPCR、Western blotting技术检测过表达后UCP2mRNA和蛋白的表达水平;最后,采用RT-qPCR检测绵羊前体脂肪细胞分化过程中UCP2和miR-132-3p的表达。结果表明,miR-132-3p在UCP2 3′-UTR上存在结合位点,并显著下调UCP2 3′-UTR重组双荧光质粒的相对荧光活性(P0.05);过表达miR-132-3p显著下调UCP2mRNA的表达(P0.05),且明显降低UCP2蛋白的表达量;绵羊前体脂肪细胞分化中期miR-132-3p与UCP2的表达存在负相关关系。综上表明,miR-132-3p通过特异性结合UCP2 3′-UTR抑制UCP2在mRNA和蛋白水平的表达,在一定程度上促进绵羊前体脂肪细胞的分化。     

MiR-106a-5p靶向E2F3和SP-1抑制C2C12细胞成肌分化的研究

为探究miR-106a-5p对成肌分化的作用及潜在调控靶点,在线预测miR-106a-5p潜在靶基因,通过RT-qPCR及Western blot检测miR-106a-5p对靶基因的调控作用,利用双荧光素酶报告系统验证miR-106a-5p与靶基因之间的互作,并以C2C12细胞系为实验模型,采用过表达技术,在细胞形态学水平初步探索其对成肌分化的作用。在线预测发现E2F3和SP-1可能是miR-106a-5p的潜在靶基因;RT-qPCR分析表明,miR-106a-5p与E2F3和SP-1的表达模式相反;Western blots结果发现,miR-106a-5p抑制E2F3和SP-1蛋白翻译;双荧光素酶报告载体系统表明,E2F3和SP-1是miR-106a-5p调控成肌分化的靶基因;此外,超表达miR-106a-5p抑制C2C12细胞分化,肌管数目显著减少。结果表明,E2F3和SP-1是miR-106a-5p抑制C2C12细胞成肌分化的靶基因。     

细毛羊皮肤毛囊miR-1298-5p的靶基因预测及验证

为探讨miR-1298-5p及其靶基因与细毛羊毛囊生长发育的关系,本实验以乾华肉用美利奴羊不同发育时期皮肤毛囊组织为材料,通过生物信息学方法预测miR-1298-5p的靶基因,采用RT-PCR和Western Blot对miR-1298-5p及其靶基因进行定量检测;扩增靶基因3'UTR区,构建野生型和突变型靶基因表达载体后与miR-1298-5p mimics共同转染到HEK293T/17细胞中,利用双荧光素酶报告基因实验验证miR-1298-5p与靶基因的靶向关系。结果表明:FGF_2基因3'UTR区含有miR-1298-5p结合位点,FGF_2为miR-1298-5p潜在靶基因,通过核酸水平和蛋白水平定量表达规律发现miR-1298-5p与靶基因FGF_2呈负相关,初步确定FGF_2为miR-1298-5p的靶基因。双荧光素酶报告基因实验显示,miR-1298-5p mimics能够抑制野生型FGF_2的靶位点报告载体的荧光素酶活性;但当靶基因结合位点突变后,FGF_2被抑制的荧光素酶活性能够得到恢复。综上,miR-1298-5p与FGF_2有靶向关系,miR-1298-5p能通过负调控FGF_2的表达调控羊毛囊发育。     

猪microRNA-206新靶基因G6PD的鉴定及表达模式分析

利用生物信息学软件Targetscan预测miR-206的靶基因,并获得6个与肌纤维类型相关的候选靶基因。分析miR-206与其中一个候选靶基因G6PD的结合位点及最小自由能,将miR-206与G6PD野生型和突变型G6PD双荧光素酶报告载体共转染至293T细胞,利用双荧光素酶报告基因系统证实miR-206与G6PD的靶标关系;采用qRT-PCR分别检测miR-206和G6PD在猪不同组织、不同肌纤维类型的肌肉以及高低组肌内脂肪含量样品中的表达水平。结果显示,猪miR-206与G6PD的3′UTR存在3个结合位点;双荧光素酶报告基因系统分析结果显示,过表达miR-206能显著降低野生型G6PD质粒的荧光活性,共转染miR-206后,突变质粒M1、M2、M4的双荧光素酶活性显著高于野生型G6PD质粒(P0.05),而突变质粒M3与野生型G6PD质粒无显著差异(P0.05);猪miR-206在骨骼肌组织中特异性表达,且在快肌中表达量显著高于慢肌(P0.05)。G6PD在脂肪组织中的表达普遍高于其他组织,除心肌外,G6PD在骨骼肌中的表达量最低,但其在快肌和慢肌中的表达量无显著差异(P 0.05)。miR-206和G6PD在高低组肌内脂肪含量样品的表达量均无显著差异(P0.05)。结果表明,猪miR-206通过前2个结合位点靶向调控G6PD,但G6PD不能影响猪骨骼肌肌纤维类型的转化与肌内脂肪沉积,其功能以及miR-206调控肌纤维的机制仍需进一步探究。     

miR-145-4调控蛋鸭卵泡发育机制的研究

【目的】本研究旨在揭示miR-145-4在蛋鸭卵泡发育中的作用及调控机制。【方法】分离培养蛋鸭卵泡颗粒细胞,转染miR-145-4相似物(mimic)、抑制物(inhibitor)后,利用实时荧光定量PCR法检测细胞增殖凋亡相关基因的表达情况,采用RNAhybrid和Targetscan程序预测miR-145-4的靶基因及其与靶基因磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚单位α(phosphatidylinositol-3-kinase catalytic subunitα,PIK3CA)3′-UTR的结合位点,分别构建PIK3CA基因3′-UTR的野生型和突变型双荧光素酶载体,与miR-145-4 mimic和mimic-NC共转染蛋鸭卵泡颗粒细胞后,采用双荧光素酶报告系统验证miR-145-4与靶基因PIK3CA的结合关系,最后采用实时荧光定量PCR法检测miR-145-4对蛋鸭卵泡颗粒细胞中PIK3CA基因表达的影响。【结果】实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,过表达miR-145-4后CyclinB2基因的表达量极显著降低(P<0.01),BCL2基因的表达量极显著增加(P<...     

miR-137-3p靶向MAX基因对前脂肪细胞3T3-L1成脂分化的影响

【目的】研究miR-137-3p在前脂肪细胞(3T3-L1)分化过程中的功能及作用机制。【方法】收集诱导分化第0、2、4、6和8天的3T3-L1细胞,利用实时荧光定量PCR检测miR-137-3p相对表达量;将miR-137-3p的模拟物(mimics)、抑制物(inhibitor)和阴性对照(NC)分别转染3T3-L1细胞并诱导成脂分化,油红O染色观察脂滴形成情况,利用实时荧光定量PCR检测成脂标志基因CAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)、C/EBPβ、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和脂肪酸结合蛋白4(FABP4)相对表达量,用Western blotting检测C/EBPβ、PPARγ和FABP4蛋白表达水平;利用TargetScan在线网站预测miR-137-3p的靶基因,比对候选靶基因3′-UTR区与miR-137-3p结合位点在不同物种间的序列保守性。分别将miR-137-3p mimics、NC与3′-UTR-WT和3′-UTR-Mut载体共转染HEK293T细胞,利用双荧光素酶报告试验检测miR-137-3p与MYC相关因子X(MAX)基因的靶向关系。将s...     

miR-148a-3p靶向PPARγ基因抑制鹅颗粒细胞孕酮的合成

旨在探究miR-148a-3p是否通过靶基因PPARγ调节鹅卵泡颗粒细胞中类固醇激素的合成。本研究选用12只健康的处于产蛋高峰期的天府肉鹅母系母鹅分别用于组织样品采集和颗粒细胞培养。利用qPCR检测miR-148a-3p在鹅不同阶段卵泡颗粒层中的表达;通过MEGA 7软件分析miR-148a-3p在不同物种的保守性,预测miR-148a-3p的靶基因,采用双荧光素酶报告试验验证miR-148a-3p与靶基因的靶标关系;在鹅颗粒细胞中转染miR-148a-3p mimics和inhibitor,qPCR检测miR-148a-3p对靶基因及其下游基因表达水平的影响;同时利用ELISA技术检测激素含量的变化。结果表明,miR-148a-3p在不同物种中高度保守;在鹅卵泡发育过程中,miR-148a-3p的表达量随卵泡直径的增加呈先升高后下降的趋势。在鹅卵泡颗粒细胞体外培养过程中,miR-148a-3p mimics能显著下调3β-HSD的表达（P<0.05）,抑制孕酮的合成（P<0.05）;而miR-148a-3p inhibitor的作用则相反（P<0.05）。生物信息学分析和双荧光素酶报告试验证实,PPARγ为miR-148a-3p的靶基因。在颗粒细胞中,miR-148a-3p mimics能显著降低PPARγ的表达（P<0.05）,而miR-148a-3p inhibitor能显著上调PPARγ的表达（P<0.05）。当干扰PPARγ后,3β-HSD的表达量显著降低（P<0.05）,孕酮的含量也降低。这些结果表明,在鹅等级卵泡颗粒细胞中,miR-148a-3p可靶向结合PPARγ来抑制3β-HSD的表达,从而降低颗粒细胞孕酮的合成。     

miR-141-3P和miR-346在对靶基因FSHR的识别与验证

为探索miRNA-141-3P和miRNA-346在大鼠腺垂体中的靶基因,并对其进行识别与验证。本研究利用PCR方法,根据Fshr(Rattus)3′UTR野生型载体序列信息设计突变引物将靶序列CAGTGTT(78-85)突变为GTCACAA和GGCAGAC(127-133)突变为CCGTCTG,以野生型载体为模板PCR扩增Fshr基因的3′UTR突变序列,将其克隆到pmiR-RB-REPORTTM双荧光素酶报告载体中。由于miRNA是通过3′UTR区作用于靶基因,因此将miRNA与构建好的报告基因载体共转,通过报告基因相对荧光值的下调来印证miRNA与靶基因的相互作用。双荧光素酶报告基因表达分析显示,rno-miR-141-3p mimic对Fshr野生型载体的报告荧光没有明显下调作用;rnomiR-346mimic对Fshr野生型载体的报告荧光有明显下调作用,相应结合位点突变后,突变型载体中的报告荧光与野生型相比有所恢复;rno-miR-141-3p mimic和rno-miR-346mimic同时处理,对野生型载体的报告荧光有一定的下调作用。在体外,rno-miR-141-3p可能不能通过Fshr上相应的3UTR位点调控报告基因的表达;rno-miR-346有可能通过Fshr上相应的3′UTR位点调控报告基因的表达。本试验为FSHR的转录后调控研究提供了理论依据。